蚀斑

蚀斑（ｐｌａｑｕｅ）：又你空斑。是指将病毒悬液稀释一定倍数、接种于细胞培养物后，用半固体琼脂糖或甲基纤维素将已感染病毒的单层细胞覆盖一薄层，由于单个病毒所产生的ＣＰＥ（或死细胞群）受到覆盖物的局限，不能扩数，因此便在单细胞层上形成以最初受染细胞为中心...     

消毒剂对脊髓灰质炎病毒感染力灭活的研究

目的：评价微量组织培养半数感染量病毒滴定法检测４年种常用消毒剂对脊髓灰质炎的灭活效果。方法：将ＰｏｌｉｏＶ滴定于９６孔细胞培养板中的细胞上进行培养，测定病毒接触消毒剂前后感染细胞的滴度。结果：２％碱性戊二醛、１％二氯异氰尿酸钠（５２００ｍｇ．Ｌ＾－１）５ｍｉｎ内能有效杀灭ｐｏｌｉｎｏＶ，０．２％过氧乙酸和０．５％碘伏需１０ｍｉｎ。结论：用微量ＴＣＩＤ５０法评价消毒剂对病毒的灭活效果，客观，灵活、简     

登革病毒速成甲基纤维素半微量空斑试验的建立

目的：建立一种不需预先制备细胞单层的速成甲基纤维素半微量空斑技术。方法：以登革Ⅱ型病毒为代表，对速成法和常规法的实验条件、可靠性、敏感性、重复性等作系统研究。用方差分析和ｔ检验对实验结果进行统计学处理。结果：速成法重复性好，简单快速，敏感稳定，速成法空斑平均水平高于常规法（α１＞α２）。结论：速成甲基纤维素半微量空斑技术是一种可靠易行的病毒空斑新技术，可用于鉴定和滴定病毒，具有较大的实用和推广价值。     

两种HSV-1及猴B病毒相关抗体测定方法的比较

目的以人单纯疱疹病毒(HSV-1)做为抗原,利用空斑法和IFA法比较猴BV和人HSV-1阳性血清两种不同血清的中和能力的差异,建立一种实用、准确、可靠的病毒毒力的检测方法。方法首先,将HSV-1病毒悬液作连续的10倍稀释,取1 mL接种于已经长成单层的Vero-E6细胞上,用1%甲基纤维素覆盖,待其出现蚀斑后计数,算出病毒悬液中每毫升所含蚀斑单位,即滴定出HSV-1的TC ID50。同时,用免疫荧光方法(IFA)对猴和人疱疹阳性血清进行滴定,得到其血清的效价。其次,用滴定出的病毒液分别与两种阳性血清体外中和后,接种到单层的Vero-E6细胞上,用1%甲基纤维素覆盖,待其出现蚀斑后计数。最后,计算出其蚀斑减少率。结果用1%甲基纤维素作覆盖层的蚀斑数量平均为10-5PFU,能形成115~116个/mL蚀斑,形状呈黍米大小的规则圆形,其蚀斑边缘清晰。IFA滴定的人HSV-1阳性血清与猴BV阳性血清的中和抗体均为1∶80。人HSV-1和猴BV两种阳性血清的空斑减少率均为100%。结论确定了利用1%甲基纤维素做为覆盖层可得到清晰可靠的蚀斑,由此方法检测到用人HSV-1可以代替猴B病毒,筛查猴B病毒抗体。且为将来进行药物筛选和中和实验中利用病毒空斑法建立方便、可靠的方法。     

白细胞介素Ⅰ对登革病毒感染人血管内皮细胞的影响

目的：探讨白细胞介素Ｉ（ＩＬ－１β）在龠地病毒发病中的作用，以及登革病毒感染的发病机理。方法：用不同浓度的ＩＬ－１β分别作用于登革Ⅱ病毒（Ｄ２Ｖ）感染人脐静脉内皮细胞（ＨＵＶＥＣ）的不同环节（病毒感染前、感染同时，感染后）。于感染后不同时间收集感染上清液，用微量蚀斑法滴定病毒产量。结果：ＩＬ－１β对人脐静脉内皮细胞中的Ｄ２Ｖ增殖有抑制作用。ＩＬ－１β在实验浓度范围内不造成血管内皮细胞形态和数量的改     

消毒剂对脊髓灰质炎病毒感染力灭活的研究

目的：评价微量组织培养半数感染量病毒滴定法（简称微量ＴＣＩＤ５０法）检测４种常用消毒剂对脊髓灰质炎病毒（ｐｏｌｉｏＶ）的灭活效果。方法：将ＰｏｌｉｏＶ滴定于９６孔细胞培养板中的细胞上进行培养，测定病毒接触消毒剂前后感染细胞的滴度。结果：２％碱性戊二醛、１％二氯异氰尿酸钠（５２００ｍｇ·Ｌ１）５ｍｉｎ内能有效杀灭ｐｏｌｉｏＶ（病毒滴度下降≥３ｌｏｇ），０．２％过氧乙酸和０．５％碘伏（４０００ｍｇ·Ｌ１）需１０ｍｉｎ（病毒滴度下降＞３ｌｏｇ）。结论：用微量ＴＣＩＤ５０法评价消毒剂对病毒的灭活效果，客观、灵敏、简便易行     

登革病毒速成甲基纤维素半向量空斑试验的建立

建立一种不需预先制备细胞单层的带成甲基纤维素半微量空斑技术。以登革Ⅱ型病毒为代表，对速成法和常规法的实验条件，可靠性，敏感性，重复性等作系统研究。用方差分析和ｔ检验对实验结果进行统计学处理。     

空心莲子草抗登革病毒作用的实验研究

目的 采用中药空心莲子草提取液进行体外抗登革病毒的研究,寻找新的抗登革病毒药物。方法 利用四甲基偶氮唑盐(MTT)法和细胞病变效应(CPE),观察检测空心莲子草对C6/36传代细胞株的细胞毒性作用和抗登革病毒作用。结果 空心莲子草的4种提取物除>320μg/ml组以外,各浓度组均未见对细胞有明显的毒性作用。用统计软件SPSS11.5的Probit回归法计算药物的半数毒性浓度(TD₅₀)和半数有效抑制浓度(ED₅₀),香豆精类提取物对细胞的毒性最小(TD₅₀=535.91),石油醚提取物对病毒的抑制作用大于另3种提取物和药物对照(ED₅₀=47.43)。结论 空心莲子草在体外有抗登革病毒作用。     

固相酶联免疫测定法检测NS1抗原在登革病毒感染早期诊断中的应用

目的探讨固相酶联免疫测定（ELISA）法检测NS1抗原在登革病毒感染早期诊断中的应用价值。方法选取登革病毒感染早期患者血清171份,非登革病毒感染发热患者血清11份,正常人血清10份,采用ELISA法检测全部192份血清的登革病毒NS1抗原和IgM抗体;采用逆转录-聚合酶链反应-限制性内切酶酶切片段长度多态性分析（RT-PCR-RFLP）技术对发病5 d内的125份血清进行扩增和鉴定分型;并采用C6/36细胞微量培养法对发病第1、2天的41份血清进行登革病毒分离培养。结果登革病毒感染患者发病2 d内、3～5 d以及6～10 d血清NS1抗原的检出率分别是92.7%（38/41）、83.3%（70/84）、10.9%（5/46）;IgM抗体的检出率分别是2.4%（1/41）、51.2%（43/84）、97.8%（45/46）;非登革病毒感染的发热患者及正常人血清中,有1例疟疾患者血清登革病毒IgM抗体呈阳性,NS1抗原无一例阳性。RT-PCR在登革病毒感染患者发病第1、2天和3～5天的检出率分别是85.4%（35/41）、83.3%（70/84）;登革病毒感染患者发病第1、2天血清的病毒分离培养阳性率分别是80.0%（16/20）、38.1%（8/21）,总分离率58.5%（24/41）;RT-PCR-RFLP分型鉴定技术及间接免疫荧光法（IFA）均证实2006年广州流行株为登革Ⅰ型病毒。结论ELISA法检测登革病毒NS1抗原操作技术成熟,且具有敏感性高、特异性好的特点,对登革病毒感染的早期诊断和疫情的早期控制具有重要意义,适合于基层医疗机构常规应用。     

登革病毒感染对白纹伊蚊生理生态特性的影响

目的了解登革病毒感染对白纹伊蚊生理、生态以及对杀虫剂敏感性的影响。方法观察比较通过胸腔接种方式人工感染登革病毒的白纹伊蚊和胸腔注射生理盐水的对照组蚊虫的死亡率、产卵量、孵化率、子代发育情况,以及对拟除虫菊酯类杀虫剂的敏感性。结果两组蚊虫在死亡率、存活时间、产卵量等方面的差异有统计学意义,其它方面的差异不显著。结论登革病毒感染能够增加白纹伊蚊的死亡率并降低蚊虫的产卵能力。     

白纹伊蚊C6/36细胞登革Ⅱ型病毒结合分子的筛选

摘要：目的筛选白纹伊蚊C6/36细胞表达连接登革Ⅱ型病毒分子。方法提取C6/36细胞的总蛋白和膜蛋白,收集和纯化登革
Ⅱ型病毒,用12%SDS-PAGE分析C6/36细胞的总蛋白和膜蛋白,转于硝纤膜上,用病毒覆盖蛋白结合实验（VOPBA）筛选C6/36
细胞表达连接登革Ⅱ型病毒分子。结果C6/36细胞的总蛋白和膜蛋白经12% SDS-PAGE分离后转膜,分别与纯化的病毒液和
阴性对照液孵育,用抗登革病毒Ⅰ~Ⅳ单克隆抗体检测,结果显示病毒孵育组在67 000和30 000的位置有特异性的条带出现,而
阴性对照组无此条带。结论用VOPBA法初步从白纹伊蚊C6/36细胞中筛选67 000和30 000等登革Ⅱ型病毒结合分子,其功
能的鉴定正在进行。
     

The effect of diethylaminoethyl dextran and agar overlay pH on plaque formation by two plaque-size variants of foot-and-mouth disease virus

The effect of diethylaminoethyl (DEAE) dextran and agar overlay medium pH on a small-plaque (SP) and large-plaque (LP) foot-and-mouth disease virus (FMDV), type A, strain 119 (A119) was studied. The SP virus was inhibited under normal agar overlay but the addition of 100, 1,000 and 2,000 microg DEAE dextran/ml of agar overlay permitted plaque development. By using untreated and DEAE dextran-treated agar overlay medium, plaque formation by the SP virus was enhanced when the pH of agar medium was raised to a more alkaline level before overlay. Plaques formed by the LP virus were relatively uninhibited under the regular overlay but were larger in the presence of 1,000 microg DEAE dextran/ml. The enhancement of LP virus plaques occurred at various pH levels and was also inversely related to the hydrogen ion concentration of agar overlays; regular and DEAE dextrantreated alkaline overlays produced larger plaques.     

应用实时荧光定量PCR测定AdEasy系统中重组腺病毒滴度

目的:确立一种高效、简便的荧光实时定量PCR方法,对AdEasy系统中的重组腺病毒滴度进行测定.方法:采用Stratagene公司的AdEasyTM载体系统在293细胞中构建重组腺病毒,经10倍梯度稀释的病毒母液用以提取基因组DNA及空斑测定.以10倍梯度稀释的pAdEasy质粒作为标准模板进行实时PCR反应扩增六邻体基因片段,并绘制标准曲线.然后以上述的重组腺病毒DNA为模板,采用同样体系进行实时PCR反应,同时用琼脂糖空斑法测定病毒母液的滴度.结果:成功构建了重组腺病毒并对其进行了空斑测定.运用标准模板进行的PCR反应显示该方法的线性范围为101～108拷贝.病毒母液的DNA拷贝浓度(vg/ml)值,约为空斑滴度(pfu/ml)值的10倍.结论:荧光实时定量PCR方法可在较大的线性范围内检测重组腺病毒滴度,较之空斑法更为准确地反映了重组腺病毒的实际数量.     

经脑感染后登革病毒在小鼠脊髓分布特点的研究

目的 分析登革（DEN）病毒在中枢神经系统（CNS）内的生长规律和分布特点。方法 用2型登革病毒（DEN－2）对严重联合免疫缺陷（SCID）小鼠进行脑内接种，应用空斑法和免疫荧光染色分别检测感染后小鼠CNS和血清中的病毒滴度及病毒抗原的分布。结果 感染后小鼠逐渐出现皮毛不整、脊柱侧凸及驰缓性麻痹。从感染后3d到麻醉发生日，可在小鼠的脑皮质和脊髓中检测到滴度较高的DEN－2病毒，而血清中侧检测不到病毒。免疫荧光染色显示DEN病毒抗原大脑海马、基底核和脊髓灰质的神经元内。登革病毒抗原在感染早期和晚期在脊髓灰质的分布也存在差异。结论 感染后DEN在脊髓灰质内的分布不同提示脊髓不同部位的神经元对登革病毒的易感性可能不同。病毒在大脑、脊髓神经细胞内的增殖造成的细胞损害可能是登革病毒感染某些临床表现的病理基础。     

Solomon Islands dengue seroprevalence study--previous circulation of dengue confirmed

Since there were no confirmed outbreaks of dengue on record an extensive search of available records and a seroprevalence study were undertaken to determine if there was evidence of past dengue virus infections in the Solomon Islands. Hospital and Health Department records revealed a suspected dengue outbreak in 1982 and deaths attributed to dengue in 1995 and 1996. Serum samples from blood donors were analyzed for the presence of IgG antibodies specific for flavivirus and dengue virus. A total of 39% of the 515 samples, predominantly from adult males from Honiara, demonstrated IgG antibodies specific for dengue; 28% (26 of 93) were monotypically positive by plaque reduction neutralization test for dengue 2 antibody and the remaining samples had antibodies to more than one dengue serotype. A good correlation was found between the presence of flavivirus and dengue IgG confirming that dengue virus had circulated in the past in the Solomon Islands.     

空心莲子草抗登革病毒作用的实验研究

OBJECTIVE: To investigate the effects of Alternanthera philoxeroides Griseb extracts against dengue virus in vitro. METHODS: MTT assay and observation of cytopathic effect (CPE) were carried out to determine the cytotoxicity of Alternanthera philoxeroides Griseb on C6/36 cell lines and its effects on dengue virus. RESULTS: None of the 4 kinds of Alternanthera philoxeroides Griseb extracts exhibited obvious cytotoxicity on the cells at different concentrations with the exception of that over 320 microg/ml. The 4 extracts all showed inhibitory effects on dengue virus. Statistical analysis of TD(50) and ED(50) by Probit regression method suggested that extracts from coumarin had the lowest toxicity on the cells (TD(50)=535.91), whereas extracts from petroleum ether showed the strongest inhibitory effects on dengue virus (ED(50)=47.43) among the 4 extracts. CONCLUSION: Alternanthera philoxeroides Griseb possesses antiviral effects on dengue virus in vitro.     

登革热病毒多重荧光PCR检测及基因分型方法的研究

目的 建立一种登革热病毒双靶基因多重荧光PCR检测方法,用于登革热病毒的实验室诊断和基因分型.方法 选取登革热病毒Ⅰ-Ⅳ型病毒保守区设计型特异性引物探针和通用型引物探针,评估多重荧光PCR检测方法的特异性、重复性和检测限;并对20份阳性样本进行检测.结果 20个登革热阳性核酸标本在通用型检测全部为阳性,特异性型别检测发现登革热病毒Ⅰ型10例、登革热病毒Ⅱ型3例、登革热病毒Ⅲ型3例、登革热病毒Ⅳ型4例;20名正常无症状人群标本提取的核酸和HIV、HCV和HEV通用型和特异性型别检测全部为阴性.梯度检测的变异系数均小于5％.对登革热Ⅰ-Ⅳ型病毒检测最低检测限达103 copies/ml.结论 本研究建立的登革热病毒双靶基因多重荧光PCR检测及分型方法具有特异性好、重复性好、快速易操作等优点,可用于登革热病毒的快速检测和基因分型鉴定.     

狂犬病病毒不同毒株的生物学特性研究

目的研究狂犬病不同固定毒株对动物的致病性和对细胞的感染性。方法以小鼠脑内和肌内途径接种比较不同毒株的致病性,研究并建立HEPES(4-羟乙基哌嗪乙磺酸)诱导的空斑形成技术测定病毒空斑形成单位(plaque-forming unit,PFU)和细胞病变感染技术测定病毒感染滴度(CCID50),并用以比较不同毒株的病毒滴度,实验同时以常规的直接免疫荧光法(direct immunofluorescent assay,dFA)做对照。结果不同固定毒株对10~12g小鼠的脑内致病力普遍很高,但肌内毒力普遍较低,脑腔感染致病力比肌内感染致病力高3.0~5.0lg LD50,CVS株相差最大为5.0lg LD50。用两种新的方法 (PFU和CCID50)测定不同毒株的病毒滴度与dFA法测定的结果比较,除个别株外无明显差异,如CVS-11、4aG、PV株用三种方法测定的滴度均在7.1~7.9lg。结论用dFA法测定病毒滴度的结果与小鼠脑内测定的结果有可比性,用以替代小鼠脑内法测定病毒滴度是可行的。两种细胞感染法测定的病毒滴度操作简便,无需贵重仪器和昂贵试剂,可以更广泛地应用于狂犬病病毒和疫苗发展的研究。     

The role of trypsin in plaque formation by simian rotavirus SA-11

The role of trypsin in plaque production by simian rotavirus SA-11 monolayers of MA-104 cells are investigated. Initial trypsin treatment of the virus alone or its presence only during the early phases of virus-cell interaction was found to be insufficient for plaque production by the virus. Presence of trypsin (5 microgram/mL) in the agar overlay throughout the five day incubation period was essential for the optimal development of the virus plaques. Production of plaques by the incorporation of trypsin in the overlay was not due to the enzymatic degradation of any plaque-inhibitors in the agar used. Experiments using high (4 PFU/cell) and low (35 PFU/10(6) cells) multiplicities of infection suggest that trypsin added to fluid maintenance medium facilitates the cell-to-cell spread of progeny virus particles. Therefore, the enzyme incorporated in the agar overlay appears to play a similar role thereby assisting in the formation of SA-11 plaques.