脑胶质瘤中hMLH1、hMSH2基因启动子区的甲基化状态研究

目的 检测脑胶质瘤中hMLH1、hMSH2基因启动子区的甲基化状态,探讨其在肿瘤发生中的作用.方法 采用甲基化特异性聚合酶链反应(MSP)方法,检测51例脑胶质瘤标本及人脑胶质瘤U251细胞株的hMLH1、hMSH2基因启动子C_PG岛甲基化状态.结果 在7例正常脑组织中,用MSP法检测的hMLH1、hMSH2基因启动子区均未发现甲基化,51例脑胶质瘤组织中,hMLH1、hMSH2甲基化率分别为13.7%(7/51)、35.3%(18/51),且为甲基化和非甲基化共存,人脑胶质瘤U251细胞中未发生hMLH1启动子甲基化,而发生了hMSI-12启动子甲基化,hMLH1、hMSH2基因启动子区甲基化与性别、年龄、病理类型无明显相关.但hMLH1在低级别(Ⅰ～Ⅱ级)患者标本中甲基化率为0.0%(0/25),高级别(Ⅲ～Ⅳ级)患者标本中甲基化率为26.9%(7/26),差异有统计学意义(χ~2=5.69,P<0.05).结论 hMLH1、hMSH2基因启动子区甲基化状态与性别、年龄、病理类型无明显相关.hMSH2基因启动子区的CpG岛在脑胶质瘤中有中等频率的甲基化,是脑胶质瘤发生过程中的早期事件,可能与脑胶质瘤的发生相关;脑胶质瘤中hMLH1基因启动子区甲基化率较低,但hMLH1启动子区甲基化状态与病理分级有关;人脑胶质瘤U251细胞株中hMSH2基因启动子C_PG岛高甲基化.     

膀胱移行细胞癌错配修复基因hMLH1、hMSH2、hMSH3启动子甲基化状态的研究

目的 探讨错配修复基因hMLH1、hMSH2、hMSH3在膀胱移行细胞癌中启动子甲基化和蛋白表达的相关性.方法 采用甲基化特异聚合酶链反应(MSP)检测正常膀胱上皮组织(13例)及膀胱移行细胞癌组织(57例)hMLH1、hMSH2、hMSH3启动子甲基化状态,免疫组织化学检测其蛋白表达.结果 在正常膀胱上皮中,hMLH1、hMSH2、hMSH3均未发现启动子甲基化;在肿瘤组织中,hMSH2未发现启动子甲基化,hMLH1、hMSH3启动子甲基化阳性率分别为36.8%、49.1%,与正常组织比较差异均有统计学意义(P＜0.01),但在不同肿瘤分级(G1、G2、G3)间及不同临床分期(浅表性、浸润性)间比较差异无统计学意义(P＞0.05).免疫组织化学显示:hMLH1、hMSH2、hMSH3蛋白表达在正常膀胱上皮组织中,阳性表达率分别为100%、100%、92.3%,与肿瘤组织阳性表达率分别为59.6%、52.6%、40.4%,两者比较差异有统计学意义(P＜0.01),但在不同临床分期(浅表性、浸润性)间比较差异无统计学意义(P＞0.05),且hMSH2、hMSH3蛋白阳性表达率随肿瘤分级的增加显著降低,G1与G3比较差异有统计学意义(P＜0.05).在肿瘤组织中,hMLH1和hMSH3启动子甲基化与蛋白表达具有极显著相关性(P＜0.01).结论 hMLH1、hMSH3蛋白表达受其启动子甲基化的调控,hMSH2蛋白表达不受其启动子甲基化的调控.错配修复基因hMLH1、hMSH2、hMSH3蛋白表达的缺失可能参与了膀胱移行细胞癌的发生.     

膀胱移行细胞癌中DNA错配修复基因hMLH1、hMSH2和hMSH3启动子区甲基化状态研究

目的探讨DNA错配修复基因启动子区CpG岛甲基化状态及其在膀胱移行细胞癌（BTCC）中的表达。方法应用MSP技术检测膀BTCC中hMLH1、hMSH2和hMSH3基因启动子区甲基化状态,RT-PCR法检测其mRNA表达水平。结果36例BTCC组织中hMSH1、hMSH2的甲基化阳性率分别为38.9％（14／36）、52.8％（19／36）,所有标本中均未发现有hMSH3启动子甲基化。hMLH1、hMSH2、hMSH3 mRNA在BTCC中表达率分别为47.2％（17／36）、38.9％（14／36）、16.7％（6／36）,在正常组织中分别为22.2％（8／36）、63.9％（23／36）、0％（0／36）,差异均有统计学意义（P〈0.01）,并且随肿瘤病理分级的增加呈下降趋势（P〈0.05）,均与临床分期不相关（P〉0.05）。结论hMLH1、hMSH2和hMSH3基因启动子异常甲基化可能导致该基因转录表达失活,使其mRNA表达减少甚至缺失,这可能是导致BTCC发生、发展的原因之一。     

膀胱癌细胞中DAPK基因启动子甲基化状态分析

目的 分析DAPK抑癌基因在T24、5637、ScaBER三种膀胱癌细胞中的表达情况及该基因启动子区的甲基化状态。方法 采用半定量RT-PCR和Westernblot分别检测三种膀胱癌细胞中DAPK基因的表达，用甲基化特异PCR（MSP）方法检测三种细胞中的DAPK基因启动子甲基化状态。观察甲基转移酶（DMNT）抑制剂5-aza-2’-deoxy．cytidine（5-aza-CdR）对各细胞中的基因表达和甲基化状态的影响。结果 T24细胞中未检测到DAPK基因的表达，也未检测到启动子甲基化；5637细胞中该基因表达水平极低，在SeaBER细胞中该基因的表达较前两者要高。5637细胞和ScaBER细胞中均有甲基化改变。2．5μmol／l浓度的5-aza-CdR可以有效上调5637和ScaBER细胞的DAPK基因的表达。结论 抑癌基因DAPK的表达异常与移行细胞癌的发生发展有重要联系，且基因启动子区CpG岛的异常甲基化在调节DAPK基因的表达中发挥重要作用。     

肝细胞癌GSTP1基因启动子区甲基化的研究

基因启动子区异常甲基化抑制转录是基因失活的又一机制，也是人类肿瘤发生的重要机制之一。肝细胞癌（HCC）发生的分子机制仍不十分清楚。我们采用甲基化特异性PCR（MSP法）检测了HCC中GSTP1基因启动子甲基化，探讨其在HCC发生中作用。     

人肠癌RKO细胞周期依赖性激抑制因子基因启动子区甲基化状态的研究

目的 探讨人结肠癌RKO细胞周期依赖性激酶抑制因子(CKIs)家族启动子区CpG岛甲基化状态及其甲基化可逆性特征.方法 应用特异性DNA甲基转移酶(DNMTs)抑制剂5-Aza-2]-deoxycytidine(5-Aza-CdR)处理肠癌细胞,甲基特异性聚合酶链反应(Methylation-Specific PCR,MSP)、T-A克隆及DNA测序法分析RKO细胞CKIs家族抑癌基因p15ink4b、p16ink4a/CDKN2、p21/cip、p27/kip启动子CpG岛甲基化状态.结果 未经5-Aza-CdR作用的肠癌RKO细胞,其p15ink4b、p16ink4a/CDKN2基因组DNA胞嘧啶(C)保持不变,这提示在其单链DNA中胞嘧啶呈甲基化状态;而经5-Aza-CdR作用的肠癌RKO细胞,其p15ink4b、p16ink4a/CDKN2、p21/cip和p27/kip基因组DNA胞嘧啶均已变为胸腺嘧啶,表明在DNA单链中胞嘧啶已呈去甲基化状态.结论 肠癌RKO细胞周期INK4家族(p15ink4b和p16ink4a/CDKN2)基因的启动子区处于异常的高甲基化状态,而KIP/CIP家族(p21/cip和p27/kip)基因未处于高甲基化状态;5-Aza-CdR能较好地逆转肿瘤细胞INK4家族基因DNA高甲基化状态.     

肝细胞癌中WIF-1基因启动子甲基化状态及mRNA表达的研究

目的 探讨细胞癌中WIF-1基因启动子甲基化状态及其对mRNA表达的影响。方法 应用甲基化特异性聚合酶链反应和实时定量逆转录-聚合酶链反应技术,检测33例肝细胞癌及相应的癌旁组织和20例正常对照肝组织中WIF-1基因启动子甲基化状态和mRNA表达水平,分析上述组织WIF-1基因甲基化及mRN表达与临床资料的关系并分析甲基化对mRNA表达的影响。结果 WIF-1基因在癌组织中甲基化率明显高于癌旁组织和正常组织（Х^2=4．89,P〈0．05）,而癌旁组织和正常组织中WIF-1基因甲基化率相比无明显差异;癌组织中WIF-1基因甲基化与乙肝表面抗原、肝硬化有关;WIF-1基因mRNA表达量在三种组织中比较无明显差异。结论 WIF-1基因启动子甲基化与HCC的发生相关;WIF-1基因启动子甲基化与其mRNA表达的关系有待进一步研究。     

普鲁卡因酰胺诱导肝癌细胞启动子区甲基化的GSTP1基因重新表达

目的研究HepG2肝癌细胞GSTP1基因启动子区甲基化与GSTP1基因表达的关系，并探讨普鲁卡因酰胺用于诱导因甲基化失活的GSTPI基因重新表达的可能性。方法分别用5-杂氮-2’-脱氧胞苷(5-Aza-CdR)和普鲁卡因酰胺处理HepG2细胞后培养，甲基化特异性PCR(MSP)检测细胞中GSTP1基因的甲基化状况，RT-PCR和Western blot分别检测细胞中GSIP1 mRNA和GST-π的表达。结果HepG2细胞在去甲基化药物处理前，GSIP1基因完全甲基化，GSTP1基因不表达；药物处理后，普鲁卡因酰胺组和5-Aza-CdR组GSTP1基因有表达。结论肝癌细胞GSTP1基因启动子区甲基化可抑制GSTP1基因表达，普鲁卡因酰胺与5-Aza-CAR一样能使启动子区甲基化的GbTP1基因重新表达。     

微卫星不稳定结直肠癌hMLH1和hMSH2及hMSH6种系突变与hMLH1启动子甲基化检测

目的探究微卫星不稳定（MSI）结直肠癌患者的hMLH1、hMSH2和hMSH6种系突变特征和hMLH1启动子甲基化状态。方法对前瞻性收集的34例MSI结直肠癌患者检测其hMLH1、hMSH2和hMSH6种系突变，并研究其肿瘤的hMLH1启动子甲基化状态。结果34例MSI结直肠癌中。共检测到MLH1基因启动子的甲基化19例（55．9％）。19例MSI—H结直肠癌中检测到MLH1基因的甲基化14例（73．7％）；15例MSI—L结直肠癌检测到MLH1基因的甲基化5例（33．3％）；两组差异有统计学意义（P〈0．05）。全组共发现8个hMSH2和hMSH6基因的突变，其中hMSH6基因突变3个，hMSH2基因突变5个。结论中国人MSI结直肠癌错配修复基因突变（未测到MLH1基因突变）和MLH1基因启动子的甲基化检出率可能有别于国外MSI结直肠癌。     

人脑胶质瘤中EMP3和PCDH-γ-A11基因的甲基化调控

目的 研究胶质瘤中EMP3和PCDH-γ-A11基因的启动子甲基化与mRNA表达的关系,分析其在胶质瘤恶性进展中的启动子甲基化调控机制.方法 使用甲基化PCR(MSP)检测EMP3和PCDH-γ-A11基因在胶质瘤、正常脑组织及胶质瘤细胞株中的基因启动子甲基化情况;Real-time PCR检测部分胶质瘤中两个基因的mRNA表达情况;统计学方法分析其基因启动子甲基化、mRNA表达及临床情况间的关系.检测去甲基化试剂5-Aza-CdR对U251和SHG-44细胞株中两个基因启动子甲基化和mRNA表达的影响.结果 在88例胶质瘤中,EMP3基因启动子甲基化发生率为47.7%(42/88),其甲基化率随胶质瘤恶性程度的增加而增高;PCDH-γ-A11基因启动子甲基化发生率为86.4%(76/88),其甲基化率随胶质瘤恶性程度的增加而降低.各级别胶质瘤中EMP3和PCDH-γ-A11基因的mRNA表达与正常脑组织相比均下调(P<0.01).U251和SHG-44细胞株中均检测到EMP3和PCDH-γ-A11基因的启动子甲基化,并且5-Aza-CdR能重新激活两个基因的表达.结论 胶质瘤中EMP3和PCDH-γ-A11基因启动子甲基化可能导致了其mRNA表达下调.EMP3和PCDH-γ-A11基因启动子甲基化可能成为胶质瘤恶性程度和预后评价的分子生物学标记,也可为胶质瘤的基因治疗提供新的靶点.     

Implications of mismatch repair genes hMLH1 and hMSH2 in patients with sporadic renal cell carcinoma

OBJECTIVES

To analyse the implications of DNA mismatch repair genes hMLH1 and hMSH2 in sporadic renal cell carcinoma (RCC).

MATERIALS AND METHODS

Specimens of tumour and healthy renal tissue were collected from 89 patients treated for sporadic RCC. Another 95 blood samples taken from individuals with no history of cancer were also analysed. After DNA extraction and PCR amplification, microsatellite instability (MSI) was determined using the Bethesda microsatellite panel, two exonic microsatellites of the TGFbRII and BAX genes, and the microsatellite D3S1611. The promoter methylation status of hMLH1 was investigated using the HpaII and MspI restriction enzymes. In addition, a sequencing analysis of complete coding region of hMLH1 and hMSH2 genes was performed.

RESULTS

MSI and promoter hypermethylation of hMLH1 were not detected. Interestingly, loss of heterozygosity (LOH) was common among patients with RCC, particularly in microsatellite D3S1611 (34.9%). Mutations were identified in eight patients: K618A and V716M in gene hMLH1; and I145V, G322D, and the novel mutation P349A, in gene hMSH2. The mutations also appeared in healthy renal tissue and therefore, were considered as germline DNA sequence variations. There were G322D and K618A changes in >1% of the healthy control subjects, suggesting that they are DNA polymorphisms.

CONCLUSIONS

Our data show that loss of function of both hMLH1 and hMSH2 is not involved in sporadic RCC, either by promoter methylation or mutation in their exons. However, LOH indicated that chromosomal instability affecting large fragments of DNA was the main genetic alteration we detected associated with RCC.     

错配修复基因启动子甲基化与胰腺癌发生的关系

目的通过对胰腺癌错配修复基因启动子甲基化及蛋白表达的检测与微卫星不稳定性的分析,探讨胰腺癌发病的分子机制。方法从35例胰腺癌病人的正常胰腺组织、癌组织中提取DNA;MSP法检测hMLH1及hMSH2基因启动子甲基化状态;SSCP法检测标本中微卫星不稳定性发生情况;免疫组化法检测错配修复基因hMLH1及hMSH2在胰腺癌中的表达情况。结果35例胰腺癌中hMLH1启动子甲基化发生率为60％（21／35）,正常组织中未发现甲基化,两者之间有统计学差异（P〈0.05）;而对于hMSH2仅有1例胰腺癌出现启动子甲基化;35例胰腺癌中微卫星高度不稳定7例,低度不稳定14例,稳定11例,正常组织中没有出现微卫星不稳定,两者之间有统计学差异（P〈0.05）;在微卫星不稳定的21例胰腺癌组织中有19例（90％）出现hMLH1启动子甲基化现象,微卫星稳定的ll例胰腺癌组织中仅有2例（6％）出现hMLH1启动子甲基化。hMLH1启动子甲基化在微卫星不稳定胰腺癌组织中常为缺失表达或低表达,在微卫星稳定胰腺癌组织中呈正常表达。hMSH2无论在MSI-H或MSI-L胰腺癌与正常胰腺组织中均无缺失表达,仅部分低表达。结论胰腺癌组织中错配修复基因的缺陷主要是hMLH1启动子甲基化,与胰腺癌微卫星不稳定性及蛋白表达缺失有关,在胰腺癌发生过程中起重要作用,是胰腺癌发生的重要机制之一。     

花生四烯酸乙醇胺对人胶质瘤U251细胞增殖和凋亡的影响

目的 观察神经酰胺通路在大麻受体激动剂花生四烯酸乙醇胺（AEA）抑制人胶质瘤U251细胞增殖及诱导细胞凋亡中的作用。方法 噻唑蓝（MTT）法分别测定合用不同浓度c2-神经酰胺（5～20μmol／L）或用烟曲霉毒素（FBl）（1，10μmol／L）预处理24h对AEA（1～10μmol／L）抑制U251细胞增殖作用的影响；流式细胞仪annexin-V／PI双染色法定量分析10μmaol／LFB1预处理24h后对10μmol／LAEA促细胞早期凋亡作用的影响。结果 AEA浓度依赖性抑制U251细胞的增殖且与C2-神经酰胺具协同作用；10μmol／LFB1预处理24h可显著对抗AEA对U251细胞增殖的抑制作用。AEA（10μmol／L）可诱导U251细胞发生早期凋亡（21．3％），而FB1（10μmol／L）预处理后凋亡发生率降为8．3％。结论 AEA可通过增加神经酰胺从头合成抑制人胶质瘤U251细胞的增殖并诱导早期凋亡。     

错配修复蛋白hMLH1、hMSH2和hMSH6在散发性结直肠癌中的表达及意义

目的探讨三种错配修复蛋白hMLH1、hMSH2和hMSH6在散发性结直肠癌(SCRC)中的表达情况及临床意义。 方法随机选取空军总医院普通外科和北京大学肿瘤医院结直肠外科自2008年3月至2012年12月收治的SCRC患者290例,采用免疫组织化学SP法检测患者肿瘤组织中hMLH1、hMSH2、hMSH6蛋白的表达情况,并结合其临床病理参数进行回顾性分析。 结果290例SCRC患者的肿瘤组织中hMLH1蛋白表达缺失率13.4%(39/290),hMSH2表达缺失率12.1%(35/290), hMSH6表达缺失率29.0%(84/290); hMLH1/hMSH2共同缺失率3.8%(11/290), hMLH1/hMSH6共同缺失率10.0%(29/290),hMSH2/hMSH6共同缺失率7.2%(21/290)、hMLH1/hMSH2/hMSH6共同缺失率3.4%(10/290)。hMSH1蛋白在中分化腺癌和低分化、黏液癌组织中表达率明显高于高分化腺癌(P<0.01); hMSH2蛋白在直径≤5 cm的肿瘤组织中的表达率显著高于直径>5 cm的肿瘤组织(P<0.01);hMSH6蛋白在女性组中的表达率显著低于男性组(P<0.01),在直径≤5 cm的肿瘤组织中的表达率高于直径>5 cm的肿瘤组织(P<0.05),有脉管内癌栓组的表达率高于无脉管内癌栓组(P<0.05),且在淋巴结转移多的组织中表达率高于淋巴结低转移者(P<0.01)。hMLH1与hMSH2的表达无明显相关性,而hMSH6与hMLH1、hMSH2的表达均呈明显相关性。 结论在SCRC中,错配修复蛋白hMLH1、hMSH2、hMSH6的表达缺失并不少见,且其表达缺失与SCRC临床病理参数的关系也明显不同于遗传性非息肉病性大肠癌。因此,当hMLH1、hMSH2、hMSH6作为对SCRC患者行肿瘤恶性度评定或制定个体化的化疗方案和预后判断的参考指标时,其标准也不同于遗传性非息肉病性大肠癌。     

125I-神经生长因子对人脑胶质瘤细胞株U251的作用

目的 探讨125I-神经生长因子(125I-NGF)对U251细胞的杀伤能力及作用机制.方法 通过噻唑蓝(MTT)试验检测分别以18.5、37.0、74.0、148.0、296.0、592.0、1184.0、1480.0、1850.0、2590.0、3330.0、3700.0 kBq/ml 125I-NGF处理的U251的吸光度值,选择吸光度值趋于最低时最小125I-NGF浓度为其最低有效浓度.采用平板克隆形成试验,比较分别给予完全培养液、592 kBq/mlNa125I、1 mg/L NGF和592 kBq/ml 125I-NGF溶液处理的各组细胞克隆形成率,评价上述因素处理后U251细胞的增殖能力.采用放射自显影技术观察细胞内银颗粒分布,从而反映125I-NGF进入细胞的能力.并通过彗星试验及微核形成试验观察125I-NGF作用后U251细胞DNA的损伤,有明显彗尾及微核形成者DNA损伤严重.通过流式细胞仪检测125I-NGF作用后U251 G0/G1及S期细胞比例变化.结果 125I-NGF的最低有效浓度为592 kBq/ml,在此浓度下,125I-NGF可以有效进入细胞核内并损伤靶细胞DNA,经125I-NGF处理的胶质瘤细胞克隆形成率(0.02±0.01)较对照组(0.33±0.02)明显降低(P<0.01).125I-NGF作用后S期细胞比例(10.69±0.02)较对照组(35.47±0.02)下降,G0/G1期细胞比例(75.10±0.22)较对照组(53.17±0.03)升高(P<0.01).结论 125I-NGF在U251细胞中可以被转运入细胞核内,并可以有效杀伤靶细胞,其杀伤作用主要针对S期胶质瘤细胞.     

骨形成发生蛋白4在胶质瘤细胞株U251中的作用

目的 观察骨形成发生蛋白4(BMP4)在U251细胞中的作用.方法 阿霉素、BMP4质粒体分别给予U251细胞,BMP4的小干扰给予阿霉素处理过48h的U251细胞,逆转录-聚合酶链反应(RT-PCR)、荧光定量PCR和Western blot检测转染是否成功及BMP4的表达量.噻唑蓝(MTT)检测细胞活性,应用公式(1-处理组A/空白组A)×100%计算处理组细胞增长抑制率.结果 RT-PCR、荧光定量PCR和Western blot证明转染是成功的.在给予BMP4质粒体0.5、1.0、1.5、2.0、2.5μg/孔后,细胞的抑制率分别为(23.4±1.1)%、(54.8±1.3)%、(58.8±1.6)%、(57.2±1.4)%、(56.1±0.9)%(P<0.05),0.5μg/孔与1.0、1.5、2.0、2.5 μg/孔的抑制率差异有统计学意义(P<0.05),1.0、1.5、2.0、2.5μg/孔之间差异无统计学意义(P>0.05).单用阿霉素对U251细胞的抑制率为(45.2±1.1)%(P<0.05).给予阿霉素后给予BMP4的siRNA,细胞的抑制率为(23.1±2.7)%,与阿霉素组比较差异有统计学意义(P<0.05).结论 BMP4可以抑制胶质瘤细胞U251的生长.