GADD45β参与类风湿关节炎发病机制研究(2)—GADD45β介导类风关CD4~+T细胞抗凋亡研究

在发现了GADD45β在类风湿关节炎(rheumatoid arthritis,RA)病灶局部组织细胞中、CD4+T细胞表达增高并参与介导IFN-γ产生的基础上,进一步探讨GADD45β参与RA的其他机制。用siRNA干扰人PBMC中GADD45β基因表达。Real-time PCR检测GADD45β和凋亡相关基因的表达格局。用RA患者滑膜液(RA synovial fluid,RA SF)刺激GADD45β基因敲除的健康人PBMC并用流式细胞仪检测细胞凋亡。结果RA患者的SFMC中T细胞凋亡减少。用SF刺激正常人PBMC时细胞凋亡减少。经siRNA干扰后PBMC中GADD45β的表达明显降低,同时细胞凋亡增加。同时检测与凋亡相关基因发现SF刺激后Bcl-2分子在凋亡的细胞中表达明显降低,而Fas-FasL、Bcl-2家族其他分子如Bcl-xl、Bax、Bim等变化不明显。GADD45β参与介导RA的炎症性T细胞凋亡,而Bcl-2分子参与了由GADD45β介导抗凋亡作用,而这一作用与RA患者滑膜液中炎症细胞能够长期存活并介导炎症可能有密切关系。     

Caspases在视黄酸诱导pRARE4-IFNα转染肿瘤细胞凋亡中的作用

目的探讨视黄酸(RA)及其诱导的外源性α-干扰素(IFNα)抗肿瘤作用与半胱氨酸蛋白酶(caspase)的关系。方法含视黄酸反应元件(RARE)的IFNα表达载体(pRARE4-IFNα)，转染肿瘤细胞并证实外源性IFNα基因的表达受RA的诱导后，分析了细胞增殖功能、细胞DNA梯形带，caspase-1、3基因表达，caspase-3活性以及caspase-3特异性抑制剂(DEVD-CHO)对RA和／或IFNα诱导细胞凋亡的抑制作用。结果对RA敏感的HL60细胞和caspase-3基因缺失的MCF-7细胞经RA处理后，增殖能力减弱，出现明显的DNA梯形带，caspase-1基因表达上调节，HL-60细胞caspase-3基因表达上调节，活性升高，DEVDCHO可拮抗RA引起的HL-60细胞caspase-3活性升高，并部分削弱RA引起的细胞增殖抑制和凋亡。结论Caspase-3在RA诱导的细胞凋亡中有重要作用，同时，RA可能通过其它途径诱导caspase-3基因缺失细胞的凋亡。     

二十碳五烯酸联合视黄酸对HL-60细胞凋亡相关基因表达的影响

目的 研究二十碳五烯酸(EPA)是否协同视黄酸(RA)影响HL-60细胞的凋亡及相应分子机制。方法 流式细胞仪(FCM)检测细胞周期相分布以测定细胞增殖和凋亡功能；Western blot法分析bcl-2和caspase—3表达。结果 与单独应用相比，EPA和RA联合应用可增强HL-60细胞的调亡效应，以及下调节bcl—2和增强caspase-3基因表达。结论 EPA和RA联合应用对HL-60细胞凋亡的增强效应，可能与它们增强caspase-3和降低bcl—2基因表达相关。     

淋巴细胞共刺激信号和凋亡信号异常与RA免疫效应亢进的研究

目的：探究T淋巴细胞表面多种细胞信号分子所介导的细胞活化或凋亡信号在RA患者免疫功能紊乱中的作用。方法：采用流式细胞术检测RA患者外周血T细胞亚群及其表面共刺激分子cD154（cD40L）、CD30和凋亡受体CD95（Fas）的表达。结果：RA患者外周血T细胞亚群偏移，CD4^＋T细胞增加，CD8^＋T细胞减少；共刺激分子CD154在CD4^＋和CD8^＋T细胞上的表达均上调，但CD30分子的表达均降低，并以CD4^＋T细胞降低更为明显。同时，凋亡受体CD95分子在T细胞亚群上的表达均明显增加。结论：RA患者T淋巴细胞表面多种信号分子表达异常，共同导致了RA患者免疫功能紊乱。     

瓜氨酸化纤维连接蛋白对类风湿性关节炎成纤维样滑膜细胞的凋亡及促炎症因子分泌的影响

针对瓜氨酸化蛋白的抗体被认为是诱发类风湿性关节炎(rheumatoid arthritis,RA)的元凶,本研究旨在探讨瓜氨酸化纤维连接蛋白(citrullinated fibronectin,cFn)在RA中的致病机理。通过免疫组化和双重免疫荧光技术分析cFn在RA患者的滑膜组织中的分布情况。用纤维连接蛋白(fibronectin,Fn)以及cFn处理从RA患者的滑膜组织中分离得到成纤维样滑膜细胞(fibroblast-like synoviocytes,FLS)后,再通过流式技术和TUNEL法检测细胞凋亡情况。实时荧光定量PCR检测survivin,Caspase 3,cyclin-B1的mRNA表达情况。用ELISA法测定细胞因子的分泌。在RA患者的滑膜组织中Fn形成胞外瓜氨酸化聚合物。Fn诱导了RA-FLS的凋亡,cFn抑制了RA-FLS的凋亡。在RA患者的FLS中,Fn显着增加了caspase-3的表达,抑制了survivin和cyclin-B1的表达;cFn显著增加了survivin的表达,促进了TNF-α和IL-1的分泌。在RA的发生和发展过程中,cFn可能通过抑制细胞凋亡并且增加炎症因子的分泌来发挥其致病性。     

维甲酸调控线粒体途径对甲状腺滤泡状癌ASC的影响

目的:研究维甲酸(retinoic acid,RA)对甲状腺滤泡状癌细胞FIE-133ASC调控的影响,并探讨线粒体作用机制与凋亡相关斑点样蛋白(apoptosis-associated specklike protein containing a CARD,ASC)的关系.方法:应用噻唑蓝(MTT)比色法检测RA在不同时间(12、24、36、48h)下对甲状腺滤泡状癌细胞FIE-133存活率的影响,透射电镜观察细胞线粒体超微形态结构的改变,蛋白印迹法检测经RA作用前后ASC蛋白的表达.结果:RA对FIE-133细胞生长的抑制有时间依赖性,电镜下甲状腺滤泡状癌细胞线粒体结果发生剧烈改变,ASC表达明显增加.结论:RA对甲状腺滤泡状癌细胞FIE-133的生长具有抑制作用,这一抑制作用是由于线粒体凋亡通路调节ASC表达的影响使细胞凋亡功能得以恢复.     

类风湿关节炎患者滑膜组织和外周血CD4+T细胞的凋亡分析

类风湿关节炎 (RheumatoidArthritis ,RA)是一种累及全身多关节的自身免疫性炎症性疾病 ,其病理特征之一为炎性滑膜浸润大量CD4 + T细胞 ,滑膜细胞增生及血管翳形成 ,其机理仍未阐明。有学者认为RA的发病与细胞凋亡过程异常有关 ,并有多种细胞参与 ,包括滑膜细胞、成纤维细胞、淋巴细胞、软骨细胞等[1] 。本实验应用末端脱氧核苷酸转移酶介导的缺口末端标记法 (TUNEL)和流式细胞术 ,探讨细胞凋亡在RA发病机制中的作用。1　材料与方法1 1　标本　RA患者滑膜组织和外周血取自 8例RA病人 ,RA诊断根据 1987年美国风湿病学会(ACR)修订…     

RA诱导P19细胞神经分化过程中相关蛋白分子的表达变化

目的:研究维甲酸(retinoic acid,RA)诱导P19细胞神经分化过程中与增殖、分化及凋亡相关分子表达变化情况。方法:P19细胞经RA处理4 d后进行分化培养,对分化培养细胞用MAP2抗体进行免疫组织化学染色。在P19细胞分化前、后不同时间点,Western Blot检测细胞周期蛋白(Cyclin D、Cyclin E、Cyclin A、p-CDK2)、生长分化相关蛋白(E2F1、PCNA、GAP43)、MAGE家族蛋白(Necdin、MAGE D1、MAGE H1)及凋亡效应分子(激活型Caspase 3)表达变化情况。结果:RA可诱导P19细胞向神经元分化;Necdin、GAP43和MAGE D1在RA处理后明显上调并在分化过程中保持高水平表达。E2F1、Cyclin D和Cyclin E表达随分化进程呈现逐步升高趋势,而Cyclin A、p-CDK2表达逐步下调。MAGE H1在分化第4 d到达顶峰后下降。PCNA在RA处理4 d时表达下降至最低,在分化早期渐上调后又降至低水平。RA处理后激活型Caspase 3表达明显上调,但在随后分化过程中又下调至对照组水平。结论:RA诱导P19细胞向神经元分化过程中,与细胞生长、分化、增殖及凋亡相关蛋白呈现动态表达变化,为进一步研究这些分子在神经分化中的作用奠定了基础。     

共刺激分子与类风湿性关节炎患者T细胞的平衡失控

共刺激分子和凋亡受体CD95(Fas)分子的异常表达与T细胞的异常活化及其亚群平衡偏移密切相关，本研究拟通过对类风湿性关节炎(RA)患者T细胞亚群上表面CD30和CD95分子表达的检测，探讨细胞信号分子在参与RA免疫紊乱中的作用。     

类风湿关节炎发病机制的研究进展

类风湿关节炎 (RA)是一种以滑膜慢性炎症为主要表现的自身免疫性疾病 ,病因和发病机制尚不明确。本文从细胞因子、Th1/Th2细胞平衡、细胞凋亡、性激素和原癌基因与RA之间的关系阐述RA的发病机制     

迷迭香酸通过调控PI3K 通路诱导急性T 细胞白血病Jurkat细胞自噬和细胞凋亡

目的:探究迷迭香酸(RA)对急性T 细胞白血病Jurkat 细胞存活的作用及机制。方法:将细胞随机分为Jurkat 组、RA (5 μmol/ L) 组、RA (10 μmol/ L) 组和RA (20 μmol/ L) 组,分别用0、5、10 和20 μmol/ L 的RA 处理细胞,CCK8 检测培养不同时间的细胞增殖倍数,克隆形成实验检测细胞增殖,流式检测细胞凋亡,免疫印迹检测Beclin1、P62、LC3、p-PI3K、PI3K、p-Akt、Akt 和mTOR 的表达,免疫荧光检测LC3 的表达。结果:RA 处理细胞4 d 后,RA (5、10、20 μmol/ L) 组细胞增殖倍数与Jurkat 组比较明显降低,存活细胞数明显减少,细胞凋亡率明显升高;同时与Jurkat 组比较,RA (5、10、20 μmol/ L) 组细胞Beclin1 表达水平和LC3Ⅰ/ LCⅡ的比值明显降低,P62 表达水平明显升高,LC3 阳性表达与Jurkat 组比较也明显减少;此外,RA (5、10、20 μmol/ L) 还能显著降低p-PI3K/ PI3K、p-Akt/ Akt 的比值和mTOR 的表达水平。结论:RA 可诱导急性T 淋巴白血病Jurkat 细胞自噬和细胞凋亡,作用机制可能与抑制PI3K/ Akt 通路激活有关。     

中药成分BP对老年人淋巴细胞凋亡的调控作用

目的 :研究老年人淋巴细胞亚群及其细胞凋亡过程 ,探讨中药成分对细胞凋亡的调控作用。方法 :用间接免疫荧光技术检测淋巴细胞表型 ,用MTT法测定淋巴细胞增殖应答 ;用流式细胞仪及自动图像分析来检测细胞凋亡。结果 :老年人淋巴细胞比青年人淋巴细胞的增殖应答能力低 ,CD4 5RA 细胞亚群减少 ,而CD4 5RO 细胞亚群增多 ,后者易发生凋亡。而中药成分BP对老年人淋巴细胞凋亡有抑制作用。结论 :老年人淋巴细胞易感细胞凋亡 ,取决于活化 ,称为活化诱导性细胞死亡 ,此在免疫衰老中起着重要作用提示可以从中药开发细胞凋亡的调节药物。     

102 类风湿关节炎发病机制的研究进展

类风湿关节炎(RA)是一种以滑膜慢性炎症为主要表现的自身免疫性疾病,病因和发病机制尚不明确.本文从细胞因子、Th1/Th2细胞平衡、细胞凋亡、性激素和原癌基因与RA之间的关系阐述RA的发病机制.     

类风湿关节炎发病机制的研究进展

类风湿关节炎（RA）是一种以滑膜慢性炎症为主要表现的自身免疫性疾病，病因和发病机制尚不明确。本文从细胞因子、Th1/Th2细胞平衡、细胞凋亡、性激素和原癌基因与RA之间的关系阐述RA的发病机制。     

类风湿关节炎患者外周血淋巴细胞的凋亡及其意义

目的 研究类风湿关节炎(RA)患者外周血淋巴细胞的凋亡及其意义.方法 采用流式细胞术和激光共聚焦显微镜,检测35例RA患者和30例健康志愿者的外周血淋巴细胞抵抗凋亡的能力,包括分析新鲜分离和培养的淋巴细胞凋亡率及其与临床病情严重度的相关性.结果 两组间新鲜分离的淋巴细胞凋亡率差异无统计学意义[(2.63±1.47)%比(3.53±2.04)%,P＞0.05].活化淋巴细胞检测的结果显示,RA组的凋亡率明显低于对照组[(12.08±6.06)%比(18.66±7.27)%,P＜0.05],并与DAS28评分呈负相关(r=-0.617,P=0.008).结论 RA患者活化的外周血淋巴细胞出现凋亡缺陷,并与RA病情活动度相关.提示这些细胞募集到组织损害和自身免疫炎性反应进程异常的部位并对炎性反应进程的发展和维持起重要作用.     

类风湿关节炎患者外周血淋巴细胞的凋亡及其意义

目的研究类风湿关节炎(RA)患者外周血淋巴细胞的凋亡及其意义。方法采用流式细胞术和激光共聚焦显微镜,检测35例RA患者和30例健康志愿者的外周血淋巴细胞抵抗凋亡的能力,包括分析新鲜分离和培养的淋巴细胞凋亡率及其与临床病情严重度的相关性。结果两组间新鲜分离的淋巴细胞凋亡率差异无统计学意义[(2.63±1.47)%比(3.53±2.04)%,P>0.05]。活化淋巴细胞检测的结果显示,RA组的凋亡率明显低于对照组[(12.08±6.06)%比(18.66±7.27)%,P<0.05],并与DAS28评分呈负相关(r=-0.617,P=0.008)。结论RA患者活化的外周血淋巴细胞出现凋亡缺陷,并与RA病情活动度相关。提示这些细胞募集到组织损害和自身免疫炎性反应进程异常的部位并对炎性反应进程的发展和维持起重要作用。     

塞来昔布对类风湿关节炎大鼠肿瘤坏死因子-α信号通路及滑膜细胞的影响

目的:探讨塞来昔布对类风湿关节炎(RA)大鼠肿瘤坏死因子-α(TNF-α)信号通路及滑膜细胞的影响.方法:将大鼠分为正常对照组,建立RA模型(RA组),建立RA模型后灌胃塞来昔布(实验组),RA组及实验组大鼠建立RA大鼠模型,检测大鼠关节炎症指数后,通过多种方法检测病理、滑膜细胞凋亡、TNF-α蛋白水平及阳性表达.结果...     

青藤碱通过miR-23b-3p/FGF9诱导人类风湿关节炎成纤维细胞样滑膜细胞凋亡

目的:研究青藤碱(SIN)对人类风湿关节炎(RA)成纤维细胞样滑膜细胞(FLS)凋亡的影响及分子机制。方法:分离培养人RA FLS,用100 mg/L的脂多糖(LPS)处理记为LPS组;3.2 mmol/L SIN和100 mg/L LPS共同处理细胞,记为LPS+SIN组;不作任何处理的细胞作为空白(blank)组。将miR-con、miR-23b-3p、si-con和si-成纤维细胞生长因子9(FGF9)转染至RA FLS中再用100 mg/L LPS处理,分别记为LPS+miR-con组、LPS+miR-23b-3p组、LPS+si-con组和LPS+si-FGF9组;将anti-miR-con、anti-miR-23b-3p、pcDNA和pcDNA-FGF9转染至RA FLS中,再用3.2 mmol/L SIN和100 mg/L LPS共同处理,分别记为LPS+SIN+anti-miR-con组、LPS+SIN+anti-miR-23b-3p组、LPS+SIN+pcDNA组和LPS+SIN+pcDNA-FGF9组。CCK-8法检测细胞活力;集落形成实验检测细胞的集落形成数;Western blot法检测FGF9、cleaved caspase-3、Bax和Bcl-2蛋白水平;流式细胞术检测细胞凋亡;RT-qPCR检测miR-23b-3p和FGF9 mRNA的表达水平;双萤光素酶报告基因实验验证miR-23b-3p和FGF9的靶向关系。结果:SIN促进LPS诱导的RA FLS凋亡,抑制细胞增殖,上调miR-23b-3p表达,下调FGF9表达。miR-23b-3p靶向调控FGF9,过表达miR-23b-3p或沉默FGF9抑制LPS诱导的RA FLS增殖并促进细胞凋亡。干扰miR-23b-3p或过表达FGF9逆转了SIN对LPS诱导的RA FLS增殖和凋亡的影响。结论:青藤碱可通过miR-23b-3p/FGF9轴诱导RA FLS凋亡,抑制细胞增殖。     

PI3K-AKT信号通路及其在类风湿性关节炎滑膜细胞增殖和凋亡中的作用

PI3K-AKT信号通路是重要的细胞内信号转导通路,与类风湿性关节炎(RA)的发生发展密切相关。该信号通路的活化状态受到严密调控:包括负调控因子PTEN、SHIP和正调控因子TNF-α、TGF-β、TRAIL等。RA患者滑膜细胞中此信号通路处于异常激活状态,导致下游抗凋亡基因高表达并且影响下游多种效应分子,在RA患者关节滑膜细胞增殖和凋亡失衡中发挥关键作用。过度增生的滑膜细胞向关节软骨和骨组织浸润生长,导致患者关节畸形和功能障碍。因此,使用PI3K-AKT信号通路抑制剂或上调该信号通路中的内源性负性调节蛋白的表达可逆转RA滑膜细胞的过度增殖,为治疗此疾病提供新靶点。     

CsA通过抑制免疫突触的形成促进类风湿关节炎巨噬细胞的凋亡

目的:探讨免疫抑制剂环抱素A (CsA)对类风湿关节炎(RA)患者体内参与免疫突触形成的巨噬细胞凋亡的影响.方法:将人单核细胞株THP-1(human acute monocytic leukemia cell line)诱导分化的巨噬细胞经葡萄球菌肠毒素(staphylococcal enterotoxin B,SEB) ( 100μg/L)包被后与活化的Jurkat T细胞(human acute T-cell leukemia cell line)共培养促免疫突触形成,加或不加CsA(1 mg/L),置于无血清RP-M11640培养液诱导凋亡16 h后,以Annexin V-PI染色,用流式细胞术检测巨噬细胞的凋亡情况.临床收集10例健康对照及10例确诊活动期RA患者外周血,采用免疫磁珠法阴性分选CD4+T细胞并将其与诱导分化的巨噬细胞共培养,亦设加或不加人CsA(1 mg/L)组,研究CsA对免疫突触调控巨噬细胞凋亡作用的影响.结果:在细胞株、健康人及RA患者外周血由单核细胞诱导分化的巨噬细胞和CD4+T细胞相互作用形成免疫突触后巨噬细胞的凋亡率分别为(32.9±2.8)%,(24.7±1.6)%,(14.5%±1.2)%,较相应单独培养的巨噬细胞的凋亡率(61.4±2.4)%、(45.5土2.6)%、(22.9±1.5)%显著降低(P<0.05).而在加CsA组,细胞株来源的巨噬细胞及RA患者来源的巨噬细胞的凋亡率分别为(48.8 +2.0)%、(16.9土1.1)%,较相应参与免疫突触形成的巨噬细胞的凋亡率有所升高(P<0.05),而加人CsA对健康对照巨噬细胞凋亡率的影响差异无统计学意义.结论:RA患者外周血诱导分化的巨噬细胞参与免疫突触的形成后可显著抑制其凋亡率,而CsA能减弱突触对巨噬细胞的这一保护功能,起到促进巨噬细胞凋亡的作用,该结论为减少RA炎性因子的分泌、减弱关节破坏提供了有利的理论依据.