肠道病毒71型感染

1 引言 新型肠道病毒指的是1969年以后鉴定的,除脊髓灰质炎病毒、柯萨奇病毒、埃可病毒以后,陆续发现符合肠道病毒的理化特性的小RNA病毒.新型肠道病毒感染即由新型肠道病毒所引起的感染.     

肠道病毒71型的快速纯化及其鉴定

目的 建立一种简单、快速有效的从细胞培养物中纯化肠道病毒71(EV71)的方法.方法 EV71病毒在恒河猴肾细胞(LLC-MK2)中增殖后,将获得的细胞培养物经反复冻融、聚乙二醇6000沉淀、超速离心、氯化铯垫层超速离心的方法纯化病毒.用聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)、免疫印迹(Western blot)和透射电镜(TEM)的方法对纯化病毒进行鉴定,并测定其感染性的滴度及回收率.结果 SDS-PAGE显示出3个条带,相对分子质量分别为3.6×103、3×103和2.6×103与EV71的VP1、VP2和VP3相符合.Western blot证实为EV71特异性条带.经磷钨酸负染后电镜观察,能看到典型病毒颗粒.采用终浓度为10%的聚乙二醇6000沉淀后的病毒的感染性回收率为82.0%,再经氯化铯垫层超速离心后浓缩病毒的感染性回性率为29.0%.结论 聚乙二醇6000沉淀结合氯化铯垫层超速离心的方法比氯化铯密度梯度区带离心方法更简便,易于操作,并且比单独聚乙二醇6000沉淀有更高的纯度,是一种简便、有效的病毒纯化方法.     

2001年深圳地区肠道病毒71型的监测

目的　了解 2 0 0 1年深圳地区肠道病毒 71型的感染情况。方法　应用RT -PCR对 79份疑似肠道病毒感染者的粪便标本进行肠道病毒 71型RNA检测。结果　肠道病毒 71型的阳性率为 30.38% (24 / 79) ,深圳地区及与深圳相邻的东莞地区存在EV71的感染 ,EV71在成年人中还存在健康带毒者 ,1 0月份存在一个EV71感染高峰。 5岁以下的儿童是EV71感染的高危人群。EV71可导致包括神经系统并发症在内的多种疾病 ,其中手足口病所占的比例较大 (62.5 % )。不同性别间EV71的感染率差异无显著意义。结论　深圳地区存在EV71的感染 ,尤其要加强对出现中枢神经系统并发症的EV71的监测     

肠道病毒71型VP1蛋白原核表达及初步鉴定

目的采用分子克隆技术,构建肠道病毒71型(EV71)VP1全长基因大肠杆菌原核系统表达载体,诱导重组VP1融合蛋白表达。方法自EV71感染患者血清中提取病毒总RNA,进行一步法RT-PCR,扩增编码VP1蛋白的全长基因片段(891 bp),以pET32(a)为表达载体,构建重组表达质粒pET32(a)-VP1,转化E.coli.Rosseta感受态细胞,获得重组工程菌株。经诱导培养,SDS-PAGE电泳,免疫印迹鉴定表达产物。结果获得了含重组表达质粒pET32(a)-VP1的正相阳性工程菌株,经IPTG诱导能高效表达VP1融合蛋白。结论重组工程菌可表达VP1融合蛋白,对研究EV71发病机制及疫苗研制具有重要意义。     

肠道病毒71型病毒学及致病机制研究进展

肠道病毒71型(enterovirus 71,EV71)属小RNA病毒科、肠道病毒属A组,是一种新型嗜神经组织性肠道病毒。EV71引起的重症手足口病患儿病情进展迅速,若未及时治疗可并发脑干脑炎、致死性肺出血和肺水肿,危及患儿生命。本文就EV71的病毒学特性、致病机制及检测方法对重症手足口病的早期诊断及其并发症的预防治疗研究进展作一综述。     

肠道病毒71型致病机制及检测方法研究进展

正肠道病毒71型(EV71)是引起婴幼儿手足口病的主要病原体之一~([1])。受EV71病毒感染的患者因免疫反应不同会有不同的表现症状,主要为手、足、口、咽峡等处疱疹和发热、皮疹等轻微症状,但部分婴幼儿可能出现中枢神经系统感染及心肌炎等,严重威胁到婴幼儿的健康。因此对EV71致病机制和早期检测的研究十分必要。目前,学者们对EV71的发病机制有一定的认识,但仍然需要进一步探索。EV71感染检测的主要途径有分子生物学检测和血清学检测,各具特色。本文主要对EV71的致病机制和检测方法研究进展作一综述。     

人类肠道病毒71型感染的诊治

1手足口病与EV71感染手足口病（Hand-foot-mouth disease，HFMD）是由肠道病毒感染引起的临床症候群，多数病例以发热，手、足、口腔等部位的皮疹或疱疹为主要特征；少数病例出现呼吸系统、中枢神经系统损害，引起脑炎、心肌炎、肺水肿、弛缓性麻痹等症状；个别重症患儿病情进展快，发病后12小时内死亡。     

重症肠道病毒71型感染患儿35例护理体会

对35例重症肠道病毒71型(EV71)病毒感染患儿进行严密观察病情变化,识别高危因素,采取相应的用药护理及对症护理措施.结果除2例因肺出血死亡外,其余33例均病情稳定后转出监护室.提示本病没有针对病因的治疗,但如果能够密切观察病情变化,及时发现导致肺水肿、肺出血的高危因素,做好对症护理,积极配合抢救,对提高重症患儿治愈率具有重要意义.     

重症肠道病毒71型感染患儿35例护理体会

对35例重症肠道病毒71型（EV71）病毒感染患儿进行严密观察病情变化,识别高危因素,采取相应的用药护理及对症护理措施。结果除2例因肺出血死亡外,其余33例均病情稳定后转出监护室。提示本病没有针对病因的治疗,但如果能够密切观察病情变化,及时发现导致肺水肿、肺出血的高危因素,做好对症护理,积极配合抢救,对提高重症患儿治愈率具有重要意义。     

肠道病毒71型灭活疫苗安全性的主动监测分析

目的分析浙江省金华市肠道病毒71型（EV71）灭活疫苗的预防接种安全性。方法2016年9月至2018年7月,选择金华市6～47月龄儿童作为研究对象,采用主动监测方式进行面访和电话随访,并记录接种疫苗0～30 d的不良反应发生情况。结果研究纳入6 084名儿童,共主动监测疫苗9 090剂次,主动监测发现共有59名儿童发生不良反应,发生率为649.06/10万剂,96.61%发生于0～3 d。 不良反应以发热（72.88%）、腹泻（27.12%）和恶心呕吐（10.17%）等全身反应为主,转归良好。 ≥3级反应15例,均在观察期内痊愈。 不同性别、年龄、接种时间和接种剂次间的不良反应发生率差异无统计学意义（P＞0.05）,不同疫苗种类间的不良反应发生率差异有统计学意义（P<0.05）,≥3级不良反应发生率差异无统计学意义（P>0.05）。 Logistic回归模型分析结果显示,疫苗种类是不良反应发生的影响因素。结论EV71灭活疫苗0～30 d内不良反应发生率较低,发生率与疫苗种类有关。     

pcDNA-GPC3真核表达载体的构建及鉴定

目的构建人类GPC3重组真核表达载体。方法以人类肝脏cDNA文库为模板扩增出GPC3基因序列,应用T克隆载体及pcDNA真核表达载体重构,将质粒转化进入HLE人肝癌细胞系,进行荧光免疫方法检测。结果 测序结果序列正确,荧光染色转染质粒的HLE细胞可见细胞浆和细胞膜上有GPC3的表达。结论成功构建真核表达载体pcDNA-GPC3,并在真核细胞中可以表达。     

DKK1真核表达质粒的构建及表达产物鉴定

目的构建人DKK1基因的真核表达质粒,表达、纯化、鉴定其表达产物。方法自宫颈癌组织提取癌细胞,抽提mRNA,RT-PCR获得人DKK1基因片断,构建重组质粒pCMV-HA2/DKK1,EcoRⅠ酶切、测序鉴定重组质粒;借助脂质体将载体瞬时转染入Free-Style293-F细胞(无血清培养)蛋白印迹法检测DKK1蛋白。结果 RT-PCR获得片断与预期结果相符,酶切鉴定、测序鉴定证实pCMV-HA2/DKK1重组质粒构建成功;DKK1蛋白分泌表达在Free-Style293-F细胞培养液中,WesternBlot鉴定表达产物为DKK1蛋白。结论成功构建了人DKK1的真核表达质粒,并对该基因的真核表达产物进行鉴定,为下一步的DKK1蛋白对肿瘤发生中的生物学活性研究奠定基础。     

MeCP2特异性shRNA真核细胞表达质粒的构建与鉴定

目的构建MeCP2特异性SiRNA表达质粒pSilence-MeCP2。方法根据人MeCP2mRNA序列设计作用靶序列,化学合成两条互补的DNA寡核苷酸链,该序列中包含靶序列正义链、反义链,两者间的连接序列及与质粒相匹配的酶切位点序列,连接质粒后转化感受态细胞(E.Coli),使其在大肠杆菌内大量复制,提取质粒,PCR鉴定。结果合成的寡核苷酸序列与要求的序列完全相符,且以正确的方向插入。结论成功构建两个MeCP2特异性SiRNA表达质粒psilence-MeCP2/Ⅰ和psilence-MeCP2/Ⅱ。     

MeCP2特异性shRNA真核细胞表达质粒的构建与鉴定

目的构建MeCP2特异性SiRNA表达质粒pSilence-MeCP2.方法根据人MeCP2 mRNA序列设计作用靶序列,化学合成两条互补的DNA寡核苷酸链,该序列中包含靶序列正义链、反义链,两者间的连接序列及与质粒相匹配的酶切位点序列,连接质粒后转化感受态细胞(E.Coli),使其在大肠杆菌内大量复制,提取质粒,PCR鉴定.结果合成的寡核苷酸序列与要求的序列完全相符,且以正确的方向插入.结论成功构建两个MeCP2特异性SiRNA表达质粒psilence-MeCP2/I和psilence-MeCP2/Ⅱ.     

真核表达载体pcDNA3-ICOSIg的构建及表达

背景：人可诱导共刺激分子0cos）是迄今发现的重要共刺激分子家族成员,可促进激活T细胞的增殖和分泌、调节Th1／Th2细胞的极化、增强依赖T细胞的B细胞功能,阻断ICOS共刺激信号会导致T细胞的克隆失活或克隆无反应,从而诱导肿瘤对机体的免疫逃逸。目的：构建表达ICOSIg的质粒,观察其在小鼠体内的表达。方法：克隆编码ICOS的胞外片段,将其与编码小鼠免疫球蛋白IgG恒定片段（Ig）的基因融合,构建ICOSIg融合基因及其分泌型真核表达载体pcDNA3-ICOSIg,酶切鉴定重组子,测序,利用阳性脂质体载体包被pcDNA3-ICOSlg转染小鼠右侧大腿肌肉组织,Westernblot法检测血清ICOSIg水平。结果与结论：经测序鉴定证实pcDNA3．ICOSIg质粒目的基因片断与Genbank上公布的ICOS序列完全一致,说明质粒构建成功。脂质体载体包被pcDNA3-ICOSIg转染小鼠7d,在小鼠血清中检测到ICOSIg的阳性表达,说明pcDNA3．ICOSlg能够在小鼠肌细胞内表达。证实利用基因合成和重组技术可成功构建真核表达载体pcDNA3-ICOSIg。f201     

人上皮细胞黏附分子的真核表达及鉴定

目的构建人上皮细胞黏附分子(EpCAM)全基因的真核表达质粒,研究其在HepG2细胞中的表达。方法将EpCAM基因克隆入真核表达载体pcDNA3.1(+),构建真核表达质粒pcDNA3.1(+)-EpCAM,转染人肝癌HepG2细胞。通过免疫荧光、Western Blotting及流式细胞检测对转染后细胞内EpCAM蛋白的表达进行鉴定。结果双酶切鉴定结果表明重组质粒构建成功。免疫荧光、Western Blotting及流式细胞检测结果一致表明,转染后EpCAM基因在HepG2细胞中表达成功。结论成功构建了人EpCAM的真核表达载体,并在HepG2细胞中表达,为研究高表达人EpCAM的肝癌细胞的功能打下基础。     

Construction and identification of an antisense glucose transporter-1 plasmid

Our aim was to construct a pcDNA3.1(+) eucaryotic expression system vector containing the antisense glucose transporter-1 (Glut-1) gene. Total RNA was isolated from human Hep-2 laryngeal carcinoma cells, and the Glut-1 and antisense Glut-1 sequences were amplified by polymerase chain reaction. Expression plasmids containing the sense and antisense cDNA were constructed using the pcDNA3.1(+) vector. The resulting sense and antisense vectors, pcDNA3.1(+)-Glut-1 and pcDNA3.1(+)-antiGlut-1, respectively, were examined by restriction analysis and DNA sequencing. The pcDNA3.1(+)-antiGlut-1 was subsequently transfected into Hep-2 cells. AntiGlut-1 mRNA expression was detected, indicating the successful construction of an antisense Glut-1 plasmid capable of transfecting Hep-2 laryngeal carcinoma cells. These data provide a firm basis for additional studies using the plasmid pcDNA3.1(+)-antiGlut-1 to determine its therapeutic potential for the treatment of laryngeal carcinoma.     

pEGFP-N1/VEGF真核表达质粒的构建与鉴定

目的构建pEGFP-N1/VEGF真核表达质粒,并进行鉴定。方法利用RT-PCR方法从组织中提取VEGF的基因片段,与pMD18-T载体连接,构建pMD18-T/VEGF重组质粒,酶切后与pEGFP-N1真核表达载体连接,构建pEGFP-N1/VEGF真核表达质粒,进行测序、酶切鉴定,表明质粒构建成功。结果本实验成功构建了pEGFP-N1/VEGF真核表达质粒。结论为进一步研究利用VEGF基因修饰骨组织工程骨,促进血管再生提供实验基础。     

心脏转录因子GATA结合蛋白4真核表达质粒的构建

背景:有研究表明心脏转录因子GATA结合蛋白4(GATA4)与先天性心脏病的发生有密切的关系,但其机制不明,而目前尚未查及GATA4真核表达质粒构建类的报道.目的:构建人类心脏特殊转录因子GATA4的真核表达质粒.方法:对重组质粒pUC57-GATA4进行酶切获得GATA4基因编码区序列,将真核表达载体pCMV-Myc和GATA4基因在双酶切后用T4连接酶连接,构建重组质粒pCMV-Myc-GATA4,转化至大肠杆菌,提取质粒后经聚合酶链反应、双酶切及测序鉴定.结果与结论:实验成功酶切重组质粒获得GATA4基因编码区约1.3 kb的目的片段,聚合酶链反应和酶切鉴定以及基因测序结果显示,构建的重组真核表达质粒中含有正确的GATA4基因序列,证实成功构建了含有GATA4基因的真核表达重组质粒.