白细胞介素-22对转化生长因子β1诱导的大鼠肝细胞上皮-间质转化的调控作用

目的研究白细胞介素-22(IL-22)对转化生长因子β1(TGF-β1)诱导的大鼠肝细胞上皮-间质转化(EMT)的调控作用。方法将大鼠正常肝细胞BRL-3A细胞分为空白对照组、模型对照组和梯度浓度的重组IL-22(1、10、50 ng/ml)干预组,除空白对照组外,各组均给予2 ng/ml的TGF-β1进行刺激,培养48 h,实时荧光定量PCR检测细胞E-钙黏蛋白(E-cadherin)、波形蛋白(vimentin)m RNA的表达量;Western blot检测E-cadherin、vimentin蛋白的表达量。结果空白对照组vimentin m RNA和蛋白的相对表达量分别为0.99±0.11、0.67±0.08,E-cadherin m RNA和蛋白的相对表达量分别为0.98±0.08、0.77±0.06;与空白对照组相比,模型对照组vimentin m RNA(1.24±0.02)和蛋白(0.96±0.06)的表达均增强(t值为-3.805和-4.946,均P<0.05),E-cadherin m RNA(0.81±0.06)和蛋白(0.58±0.03)的表达均减弱(t值为2.868和4.890,均P<0.05)。与模型对照组相比,梯度浓度重组IL-22干预组vimentin m RNA(0.97±0.10、0.57±0.03、0.30±0.77)和蛋白(0.86±0.03、0.74±0.02、0.61±0.04)的表达均减弱(F值为115.068和45.057,均P<0.05),E-cadherin m RNA(1.03±0.07、1.31±0.02、1.61±0.09)和蛋白(0.70±0.02、0.80±0.03、0.88±0.03)的表达均增强(F值为81.163和59.197,均P<0.05);梯度浓度的重组IL-22(1、10、50 ng/ml)干预组之间比较,差异均有统计学意义(均P<0.05)。结论 TGF-β1能诱导大鼠肝细胞发生EMT,IL-22能够逆转TGF-β1介导的EMT,且呈剂量依赖性。     

miR-92b在神经胶质瘤裸鼠移植瘤模型中的作用

目的建立U251胶质瘤裸鼠皮下移植瘤模型,观察沉默miR-92b对U251神经胶质瘤裸鼠皮下移植瘤生长的影响。方法采用神经胶质瘤U251细胞株建立神经胶质瘤的裸鼠皮下移植瘤动物模型,将shRNA-miR-92b表达的质粒稳定转染U251细胞,筛选稳转细胞采取多点注射的方法注入裸鼠皮下,以阴性质粒和PBS为阴性对照组(shRNA-miR-92b NC组)和空白对照(PBS组);检测裸鼠成瘤体积和重量;real-time PCR检测移植瘤中miR-92b、胰岛素样生长因子结合蛋白-3(IGFBP-3)的表达水平;western blot检测移植瘤中的IGFBP-3、β-链蛋白(β-catenin)和钙黏蛋白(E-cadherin)蛋白水平;免疫组织化学技术检测移植瘤中IGFBP-3、β-catenin和E-cadherin表达水平。结果移植瘤形成过程中裸鼠未出现死亡,全部裸鼠均皮下成瘤,肿瘤体积检测后发现shRNA-miR-92b转入后显著抑制移植瘤的生长(P0.05);转入shRNA-miR-92b后,移植瘤中的miR-92b表达水平降低,IGFBP-3的表达水平增加(P0.05);western blot结果显示IGFBP-3和E-cadherin蛋白表达升高,β-catenin蛋白表达降低(P0.05);免疫组化结果也显示IGFBP-3蛋白表达升高,β-catenin蛋白表达降低(P0.05)。结论沉默miR-92b表达后可能通过上调IGFBP3、E-cadherin蛋白表达,下调β-catenin蛋白表达,从而抑制神经胶质瘤裸鼠皮下移植瘤的生长。     

miR-326靶向MAPK/MEK信号通路抑制食管鳞状细胞癌恶性生物学行为

目的探讨miR-326靶向MAPK/MEK信号通路对食管鳞状细胞癌细胞增殖、迁移、侵袭和凋亡的影响。方法 20例食管鳞状细胞癌患者,取手术切除食管癌组织和癌旁正常组织,采用实时荧光定量PCR法检测miR-326mRNA和MAPK mRNA相对表达量,采用免疫组织化学法检测MAPK蛋白表达。3种食管癌细胞系(KYSE150、EC9706、TE-9)和人正常食管上皮细胞系Het-1A,采用实时荧光定量PCR法检测细胞miR-326 mRNA和MAPK mRNA相对表达量,Western blot法检测细胞MAPK蛋白相对表达量。将对数生长期EC9706细胞随机分为miR-326组、转染对照组和空白对照组,miR-326组和转染对照组分别转染miR-326 mimic和mimic NC,空白对照组细胞不作任何处理,采用Western blot法检测细胞MAPK、p-MEK、p-ERK1、p-ERK2和p-C-Jun蛋白相对表达量,克隆形成试验检测细胞克隆形成率,划痕试验检测细胞划痕闭合率,Transwell小室试验检测细胞侵袭,流式细胞术检测细胞周期和细胞凋亡,荧光素酶活性检测试剂盒检测细胞荧光素酶活性。结果食管癌组织miR-326 mRNA相对表达量低于癌旁正常组织(P0.05),MAPK mRNA相对表达量高于癌旁正常组织(P0.05)。KYSE150、EC9706和TE-9细胞miR-326 mRNA相对表达量均低于Het-1A细胞(P0.05),MAPK mRNA和MAPK蛋白相对表达量高于Het-1A细胞(P0.05),且EC9706细胞MAPK蛋白相对表达量最高。miR-326组细胞MAPK 3'UTR WT荧光素酶活性(0.53±0.05)明显低于转染对照组(1.22±0.14)(P0.05),MAPK 3'UTR MUT荧光素酶活性(0.86±0.06)与转染对照组(0.91±0.11)比较差异无统计学意义(P0.05)。miR-326组细胞MAPK蛋白相对表达量(0.32±0.15)低于转染对照组(0.88±0.07)和空白对照组(0.91±0.06)(P0.05),细胞克隆形成率[(21.30±0.55)%]、划痕闭合率[(29.47±4.12)%]和侵袭细胞数[(113.86±3.15)个]低于转染对照组[(75.43±0.81)%、(80.52±2.51)%、(427.27±4.25)个]和空白对照组[(79.13±0.65)%、(83.44±1.87)%、(468.10±3.38)个](P0.05),G_0/G_1期细胞比率[(63.15±1.20)%]和细胞凋亡率[(18.54±0.60)%]高于转染对照组[(41.18±0.60)%、(5.28±1.30)%]和空白对照组[(45.11±0.80)%、(4.13±0.90)%],S期和G_2/M期细胞比率及p-MEK、p-ERK1、p-ERK2和p-C-Jun蛋白相对表达量低于转染对照组和空白对照组(P0.05),转染对照组与空白对照组比较差异均无统计学意义(P0.05)。结论 miR-326靶向抑制MAPK/MEK信号通路的激活,影响食管鳞状细胞癌细胞的增殖、迁移、侵袭和凋亡。     

miR-373对人胃癌SGC7901细胞生物学行为的影响

目的探讨miR-373在人胃癌SGC7901细胞中表达情况及其对胃癌细胞增殖、迁移的影响。方法人胃癌SGC7901细胞和正常胃黏膜上皮GES-1细胞采用反转录PCR法检测miR-373相对表达量。人胃癌SGC7901细胞分为miR-373类似物组、miR-373抑制物组和空白对照组,分别转染miR-373 mimic、miR-373 inhibitor和miR-373 NC。转染后24、36、48、72 h,采用MTT法检测3组细胞增殖率,转染后48 h,采用Transwell小室迁移实验检测迁移细胞数。结果胃癌SGC7901细胞miR-373相对表达量(0.39±0.05)明显高于正常胃黏膜上皮GES-1细胞(0.23±0.04)(P0.05);miR-373类似物组细胞miR-373相对表达量(0.78±0.11)明显高于miR-373抑制物组(0.17±0.02)和空白对照组(0.36±0.06)(P0.05),空白对照组高于miR-373抑制物组(P0.05);转染后24 h,3组细胞增殖率比较差异无统计学意义(P0.05),转染后36、48、72 h,miR-373类似物组细胞增殖率明显高于miR-373抑制物组和空白对照组(P0.05),空白对照组高于miR-373抑制物组(P0.05);转染后48 h,相同面积下miR-373类似物组迁移细胞数[(181.28±11.29)个]明显多于miR-373抑制物组[(61.82±8.29)个]和空白对照组[(109.73±8.22)个](P0.05),空白对照组多于miR-373抑制物组(P0.05)。结论 miR-373可能作为癌基因作用于胃癌组织,且能增强胃癌细胞的增殖和迁移能力。     

和厚朴酚通过降低Wnt/β-catenin信号通路活性抑制前列腺癌细胞的上皮-间充质转化过程

目的:检测和厚朴酚对前列腺癌细胞PC3的上皮-间充质转化(epithelial-mesenchymal transition,EMT)过程的影响并探讨其作用机制。方法:将不同浓度的和厚朴酚(0,10,20,40μmol/L)作用于PC3细胞24 h后,通过细胞划痕试验和Transwell小室试验检测和厚朴酚对细胞的迁移和侵袭能力的影响;将不同浓度的和厚朴酚(0,10,20,40μmol/L)作用于PC3细胞48 h后,采用蛋白质印迹法检测和厚朴酚对PC3细胞内E-cadherin,N-cadherin,vimentin及β-catenin蛋白质表达的影响,RT-RCR检测和厚朴酚对细胞β-catenin和MMP-9 mRNA相对表达量的影响。结果:经和厚朴酚作用后的PC3细胞与对照组(和厚朴酚0μmol/L)相比迁移与侵袭能力显著降低,细胞内N-cadherin,vimentin及β-catenin蛋白表达显著下降,E-cadherin蛋白表达显著升高,β-catenin和MMP-9 mRNA相对表达量显著降低,且上述结果呈剂量依赖性。结论:和厚朴酚能抑制PC3细胞的迁移和侵袭,该作用可能是通过抑制Wnt/β-catenin信号通路的活性,从而降低EMT活性而产生的。     

LGR5对宫颈癌细胞上皮间质转化的影响及潜在机制研究

目的探讨富含亮氨酸重复序列的G蛋白偶联受体5(LGR5)对宫颈癌细胞上皮间质转化的影响及潜在机制。方法采用前瞻性研究,以宫颈癌细胞Hela为研究对象,构建过表达和敲低LGR5的细胞株,RT-PCR和Western blot检测LGR5表达。将转染pc DNA3.1-LGR5的Hela细胞作为LGR5组,以转染pc DNA3.1空载体的细胞记为pc DNA3.1组;将转染LGR5 siRNA细胞作为si LGR5组,以转染阴性对照siRNA细胞记为NC组。Western blot分别检测各组细胞中上皮间质标记物钙黏附蛋白E(E-cadherin)、钙黏附蛋白N(N-cadherin)、波形蛋白(vimentin)及Wnt/β-cadherin通路蛋白β链蛋白(β-catenin)和下游蛋白c-Myc、细胞周期蛋白(Cyclin D1)表达变化。Transwell实验检测各组细胞迁移侵袭能力变化。结果 Hela细胞中成功过表达和敲低了LGR5;与pc DNA3.1组相比,Hela细胞转染pc DNA3.1-LGR5后细胞中上皮标志物E-cadherin表达显著降低(P0.05),间质标记物vimentin、N-cadherin表达显著增加(P0.05)。与NC组相比,Hela细胞转染si LGR5后细胞中E-cadherin表达明显增加(P0.05),vimentin、Ncadherin表达明显下降(P0.05)。与pc DNA3.1组相比,Hela细胞过表达LGR5后细胞迁移侵袭能力、Wnt/β-catenin通路蛋白β-catenin及其下游基因c-Myc、Cyclin D1表达均显著增加(P0.05);而Hela细胞沉默LGR5后较NC组细胞迁移侵袭能力、Hela细胞中β-catenin、c-Myc和Cyclin D1表达均明显降低(P0.05)。结论过表达LGR5能够促进宫颈癌细胞Hela上皮间质转化和侵袭迁移,而干扰LGR5则抑制了细胞上皮间质转化和迁移侵袭,其中机制可能与LGR5调控Wnt/β-catenin信号转导有关。     

miR-645调控干扰素诱导蛋白2对肺癌细胞增殖和侵袭的作用及机制

目的探讨miR-645对干扰素诱导蛋白2(interferon inducible protein 2, IFIT2)的表达以及对肺癌细胞增殖、侵袭的影响。方法采用反转录PCR法检测肺癌组织和细胞以及配对的正常组织和细胞中miR-645相对表达量。对数生长期人肺癌细胞H460分为对照组和转染组,分别转染NC mimic和miR-645 mimic,采用CCK-8法检测2组细胞增殖率,采用Transwell小室实验检测2组细胞侵袭率;采用荧光素酶报告基因实验检测2组细胞miR-645和IFIT2的结合活性;采用反转录PCR法检测2组细胞miR-645和IFIT2 mRNA相对表达量。结果肺癌组织(3.25±0.25)和肺癌细胞(2.85±0.22)miR-645相对表达量均高于正常肺组织(1.00±0.12)和正常肺上皮细胞(1.00±0.08)(P<0.05);转染组细胞增殖率[(220±12)%]、细胞侵袭率[(65.6±5.2)%]均高于对照组[(100±8)%、(25.9±3.2)%](P<0.05);转染组野生型3’UTR(WT-IFIT2)相对荧光素酶活性(0.48±0.06)低于对照组(1.00±0.12)(P<0.05),突变型3’UTR(MUT-IFIT2)相对荧光素酶活性(1.12±0.09)与对照组(1.00±0.08)比较差异无统计学意义(P>0.050);转染组细胞IFIT2 mRNA相对表达量(0.32±0.05)低于对照组(1.00±0.10)(P<0.05),miR-645在肺癌细胞中表达水平与IFIT2呈负相关(r=-0.743,P<0.001)。结论 miR-645可促进肺癌细胞H460的增殖和侵袭,其作用机制是通过调控IFIT2的表达而实现。     

活性维生素D_3对大鼠肾小管间质纤维化的影响及其机制研究

目的:观察活性维生素D_3对大鼠肾小管间质纤维化的影响及其可能机制。方法:将40只雄性SD大鼠随机分为4组:假手术组(Sham组)、模型组(UUO组)、UUO+低剂量活性维生素D_3组(LV组)、UUO+大剂量活性维生素D_3组(HV组),每组10只。采用单侧(左)输尿管结扎法建立梗阻性肾小管间质纤维化大鼠模型。Sham组只游离左侧输尿管而不结扎。LV组与HV组分别予以0.03μg/(kg·d)、0.06μg/(kg·d)活性维生素D_3(溶于花生油)腹腔注射,Sham组和UUO组均予以等体积花生油腹腔注射。术后14 d处死大鼠,采集血、肾脏标本,并检测血清钙、磷、肌酐(SCr)、甲状旁腺激素(PTH)。制作肾脏病理组织切片,行H-E、Masson染色,在光镜下观察肾小管间质损伤及纤维化情况。采用免疫组织化学法检测肾小管间质中α平滑肌肌动蛋白(α-SMA)、E钙黏蛋白(E-cadherin)与转化生长因子β(TGF-β)的表达。结果:与UUO组相比,LV组和HV组SCr水平[(39.0±1.83)μmol/L、(36.0±2.11)μmol/L比(43.1±5.55)μmol/L]、肾小管间质纤维化指数(2.00±0.12、1.70±0.10比2.80±0.11)、α-SMA表达(0.22±0.02、0.20±0.03比0.24±0.02)、TGF-β表达(0.26±0.03、0.25±0.03比0.32±0.04)均显著下降(P0.05),E-cadherin表达(0.30±0.08、0.34±0.11比0.22±0.07)明显升高。与LV组相比,HV组SCr水平肾间质纤维化指数、肾间质损伤指数、α-SMA表达、TGF-β表达明显下降(P0.05),E-cadherin表达上升(P0.05)。相关性分析显示,TGF-β、α-SMA表达与肾间质纤维化指数正相关,E-cadherin表达与肾间质纤维化指数负相关;TGF-β表达与α-SMA表达正相关,E-cadherin与TGF-β负相关;α-SMA表达与E-cadherin表达负相关。结论:活性维生素D_3可改善UUO大鼠肾小管间质纤维化,大剂量活性维生素D_3改善作用优于小剂量,其机制可能是:通过抑制TGF-β的过度表达从而抑制UUO大鼠肾小管上皮细胞-肌成纤维细胞转分化进而改善肾小管间质纤维化。     

人胶质瘤组织中miR-125b表达研究

目的:探讨miR-125b在人胶质瘤组织中的表达。方法:选取不同恶性程度胶质瘤手术患者20例为胶质瘤组(Ⅰ级5例、Ⅱ级5例、Ⅲ级5例、Ⅳ级5例),另选择实施脑外伤内减压手术的患者5例为正常对照组。术中取下胶质瘤组胶质瘤组织和正常对照组的正常脑组织,采用荧光定量PCR方法检测miR-125b的表达。结果:正常对照组的miR-125b相对表达量为(0.28±0.12),胶质瘤组Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ级的miR-125b相对表达量分别为(0.43±0.07)、(0.69±0.08)、(0.90±0.05)、(1.12±0.04),差异有统计学意义(P0.05)。肿瘤病理恶性程度越高,生存期越短(P0.05)。结论:miR-125b异常表达可能与胶质瘤的发生和发展密切相关。     

miR-203a-3p 靶向GLS1 调控HCC 细胞增殖、迁移、侵袭的机制研究

目的　探究微小核糖核酸（microRNAs, miRNA, miR）-203a-3p 对肝细胞癌（hepatocellular carcinoma,HCC）细胞增殖、迁移、侵袭的影响及其潜在分子机制。方法　采用实时荧光定量PCR（quantitative real-time PCR,qRTPCR）检测HCC 细胞、人正常肝细胞以及临床HCC 组织中miR-203a-3p 相对表达;采用细胞增殖实验、细胞划痕实验和Transwell 实验分别检测miR-203a-3p 对HCC 细胞增殖、迁移、侵袭的影响;生物信息学网站预测miR-203a-3p 的潜在靶基因（GLS1）,双荧光素酶实验进行验证;探究HCC 细胞对谷氨酰胺的依赖性及抑制谷氨酰胺酶1(glutaminase 1,GLS1) 对HCC 细胞增殖、迁移、侵袭的影响;蛋白免疫印迹（Western blot）实验检测Wnt/β-catenin 信号通路关键蛋白β-catenin,p-GSK-3β 和c-Myc 表达。结果　HCC 癌组织中miR-203a-3p（0.32±0.07）表达明显低于癌旁正常组织（1.02±0.03）,差异有统计学意义（t ＝ 41.105,P ＜ 0.001）;HCC 细胞HepG2（0.34±0.05）,HCCLM3（0.58±0.06）,Huh7（0.43±0.05）,Hep3B（0.29±0.04）中miR-203a-3p 相对表达水平明显低于人正常肝细胞LO2（1.01±0.02）中miR-203a-3p 表达,差异有统计学意义（F ＝ 119.080,P ＜ 0.001）。与Blank 组相比,miR-203a-3p 过表达组HCC细胞增殖（0.61±0.05 vs 1.24±0.06）, 迁移率（21.43%±2.01% vs 60.22%±3.14%） 及侵袭能力（76.54±13.56 vs221.06±16.54）均明显降低,差异有统计学意义（t ＝ 14.849,13.900,10.562,均P ＜ 0.001）。GLS1 是miR-203a-3p的靶基因,miR-203a-3p 靶向负调控GLS1 表达。HCC 细胞中GLS1 高表达呈现高酶活性,HCC 细胞对谷氨酰胺存在明显依赖性。GLS1 抑制组α-KG,谷氨酸水平均较Blank 组和siRNA-NC 组明显降低,差异有统计学意义（F ＝ 64.754,35.627,均P ＜ 0.001）。GLS1 抑制组细胞增殖（0.59±0.04）、迁移率（30.15%±1.02%）和侵袭能力（69.59±15.74）较Blank 组明显降低（1.29±0.07,59.67%±1.45%,202.14±13.52）,差异均有统计学意义（t ＝ 16.499,16.278,11.215,均P ＜ 0.001）。miR-203a-3p 过表达和GLS1 表达抑制明显抑制了Wnt/β-catenin 信号通路关键蛋白β-catenin,p-GSK-3β 和c-Myc 的表达,差异均有统计学意义（t ＝ 11.129 ～ 28.213,均P ＜ 0.001）。转染GLS1 可逆转miR-203a-3p 对HCC 细胞生物学行为及Wnt/β-catenin 信号通路关键蛋白表达的抑制作用。结论　HCC 中miR-203a-3p 显著低表达,其过表达能够抑制HCC 细胞的增殖、迁移和侵袭,可能与GLS1 调控谷氨酰胺代谢及miR-203a-3p 靶向GLS1调控Wnt/β-catenin 信号通路活性有关。     

miR-21在前列腺癌中的表达及抑制其表达对前列腺癌细胞增殖凋亡的影响

目的探讨抑制前列腺癌细胞中miR-21基因表达对癌细胞增殖和凋亡的影响及机制。方法 RTPCR检测前列腺癌及癌旁组织中miR-21基因的mRNA表达;空白对照组(Control)、阴性对照组(NC)和miR-21 inhibitor组转染人前列腺癌PC-3细胞,48 h后RT-PCR检测各组细胞中miR-21基因的mRNA表达;CCK8实验检测细胞增殖;流式细胞仪检测细胞凋亡;Western blot检测ki67、Cleaved caspase3、β-catenin、Cyclin D1蛋白表达。结果前列腺癌组织中miR-21的mRNA表达显著高于癌旁组织(P0.01);转染miR-21 inhibitor后miR-21的表达显著降低;NC组细胞存活率、细胞凋亡率及ki67、Cleaved caspase3、β-catenin、Cyclin D1蛋白表达与对照组,差异无统计学意义(P0.05),miR-21 inhibitor组细胞存活率及ki67、β-catenin、Cyclin D1蛋白表达显著低于对照组,细胞凋亡率及Cleaved caspase3蛋白表达显著高于对照组(P0.01)。结论抑制前列腺癌细胞中miR-21基因的表达可降低癌细胞的增殖及诱导细胞凋亡,其机制与抑制Wnt/β-catenin信号通路有关。     

沉默p21活化激酶1表达对人黑素瘤A375细胞凋亡及侵袭能力的影响

目的探讨shRNA沉默p21活化激酶1(p21-activated kinase 1, PAK1)基因表达对人黑素瘤A375细胞凋亡、迁移及侵袭能力的影响。方法对数生长期人黑素瘤A375细胞随机分为转染组(转染PAK1特异性shRNA)、阴性对照组(转染NC-shRNA)、空白对照组(不进行转染)。转染后培养72 h,采用实时荧光定量PCR法检测A375细胞PAK1 mRNA相对表达量,采用Western blot法检测A375细胞PAK1及p-PAK1蛋白相对表达量,采用流式细胞术检测细胞凋亡率,采用Transwell小室实验检测细胞迁移、侵袭能力。结果转染后培养72 h,转染组PAK1 mRNA相对表达量(0.45±0.07)、PAK1蛋白相对表达量(0.53±0.01)、p-PAK1蛋白相对表达量(0.21±0.03)均低于阴性对照组(0.98±0.04、0.65±0.02、0.38±0.04)、空白对照组(1.00±0.08、0.67±0.51、0.36±0.02)(P0.05),细胞凋亡率[(11.20±0.21)%]高于阴性对照组[(5.86±0.51)%]、空白对照组[(5.43±0.03)%](P0.05),迁移细胞数[(47.00±2.23)个]、侵袭细胞数[(30.00±4.44)个]较阴性对照组[(76.00±4.85)、(54.00±3.67)个]、空白对照组[(77.90±4.97)、(56.00±4.12)个]少(P0.05),阴性对照组上述各指标与空白对照组比较差异均无统计学意义(P0.05)。结论沉默PAK1基因表达可促进人黑素瘤A375细胞凋亡,降低其迁移及侵袭能力。     

人参二醇皂苷通过调节上皮间质转化抑制喉癌细胞的增殖和迁移

目的 探讨人参二醇皂苷(PDS)对喉癌Hep2细胞增殖、迁移和上皮间质转化(EMT)的影响，并阐明其作用机制。方法 人喉癌Hep2细胞分为对照组和不同浓度的PDS(0,19,38,75,150,300 mg·L^-1)及地塞米松(100 nmol·L^-1)处理组，MTT实验检测细胞生长活力，HE染色观察细胞形态学改变，细胞划痕实验检测细胞迁移能力，实时定量PCR(RT-qPCR)法和Western blotting法检测β-catenin、E-cadherin、N-cadherin和vimentin的mRNA和蛋白表达水平。结果 与对照组相比，PDS以时间及剂量依赖性抑制Hep2细胞生长。与对照组相比，用150 mg·L^-1 PDS处理喉癌Hep2细胞48 h后，可与地塞米松类似的下调细胞划痕愈合率，细胞形态向上皮型转化，上皮细胞标志物E-cadherin上调(P<0.05),间充质细胞标志物N-cadherin和vimentin下调(P<0.05),Wnt/β-catenin信号通路重要蛋白β-catenin...     

微小RNA miR-148b-3p在人胶质瘤细胞中的表达及意义

目的检测微小RNA(microRNA,miR)-148b-3p在人胶质瘤细胞中的表达水平,并探讨其对胶质瘤细胞增殖和侵袭的影响。方法荧光定量逆转录聚合酶链反应(qRT-PCR)方法检测胶质瘤细胞A172和正常星形胶质细胞HA1800中miR-148b-3p的表达水平。合成miR-148b-3p mimics及阴性对照(NC),用Lipofectamine 2000将miR-148b-3p mimics和NC转染至人胶质瘤细胞A172。分别采用噻唑蓝(MTT)法、Transwell实验、流式细胞术检测转染miR-148b-3p mimics对胶质瘤细胞A172增殖、侵袭及细胞周期的影响。结果 miR-148b-3p在胶质瘤细胞A172中的相对表达量为0.27±0.06,显著低于在正常星形胶质细胞HA1800中的相对表达量1.16±0.21(P0.01)。MTT检测到miR-148b-3p mimics组A172细胞增殖率在转染后显著降低,转染24h、48h及72h后,细胞增殖率分别下降(12.33±0.46)%、(18.35±0.64)%和(30.54±1.22)%。Transwell实验结果显示miR-148b-3p mimics组A172细胞穿膜细胞数为23.1±1.8,显著低于NC组的87.1±4.6(P0.01),miR-148b-3p mimics能够抑制A172细胞的侵袭能力。流式细胞术结果显示miR-148b-3p mimics显著阻滞A172细胞从G0/G1期向S期转换。结论 miR-148b-3p在胶质瘤细胞中低表达,miR-148b-3p在胶质瘤细胞中发挥抑制肿瘤增殖和侵袭的作用。     

miR-802对叉头框转录因子M1抑制A549/DDP细胞顺铂耐药性的靶向调控作用

目的探讨miR-802抑制非小细胞肺癌A549/DDP细胞的顺铂耐药性及其对叉头框转录因子M1(forkhead box protein M1, FoxM1)的靶向调控作用。方法 A549、A549/DDP细胞采用反转录PCR法检测miR-802相对表达量。将A549/DDP细胞分为空白转染组和miR-802过表达组(过表达组),分别转染miR-NC和miR-802类似物(miR-802 mimics),转染24、48、72、96 h后,采用反转录PCR法检测2组细胞miR-802相对表达量,并采用CCK-8法检测2组细胞增殖率;转染48 h后,CCK-8法检测转染后A549/DDP细胞对DDP的敏感性,采用流式细胞仪检测2组细胞凋亡率和细胞周期,采用Western blot法检测转染后A549/DDP细胞内FoxM1蛋白相对表达量。结果 A549/DDP细胞miR-802相对表达量(0.21±0.03)低于A549细胞(0.85±0.12)(P<0.05);转染24、48、72、96 h,过表达组细胞miR-802相对表达量依次增高(P<0.05),且均高于空白转染组(P<0.05);转染48、72、96 h,空白转染组细胞增殖率依次增高(P<0.05),且均高于过表达组(P<0.05);转染48 h,过表达组细胞半数抑制浓度[(35.28±2.17)mg/L]和细胞早期凋亡率[(17.2±1.1)%]均高于空白转染组[(14.22±1.28)mg/L、(9.0±0.8)%](P<0.05),S期和G2/M期细胞比率[(21.30±0.20)%、(8.35±0.33)%]及细胞内FoxM1蛋白相对表达量(0.21±0.04)均低于空白转染组[(27.54±0.52)%、(14.67±0.70)%、0.44±0.06](P<0.05)。结论 miR-802可能通过抑制FoxM1表达而降低非小细胞肺癌A549/DDP细胞的顺铂耐药性。     

WIF-1对人骨肉瘤MG-63细胞中β-catenin表达的作用研究

目的： WIF-1是Wnt信号通路中最常见抑制因子之一,本实验研究WIF-1对人骨肉瘤MG-63细胞Wnt信号通路中β-catenin表达量的影响。方法细胞培养人骨肉瘤MG-63细胞,0 ng/ml浓度的WIF-1作为空白对照组,分别以0、48、60、80、120 ng/ml浓度的WIF-1刺激MG-63细胞,分别用FQ-PCR及Western blot法从基因水平、蛋白水平测定细胞中β-catenin的表达量;细胞培养人骨肉瘤MG-63细胞,用WIF-1刺激细胞,分别在第0、12、24、48、72、96 h对各组细胞进行计数,观察空白组及WIF-1刺激组细胞数目的变化情况。结果不同浓度（0、48、60、80、120 ng/ml）WIF-1刺激下,FQ-PCR法显示β-catenin mRNA的相对表达总量2-ΔΔCT分别为1、0.55±0.30、0.44±0.24、0.35±0.15、0.24±0.21。与空白组相比较,WIF-1刺激下β-catenin mRNA表达量均降低（P＜0.05）。随着WIF-1浓度的增加,β-catenin mRNA表达量下降,但组间的抑制作用无明显差别（P＞0.05）;Western blot法显示β-catenin/β-actin蛋白相对表达量分别为1.40±0.11、0.86±0.10、0.51±0.11、0.45±0.06、0.18±0.03;与空白组相比较,差异有统计学意义（P＜0.05）;空白组及WIF-1刺激组细胞数目有差异,空白组细胞增殖情况优于WIF-1刺激组。结论 WIF-1可降低人骨肉瘤MG-63细胞Wnt信号通路中β-catenin表达量,并抑制人骨瘤MG-63细胞的增殖。     

分泌性白细胞蛋白酶抑制剂对结肠癌细胞侵袭的影响及机制

目的探讨分泌性白细胞蛋白酶抑制剂(secretory leukocyte protease inhibitor, SLPI)对结肠癌细胞侵袭能力的影响及可能分子机制。方法取对数生长期人结肠癌SW480细胞,随机分为SLPI过表达组(转染SLPI过表达质粒pCMV6-SLPI)、空白组(转染空载质粒)、抑制剂组(转染pCMV6-SLPI及特异性Wnt/β-catenin信号通路抑制剂ICG-001);转染后培养24 h,采用流式细胞术检测3组SLPI阳性细胞率,采用Transwell小室法检测3组细胞侵袭能力,Western bolt法检测β-catenin、T细胞因子-4(T cell factor-4, TCF-4)蛋白相对表达量,ELISA法检测基质金属蛋白酶-7(matrix metalloproteinase-7, MMP-7)水平。结果转染后培养24 h,SLPI过表达组、抑制剂组SLPI阳性细胞率[(94.98±1.71)%、(93.88±2.43)%]均高于空白组[(25.70±2.39)%](P0.05),SLPI过表达组与抑制剂组比较差异无统计学意义(P0.05);SLPI过表达组侵袭细胞数[(133.75±14.85)个]高于空白组[(107.75±7.54)个]、抑制剂组[(46.13±6.81)个](P0.05),空白组高于抑制剂组(P0.05);转染后培养24 h,SLPI过表达组β-catenin相对表达量(0.90±0.22)、TCF-4相对表达量(0.81±0.25)及MMP-7[(1 716.29±459.82)ng/L]水平均高于空白组[0.51±0.06、0.50±0.04、(1 386.07±542.53)ng/L]、抑制剂组[0.25±0.02、0.18±0.02、(174.96±55.57)ng/L](P0.05),且空白组高于抑制剂组(P0.05)。结论 SLPI通过活化Wnt/β-catenin通路促进MMP-7表达,增强结肠癌细胞侵袭能力。     

过表达miR-129-5p对胶质瘤细胞增殖、迁移 及CDK6、N-cadherin表达的影响

目的:研究过表达miR-129-5对胶质瘤细胞增殖、迁移及细胞周期蛋白依赖性激酶6(CDK6)、N-钙黏蛋白(N-cadherin)表达的影响。方法:培养胶质瘤U87细胞并分为转染阴性对照mimic的对照组、转染miR-129-5p mimic的miR-129-5p组,采用MTS实验检测增殖活力、划痕实验检测迁移活力、Western blot检测CDK6及N-cadherin的表达量,验证miR-129-5p对CDK6、N-cadherin的靶向调控作用。结果:miR-129-5p组的OD490值(0.78±0.15),明显低于对照组的(1.21±0.34)(P0.05);相对愈合面积(32.39±8.79)%,明显低于对照组的(73.39±17.85)%(P0.05);CDK6的表达量(0.28±0.09)及N-cadherin的表达量(0.34±0.08),明显低于对照组的(0.88±0.18)及(0.67±0.15)(P0.05);生物信息学分析及双荧光素酶报告表明miR-129-5p靶向调控CDK6、N-cadherin基因mRNA 3’UTR。结论:过表达miR-129-5p能够抑制胶质瘤细胞的增殖、迁移,其机制可能与靶向调控CDK6、N-cadherin有关。     

人口腔鳞状细胞癌SCC9细胞miR-146a-5p表达及对细胞增殖和凋亡的影响

目的探讨miR-146a-5p在人口腔鳞状细胞癌SCC9细胞系中的表达及对SCC9细胞增殖、凋亡的影响。方法取对数生长期人口腔鳞状细胞癌SCC9细胞和人正常口腔角质HOK细胞,采用实时荧光定量PCR法检测miR-146a-5p mRNA、肿瘤坏死因子受体相关因子6(tumor necrosis factor receptor associated factor 6, TRAF6)mRNA相对表达量。取对数生长期人口腔鳞状细胞癌SCC9细胞,随机分为观察组(转染miR-146a-5p mimics)和空白对照组(转染等量ddH_2O),转染24、48 h,采用CCK-8法检测2组细胞增殖,FITC-PI荧光双染法检测细胞凋亡;转染24 h,采用实时荧光定量PCR法检测PI3K mRNA、Akt mRNA、mTOR mRNA相对表达量,Western blot法检测PI3K、Akt、mTOR蛋白相对表达量。结果 SCC9细胞miR-146a-5p mRNA相对表达量(8.33±0.58)高于HOK细胞(1.04±0.01),TRAF6 mRNA相对表达量(0.05±0.01)低于HOK细胞(1.05±0.01)(P0.05)。转染24、48 h,观察组SCC9细胞增殖吸光度值(1.65±0.02、1.96±0.04)高于空白对照组(1.33±0.01、1.57±0.02)(P0.05),SCC9细胞凋亡率[(0.89±0.01)%、(1.23±0.01)%]低于空白对照组[(2.77±0.01)%、(4.23±0.01)%](P0.05)。转染24 h,观察组Scc细胞PI3K mRNA、Akt mRNA、mTOR mRNA相对表达量(2.98±0.05、8.20±0.06、5.34±0.03)高于空白对照组(1.05±0.01、1.03±0.01、1.07±0.01),PI3K、Akt、mTOR蛋白相对表达量(2.32±0.01、10.23±0.02、5.25±0.01)高于空白对照组(0.62±0.01、4.58±0.01、0.09±0.01)(P0.05)。结论 SCC9细胞miR-146a-5p表达上调,TRAF6表达下调;miR-146a-5p可促进SCC9细胞增殖,抑制其凋亡,其机制可能是增强PI3K/Akt/mTOR信号通路表达。     

罗哌卡因通过Wnt信号通路抑制胃癌细胞NCI-N87增殖、迁移和侵袭的机制

目的 探讨罗哌卡因通过Wnt信号通路抑制胃癌细胞NCI-N87增殖、迁移和侵袭的机制.方法 采用罗哌卡因细胞培养液培养胃癌细胞NCI-N87,并分为对照组(0μg/mL罗哌卡因)、ROP-L组(160 μg/mL罗哌卡因)、ROP-M组(320μg/mL罗哌卡因)、ROP-H组(640 μg/mL罗哌卡因)、ROP-H+ Licl(640 μg/mL罗哌卡因、Wnt信号激活剂Licl)组.MTIT法检测细胞增殖活性;Transwell小室检测细胞迁移和侵袭的能力变化;Westem blot方法分析基质金属蛋白酶-9(MMP-9)、基质金属蛋白酶-2(MMP-2)、上皮钙黏蛋白(E-cadherin)、β-连环蛋白(β-catenin)、钙黏蛋白(N-cadherin)、Wnt1的蛋白表达水平.结果 与对照组比较,ROP-L组、ROP-M组、ROP-H组胃癌细胞迁移和侵袭数目逐渐降低,增殖活性降低,细胞中MMP-2和MMP-9蛋白表达水平逐步减少,细胞中E-cadherin蛋白表达水平逐步增加,N-cadherin、Wnt1、β-catenin蛋白表达水平逐渐降低(P＜0.05).与ROP-H组比较,ROP-H+ Licl组胃癌细胞迁移数目和侵袭数目升高,MMP-9、MMP-2、N-cadherin、Wnt1、β-catenin蛋白水平升高,E-cadherin蛋白水平降低(P＜0.05).结论 罗哌卡因通过下调Wnt信号通路抑制胃癌细胞NCI-N87的增殖、迁移、侵袭和上皮间质转化(EMT).