实时定量PCR检测血液系统恶性疾病微小残留病

临床治疗血液系统恶性疾病达到完全缓解(CR)后,体内仍残留少量恶性肿瘤细胞(106~108),即微小残留病(MRD)。微小残留病的存在是血液系统恶性肿瘤复发和移植失败的根本原因,因此MRD的动态检测,对血液系统恶性疾病的预后有极其重要的意义〔1〕。以往应用PCR技术体外扩增肿瘤细胞只能定性或半定量监测MRD,因此局限了其在临床判断愈后方面的应用。近年来出现的实时定量PCR(RQ-PCR)技术〔2〕实现了从定性到定量监测MRD的飞跃,能够准确、动态地反映患者体内的肿瘤负荷变化。本文对RQ-PCR在检测血液系统恶性疾病MRD中的应用原理、基因…     

bcr—abl融合基因在慢性粒细胞白血病诊治中的意义

目的探讨定量检测bcr-abl融合基因在慢性粒细胞白血病（CML）诊断、治疗及微小残留病变监测中的意义。方法应用实时定量PCR（RQ—PCR）方法检测145例CML患者bcr—abl融合基因的表达情况。结果abl和bcr-abl的标准曲线相关系数均大于0．99,批内差及批间差均小于4％;11例不同分期的CML患者同时检测外周血和骨髓中bcr—abl水平,8例外周血较骨髓低,3例较骨髓高;急变期的bcr—abl表达情况较加速期和慢性期均明显增高。结论RQ—PCR技术检测bcr—abl融合基因准确可靠,对于评价疗效、监测微小残留病变以及预测疾病进展具有重要的临床应用价值。     

定量监测慢性粒细胞白血病患者治疗过程中BCR-ABL融合基因转录本水平变化的临床意义

目的：探讨实时定量逆转录聚合酶链反应（RQ-PCR）在监测慢性粒细胞白血病（CML）患者微小残留病、考核疗效以及预测疾病预后方面的作用。方法：应用RQPCR技术对25例CML患者伊马替尼治疗或异基因造血干细胞移植前后BCR-ABL融合基因转录本水平的变化进行监测。结果：CMI。急变期患者BCR-ABL转录本水平明显高于慢性期和加速期患者。7例异基因造血干细胞移植后6个月BCR-ABL转录本水平较6个月前明显降低,4例检测不到BCR-ABL转录本水平,3例极低。伊马替尼治疗的前6个月,BCR-ABL转录本水平下降最明显,治疗12个月后,疗效与造血干细胞移植者类似。结论：RQPCR方法在监测CML患者骨髓微小残留病及考核疗效方面,具有重要的临床应用价值。

Abstract：

Objective： To explore the application of real-time quantitative polymerase chain reaction （RQ- PCR） in detecting minimal residual disease （MRD）, assessing curative effects and predicting the prognosis of chronic myeloid leukemia （CML）. Methods： Changes of levels of BCR ABL were detected by the method of RQPCR in samples of bone marrow （BM） obtained from 25 patients with CML receiving imatinib or allogenie hematopoietic stem cell transplantation （allo-HSCT）. Results： The levels of BCR-ABL mRNA were obviously higher in patients with CML- blastie phase than those in patients with CML-chronic phase or CML-aecelerated phase. The BCR-ABL mRNA levels in the later 6 months were obviously lower than those in the former 6 months after HSCT in 7 cases. The BCR- ABL mRNA levels declined clearly in 3 cases, and even to zero in 6 months in 4 eases. Patients treated with imatinib had a significant decrease in the expression level of BCR ABL during the previous 6 months. It showed similarity in curative effects between patients receiving imatinib and HSCT in 12 months after treatment. Conclusions： RQ-PCR targeted at BCR ABL can be used in the quantitative detection of MRD in CML, and provide gist for instructing clinical therapy.     

造血干细胞移植后白血病细胞染色体核型和bcr/abl融合基因表达观察

目的：探讨造血干细胞移植(HSCT)后白血病细胞染色体核型和基因表达观察的意义。方法：用骨髓细胞短期培养法和直接法G显带分析染色体；双色荧光原位杂交检测bcr／abl融合基因。结果：2例供者为女性的男性急性髓细胞白血病(AML)患者异体外周血干细胞移植(allo-PBSCT)后染色体检测持续46，XX。最长生存50个月。4例慢性髓细胞白血病(CML)经allo-PBSCT后，Ph染色体和bcr／abl融合基因阳性1例，经供者淋巴细胞输注加干扰素治疗，已生存70个月。Ph染色体阴性bcr／abl融合基因阳性2例，最长生存27个月。Ph染色体阳性bcr／abl融合基因阴性1例，已生存14个月。2例AML自体造血干细胞移植后检测出非特征性染色体畸变，复发后再化疗达完全缓解，最长生存期达81个月。结论：造血干细胞移植后白血病细胞遗传学检测可观察近期疗效，指导后续治疗选择。     

血友病A并发慢性粒细胞白血病异基因造血干细胞移植一例

患者男，19岁。因腹胀半年，面色苍白3个月，于2005年5月26日入我院。入院体检：重度贫血貌，腹部膨隆，肝肋下10．5cm，脾甲乙线11．5cm。血象：WBC295×10^9／L，RBC1．95×10^12／L，Hb55∥L，PLT105×10^9／L。血片原始细胞0．09；骨髓象有核细胞增生极度活跃，粒系占0．872，原粒＋早幼粒0．072，中性粒细胞碱性磷酸酶（NAP）阳性率0％；RT-PCR检测bcr／abl融合基因p210（＋），[第一段]     

bcr-abl融合基因在慢性粒细胞白血病的发生及治疗中的作用

介绍 abl,bcr基因及bcl-abl融合基因结构，概述具有酪氨酸激酶活性的p210在慢性粒细胞白血病（CML）发病中的作用。CG157148是一种酪氨酸激酶特异性抑制剂，抑制p210活性。近年来体外实验及小规模临床试验证实CG157148是一种非常有前途的治疗CML的药物。     

急性早幼粒细胞白血病患者微小残留病的检测与临床意义的研究

目的检测完全缓解后急性早幼粒细胞白血病患者微小残留病（MRD），同时分析其对预后判断的指导价值。方法建立逆转录PCR（RT／PCR）用以检测APL患者PML／RARα。结果RT-PCR方法敏感而可重复。治疗前APL患者的RT-PCR阳性率为92．8％（39／42），而维甲酸或化疗诱导完全缓解后MRD阳性率为56．7％（21／37）。另外，MRD阳性与缓解后APL患者的复发有关，并可以作为缓解后预测APL患者复发的指标。同时有助于指导临床上采取巩固治疗而防止复发。结论RT-PCR能够检测APL患者的MRD和作为预测复发的指标。     

RT—PCR检测急性早幼粒细胞白血病微小残留病

用逆转录－聚合酶链反应（ＲＴ－ＰＣＲ）技术，检测了２２列早幼粒细胞白血病（ＡＰＬ）缓解患者ＰＭＬ－ＲＡＲα融合基因。结果显示性率在缓解时间１年内（１１／１４）较１￣２年（２／５）及３年以上（０／３）明显高，持续阳性多预示着复发。认为检测ＰＭＬ－ＲＡＲα融合基因，可作为监测ＡＰＬ病情转归、评价疗效的重要指标。     

应用RT-nest-PCR法检测慢性髓细胞白血病非亲缘异基因骨髓移植后微小残留病变

目的：应用筑巢式RT—PCR（RT—nest-PCR）法检测慢性髓细胞性白血病（CML）患者非亲缘异基因骨髓移植（URD）后微小残留病变（MRD），并探讨它与复发的相关性。方法：分别采用RT-nest—PCR法和常规细胞遗传学方法检测bcr／abl融合基因和Ph染色体。结果：20例CML行URD患者术前Ph染色体和bcr／abl融合基因检测均为阳性，移植术后30dPh染色体皆转为阴性，bcr／abl融合基因完全转阴时间为1～3个月，中位时间2个月；在随防的18例CML患者中，有16例患者bcr／abl融合基因完全转阴后没再转为阳性。在1例复发的CML患者中可见到血型、Ph染色体和bcr／abl融合基因动态变化，另1例CML患者在移植成功后的21个月和36个月检测到bcr／abl融合基因，经随访未见临床和血液学复发征象。结论：检测bcr／abl融合基因是目前观察CML患者非亲缘异基因骨髓移植后微小残留病变最敏感的方法之一，非亲缘异基因骨髓移植能最大限度地消除CML患者体内残留病变，患者能长期无病生存。     

应用间期荧光原位杂交技术评估干扰素治疗慢性粒细胞白血病的疗效

目的　探讨间期荧光原位杂交技术 (FISH)检测慢性粒细胞白血病 (CML)干扰素 (IFN)治疗后体内残留Ph阳性细胞的可行性。方法　应用间期FISH对 7例未治疗CML患者和 17例IFN α 2b长期治疗CML患者检测体内Ph阳性细胞变化情况。结果　正常对照组假阳性率为 ( 3 87± 0 94 ) % ,确定正常值为小于 6 68% (x± 3s)。未治疗组Ph阳性细胞平均为 89 2 1%。干扰素治疗组Ph阳性细胞平均为 4 4 86% ,与未治疗组相比无显著性差异 ( P >0 0 5 )。细胞遗传学有效患者 (CGR 4例 ,PGR 2例 ,共 8个标本 )Ph阳性细胞平均为 2 6 3 0 % ,与未治疗组相比有显著性差异 (P <0 0 5 )。而且Ph阳性细胞的减少与INF用药总剂量具有相关性 (r =-0 666,P =0 0 0 2 )。结论　间期FISH检测比染色体核型、RT PCR技术更能准确地评价干扰素治疗后体内存有的白血病细胞的负荷量 ,评价干扰素治疗CML的疗效     

实时定量PCR监测急性早幼粒细胞白血病患者PML/RARα融合基因的临床意义

目的 探讨实时定量PCR检测急性早幼粒细胞白血病（APL） PML/RARα融合基因表达水平的意义.方法 用扩增培养的NB4细胞的PML/RARα融合基因进行梯度稀释作为标准品,ABL作为内参,建立标准曲线.采用TaqMan法进行实时定量PCR,并对方法的可靠性、可重复性及灵敏性进行测定.对14例APL患者在初治、诱导缓解及巩固治疗3个时期的PML/RARα mRNA转录本水平进行动态定量监测,结果以NQ表示,NQ=PML/RARα mRNA的拷贝数/ABL mRNA的拷贝数×105.结果 实时定量PCR方法可以检测出1×10-5μ g NB4细胞cDNA中PML/RARα的融合基因,其重复性和稳定性Ct值变异系数分别为1.77％和2.11％.14例患者初治时骨髓PML/RARα融合基因平均水平为3 731,经全反式维甲酸、三氧化二砷双诱导缓解时PML/RARα融合基因平均水平为231,化疗与维甲酸序贯巩固治疗2个疗程后PML/RARα融合基因平均水平为116.治疗前后比较,PML/RARα基因转录本水平明显下降（P＜0.05）.结论 实时定量PCR检测PML/RARα融合基因表达敏感性好、特异性高、重复性好,可用于急性早幼粒细胞的诊断和微小残留病的检测.     

积极开展儿童急性淋巴细胞白血病微小残留病的定量监测

传统上儿童急性淋巴细胞白血病（ALL）缓解的定义基于骨髓形态学,即光镜下低于5％的骨髓白血病细胞。以发病时的白血病细胞约10^10计算,在骨髓完全缓解后,体内仍残留大约10^8的白血病细胞,这种状态称为微小残留病（MRD）,它被认为是白血病复发的首要原因。目前95％以上的儿童ALL患者在诱导化疗结束后即可达到完全缓解,但仍有约20％的患者最终复发。     

实时定量PCR检测慢性粒细胞白血病微小残留病研究进展

慢性粒细胞白血病(CML)是起源于造血干细胞的恶性克隆性疾病。约90%～95%CML患者具有费城染色体(Philadelphia,Ph),其分子基础是9号染色体上的c-abl基因易位到22号染色体上的bcr基因上形成新的基因嵌合体-bcr/abl融合基因,即t(9;22)(q34;q11)。该基因表达P210bcr/abl融合蛋白具     

异基因造血干细胞移植治疗43例慢性粒细胞白血病疗效分析

目的:评价采用一种新预处理方案行异基因造血干细胞移植(allo-HSCT)治疗慢性粒细胞白血病(CML)患者的疗效。方法:2005年1月-2008年12月对43例CML患者进行allo-HSCT,采用白消安加环磷酰胺联合氟达拉滨、阿糖胞苷(Bu/Cy/Flu/Ara-C)为预处理方案,具体剂量为Bu3.2mg·kg-1·d-1静点(iv)或4mg·kg-1·d-1口服(po)2～4d、Cy50mg·kg-1·d-1×2、Flu30mg·m-2·d-1×3、Ara-C2g·m-2·d-1×3。移植方式为HLA相合或半相合亲缘供者造血干细胞移植,其中外周血干细胞移植(PBSCT)16例,骨髓移植(BMT)26例,骨髓加外周血干细胞移植1例。结果:所有患者均获造血重建,发生Ⅱ～Ⅳ度急性移植物抗宿主病(aGVHD)12例(27.9%),慢性GVHD(cGVHD)19例(45.2%),移植相关死亡(TRM)9例(20.9%),细胞遗传学或血液学复发6例(14.0%),其中4例复发后采用格列卫与DLI联合的挽救治疗获得稳定的分子生物学缓解;总体无病生存率(DFS)为(72.0±7.0)%,其中CP1和非CP1期移植患者D...     

实时定量RT-PCR检测慢性粒细胞白血病bcr/abl融合基因的临床意义

目的：建立实时定量RT-PCR方法检测慢性粒细胞白血病(CML)bcr／abl mRNA的方法；探讨CML bcr／abl融合基因的表达水平与疗效的关系。方法：可同时检测b2a2和b3a2两种亚型．GAPDH的mRNA作为内参照。检测14例CML患者的22个外周血和骨髓样本中bcr／abl融合基因表达水平．并对2例异基因造血干细胞移植后复发的患者进行动态监测。结果：bcr／abl及GAPDH标准曲线的相关系数均为0．999；灵敏度为10^-6；14例初诊患者的mRNA表达水平范围为2．81～145；2例异基因造血干细胞移植后复发患者的bcr／abl mRNA表达水平随临床治疗而变化。结论：实时定量PCR检测CML患者的bcr／abl融合基因，敏感可靠，重复性好；其融合基因表达水平的改变与临床疾病进展关系相一致，有助于反映白血病细胞负荷、评价疗效及判断疾病预后。     

定量PCR监测干扰素联合阿糖胞苷治疗慢性粒细胞白血病患者bcr/abl基因表达的临床意义

目的:评价bcr／ab1融合基因作为观察治疗慢性粒细胞白血病(CML)疗效指标的临床价值。方法:采用荧光定量逆转录-聚合酶链反应技术检测28例经干扰素(IFN)联合阿糖胞苷(Ara-C)治疗的CML患者bcr／ab1 mRNA水平。结果:骨髓Ph染色体数与bcr／ab1融合基因水平具有较强的相关性(r=1．74,P<0．01)。IFN联合Ara-c治疗CML 6个月后完全持续缓解8例,部分缓解11例,主要细胞遗传学反应为67．85％。结论: bcr／ab1融合基因可能是治疗CML疗效观察和微小残留病灶监测的有效指标。     

实时定量PCR监测造血干细胞移植后BCR/ABL融合基因的表达

目的监测慢性粒细胞白血病（CML）患者异基因造血干细胞移植（allo-HSCT）后BCR／ABL融合基因表达水平的动态变化,从而判断移植效果,指导临床治疗。方法应用Taqman实时定量RT-PCR方法,以B-actin作为内参照,检测10例初发CML患者及25例接受allo-HSCT治疗的CML患者在移植前、后不同时段外周血中BCR／ABL mRNA表达水平。结果15例接受移植的患者移植前、移植后1、2个月的NBCR／ABL（％）中位数分别为：6．57（0．14～38．83）、0．10（0～1．71）、0（0～0．52）,3个月后全部为0。移植后早期检测BCR／ABL转录本较移植前逐渐下降,移植后1、2个月NBCR／ABL（％）均较移植前下降（x^2均为13．07,P〈O．01）;移植后2个月较1个月下降（x^2=8．10,P〈0．01）。其余10例患者从移植后3～43个月不同时段起连续检测NBCR/ABL（％）也全部为0。结论实时定量RT-PCR方法检测CML患者的BCR／ABL融合基因的表达,操作迅速,灵敏度、特异性好,用于移植后微小残留病的检测对评估预后并指导临床治疗具有重要意义。     

PML/RARα融合基因检测早幼粒细胞白血病微小残留病

目的:PML/RARα融合基因在监测急性早幼粒细胞白血病(APL)微小残留病(MRD)中的意义.方法:诱导缓解及巩固维持治疗期间,采用筑巢式逆转录-聚合酶链反应(RT-PCR)技术检测患者骨髓细胞中PML-RARα融合基因的变化.结果:长期随访的18例完全缓解(CR)患者,2例分子学复发.其中1例发生于CRI后4个月,诱导缓解治疗后获CR2,CR2后2个月再次分子学与血液学的复发,诱导治疗1个疗程获得CR3;1例发生于CR1后74个月,诱导缓解治疗后获得CR2,随访结束时生存期已达106个月.结论:在CR期定期监测PML-RARα融合基因,可尽早发现分子学复发,及时治疗可避免血液学复发.     

巢式聚合酶链反应检测慢性粒细胞白血病bcr／abl融合基因

目的 探讨Ph染色体和bcr/abl融合基因在慢性粒细胞白血病（CGL）的发病机制、诊断、治疗、预后判断的价值。方法 对46例CGL患者作巢式逆转录聚合酶链反应（RT-PCR）检测bcr/abl融合基因,同时对其中28例作细胞遗传学检查。结果 46例CGL患者中,44例bcr/abl融合基因阳性,阳性率为95.7%;28例CGL患者作细胞遗传学检查。26例Ph染色体阳性,阳性率为92.9%;2例Ph染色体阴性的CGL患者,用RT-PCR检测出ber/abl融合基因。结论 巢式RT-PCR是一种快速、敏感而准确的检测方法,可以为部分Ph染色体阴性的CGL患者提供分子生物学的诊断依据。