血管平滑肌细胞表型转化与心血管疾病

血管平滑肌细胞(vascular smooth muscle cells,VSMCs)具有高度的可塑性.生理状态下,VSMCs保持静止并表达一系列与收缩舒张相关蛋白,调节血管张力以维持局部和全身血压;在多种病理因素刺激下发生表型转化(phenotypic switching),即由分化型转变为去分化型.去分化型VSMC...     

内皮祖细胞对血管紧张素Ⅱ诱导的血管平滑肌细胞表型转化的影响

目的 观察内皮祖细胞对血管紧张素Ⅱ诱导的血管平滑肌细胞表型转化的影响.方法 采用6%羟乙基淀粉沉降法和密度梯度离心法分离人脐血单个核细胞,EGM-2细胞培养基进行培养,诱导单个核细胞贴壁向内皮祖细胞分化.采用荧光显微镜双染色、流式细胞术鉴定内皮祖细胞,间接免疫荧光检测血管平滑肌细胞标志物平滑肌α-肌动蛋白、钙调节蛋白的表达,采用逆转录聚合酶链反应和免疫印迹检测早期内皮祖细胞条件培养液、晚期内皮祖细胞条件培养液以及人脐静脉内皮细胞条件培养液对血管紧张素Ⅱ诱导的血管平滑肌细胞收缩表型标志基因平滑肌α-肌动蛋白以及合成表型标志基因骨桥蛋白表达变化的影响.结果 与对照组比较,血管紧张素Ⅱ(10-6mmol/L)诱导血管平滑肌细胞增殖48 h后,平滑肌α-肌动蛋白mRNA和蛋白表达明显减少,而骨桥蛋白mRNA和蛋白表达明显增加,提示血管平滑肌细胞从收缩表型向合成表型转化;与血管紧张素Ⅱ组比较,早期内皮祖细胞条件培养液、晚期内皮祖细胞条件培养液以及人脐静脉内皮细胞条件培养液处理后均不同程度抑制血管紧张素Ⅱ诱导的平滑肌α-肌动蛋白表达减少和骨桥蛋白表达增加,其中以早期内皮祖细胞条件培养液的抑制效果最明显.结论 内皮祖细胞能够抑制血管紧张素Ⅱ诱导的血管平滑肌细胞从收缩表型向合成表型转化.     

Myocardin在大鼠血管平滑肌细胞表型转化中的作用机制

目的探讨Myocardin在血管平滑肌细胞(VSMC)表型转化中的作用机制。方法采用细胞转染的方法使外源性Myocardin和SRF在培养的VSMC中过表达,应用RT-PCR、Western印迹及改良考马斯亮蓝染色法等方法检测转染后VSMC收缩型特异性标志基因的表达及细胞骨架的结构变化。结果当含有SRF和Myocardin编码基因的表达质粒共同转染培养的VSMC时,收缩型VSMC的标志基因SM22α和SM-α-actin的mR-NA和蛋白表达显著上调,而且促进VSMC细胞骨架的重构。而培养的VSMC单独转染SRF或Myocardin的表达质粒后,相关指标并无明显改变。结论外源性Myocardin和SRF的强制表达可以促进VSMC特异性标志基因的表达以及细胞骨架的重构,从而诱导处于增殖状态的VSMC进入静止期,并向收缩型转变。     

血管内皮细胞对平滑肌细胞表型转化的影响

目的分析共培养时大鼠血管内皮细胞(VECs)对大鼠血管平滑肌细胞(VSMCs)表型转化的影响。方法 VSMCs直接种植于培养板表面,VECs则种植于与VSMCs相对的浮胶底面。免疫荧光方法观察和鉴定VECs和VSMCs,RT-PCR和共聚焦显微镜分析表型相关基因的表达。结果原代培养的大鼠VECs呈铺路石样形态,vWF染色阳性。原代培养的大鼠VSMCs免疫荧光染色α-SMA呈阳性。RT-PCR检测结果表明,48h共培养组VSMCs的合成表型相关基因CRBP-1、Smemb的表达水平显著高于单独培养组,分别为1.4倍、1.5倍;72h达到峰值,分别为1.7倍、2.1倍,96h开始下降;共培养组中收缩表型标记物Smoothelin-B和SM-MHC的基因表达水平在48h、72h显著低于单独培养组,96hSmoothelin-B却高于单独培养组。单独培养组上述各基因的变化趋势不变或保持稳定。免疫荧光结果显示SM-MHC蛋白表达在共培养组中96h后从下降转为升高(P<0.05)。结论在共培养体系中,血管内皮细胞对血管平滑肌细胞表型转化的作用表现为先促进向合成型转化,96h后促进向收缩型转化。     

血管平滑肌细胞表型转化与血管钙化

血管钙化是一种由细胞所介导、主动的生物矿化过程,可增加心血管疾病的患病率和死亡率,并严重危害人类的健康和生活。越来越多的研究证实血管平滑肌细胞(Vascular smooth muscle cell,VSMC)及表型转化（phenotypic switching）在血管钙化的发生发展中具有重要作用。本文将阐述VSMC的表型转化,向骨/软骨化表型转化不同时期的标志蛋白分子,并探讨其表型转化的调控因素,进而深入认识血管钙化的发病过程。     

大鼠血管平滑肌细胞体外培养的表型转换及其鉴定

目的探讨体外传代培养对血管平滑肌细胞表型转换的影响,确认体外培养的血管平滑肌细胞不同表型的最佳指标。方法选择以未经培养传代的血管平滑肌细胞和体外培养的第4代血管平滑肌细胞作对比研究,采用免疫组织化学法检测血管平滑肌细胞α肌动蛋白,逆转录聚合酶链反应检测血管平滑肌细胞肌动蛋白22α、基质γ-羧基谷氨酸蛋白和骨桥蛋白各目的基因mRNA相对表达水平,透射电镜观察血管平滑肌细胞的形态学特征,确定其表型转换特征及各表型指标的区分效能。结果电镜观察显示,未经培养传代的血管平滑肌细胞胞质中肌丝分布丰富、均匀,并可见到收缩表型血管平滑肌细胞的典型结构—密斑,内质网、高尔基复合体等细胞器相对较少;而体外培养至第4代时血管平滑肌细胞胞质中肌丝明显减少,内质网、高尔基复合体明显增多。原代血管平滑肌细胞α肌动蛋白免疫组织化学染色强且广泛,而体外培养至第4代时α肌动蛋白染色明显变浅、稀疏。第4代血管平滑肌细胞的骨桥蛋白mRNA表达量较原代血管平滑肌细胞显著增高(P<0.01),肌动蛋白22α mRNA在血管平滑肌细胞中的表达量较原始血管平滑肌细胞降低,但差异不大,基质γ-羧基谷氨酸蛋白mRNA表达量较未经培养传代的血管平滑肌细胞升高(P<0.05)。结论血管平滑肌细胞体外培养至第4代,即可从典型的收缩表型转化为合成表型,提示血管平滑肌细胞是一种很容易去分化的细胞。电镜形态观察α肌动蛋白和骨桥蛋白在两型血管平滑肌细胞中的差异,可作为血管平滑肌细胞表型区分的有效标志。而肌动蛋白22α和基质γ-羧基谷氨酸蛋白的表达在两型血管平滑肌细胞中虽有一定的差异,但重叠较大。     

不同方法对血管平滑肌细胞表型特性影响的实验研究

目的 通过两种分离方法体外获取血管平滑肌细胞（VSMCs）,比较细胞表型差异及生物学特性,为血管性疾病研究提供精确实验基础.方法 分别采用组织块法及酶消化法获取SD大鼠胸主动脉VSMCs,分为组织块组与酶消化组.倒置显微镜、结晶紫染色观察形态学改变并定量分析;MTT比色法及TransweU细胞迁移实验分别检测分析细胞增殖与迁移活性;流式细胞周期测定细胞周期分布;细胞免疫荧光染色鉴定VSMCs并测定分析收缩型标记蛋白α-平滑肌肌动蛋白（SMA）以及合成型标记蛋白平滑肌胚胎型肌球蛋白重链（SMemb）、原肌球蛋白-4（TPM-4）表达量的变化.结果 两组细胞SMA细胞免疫荧光染色阳性率≥95％,细胞呈现谷峰状结构生长.组织块组与酶消化组两组细胞长径径值分别为（95.10±16.23）μm和（114.67±15.92）μm.与酶消化组相比,组织块组细胞增殖及迁移活性分别增加23.04％和1.54倍（P＜0.05）,S＋G2期所占比例增加49.68％（P＜0.05）,SMA蛋白表达量下降（P＜0.05）,SMemb及TPM-4蛋白表达均增加（P＜0.05）.结论 组织块法获取细胞多以合成表型为主,酶消化法则主要呈收缩表型.伴随细胞形态学、增殖及迁移活性、表型特异性蛋白表达等不同改变,两种细胞获取方法可为不同目的研究提供精确的体外模型.     

SRF和Myocardin在血管平滑肌细胞表型转化中的相互作用

目的 探讨SRF和Myocardin在血管平滑肌细胞(VSMC)表型转化中相互作用的机制.方法 采用免疫共沉淀和凝胶迁滞分析(EMSA)的方法检测不同表型的VSMC中SRF和Myocardin的相互作用以及SRF与其顺式元件相互结合的能力.结果 与传代培养处于去分化状态的VSMC相比,原代培养处于分化状态的 VSMC中SRF和Myocardin的相互作用明显增强,而且SRF与其顺式元件结合的能力显著提高.结论 SRF通过与Myocardin相互作用形成多蛋白复合体,即可有效地提高SRF与DNA调控元件即CArG-box的结合能力,启动肌特异性基因的表达,从而调控VSMC的表型转化.     

大鼠microRNA-145慢病毒表达载体的构建及其对血管平滑肌细胞表型转化的影响

目的构建针对Rno-miR-145的慢病毒表达载体并探讨其在血小板源生长因子(PDGF)诱导的血管平滑肌细胞(VSMC)表型转化中的作用。方法人工合成含有酶切位点粘端miR-145 shDNA双链模板序列,克隆于LV3 pGLV/H1/GFP+Puro-miRNA慢病毒穿梭载体中,转染293T细胞,收获并浓缩慢病毒颗粒,感染大鼠原代VSMC,倒置荧光显微镜下观察VSMC感染后的荧光表达情况,实时荧光定量PCR检测miR-145的表达情况;实验分为空白对照组、PDGF组、PDGF+miR-145组和细胞转染阴性慢病毒载体组(miR-NC组);采用实时荧光定量PCR测定miR-145对VSMC增殖相关基因PCNA、c-Jun及分化相关基因SM22αmRNA表达水平的影响。结果成功构建了microRNA-145慢病毒载体,测定病毒滴度为1×109TU/mL。倒置荧光显微镜下观察大鼠microRNA-145慢病毒表达载体感染成功,MOI值为50,感染72 h时感染率最高。实时荧光定量PCR结果显示PDGF可使PCNA、c-Jun表达增加,而使SM22α表达降低;miR-145可使PDGF诱导的去分化型VSMC增殖相关基因PCNA、c-Jun表达降低,分化相关基因SM22α表达增加。结论 miR-145慢病毒载体可高效感染大鼠原代VSMC。感染miR-145慢病毒后可抑制VSMC的表型转化。     

内皮细胞表型改变对平滑肌细胞表型转换及迁移的作用

目的　观察内皮细胞表型改变对平滑肌细胞表型转换及迁移的作用。方法　建立Transwell共培养体系 ,将内皮细胞和平滑肌细胞分别接种于下室和上室 ,检测不同内皮表型对平滑肌细胞表型基因α SM actinmRNA表达及迁移的影响。结果　与内参照相比 ,融合生长内皮使平滑肌α SM actinmRNA表达增加 ,而对数生长内皮细胞使平滑肌α SM actinmRNA表达明显减少。对照组平滑肌细胞在基础状态下存在少量迁移 ,对数增殖内皮细胞组平滑肌迁移数比对照组增高约 4倍 (P <0 0 1) ,而融合生长内皮细胞组平滑肌迁移数仅为对照组的 0 5倍 (P <0 0 5)。结论　内皮细胞表型不同 ,对平滑肌细胞生物学特性的影响也不同 ,增殖期内皮明显减少平滑肌细胞表型基因α SM actinmR NA的表达、促进平滑肌表型向合成型转换和迁移     

内皮细胞表型改变对平滑肌细胞表型转换及迁移的作用

目的观察内皮细胞表型改变对平滑肌细胞表型转换及迁移的作用.方法建立Transwell共培养体系,将内皮细胞和平滑肌细胞分别接种于下室和上室,检测不同内皮表型对平滑肌细胞表型基因α-SM-actin mRNA 表达及迁移的影响.结果与内参照相比,融合生长内皮使平滑肌α-SM-actin mRNA表达增加,而对数生长内皮细胞使平滑肌α-SM-actin mRNA表达明显减少.对照组平滑肌细胞在基础状态下存在少量迁移,对数增殖内皮细胞组平滑肌迁移数比对照组增高约4倍(P＜0.01),而融合生长内皮细胞组平滑肌迁移数仅为对照组的0.5倍(P＜0.05).结论内皮细胞表型不同,对平滑肌细胞生物学特性的影响也不同,增殖期内皮明显减少平滑肌细胞表型基因α-SM-actin mRNA 的表达、促进平滑肌表型向合成型转换和迁移.     

Production of Angiotensinogen by Cultured Rat Aortic Smooth Muscle Cells

This study was conducted to further investigate angiotensinogen synthesis in rat aortic smooth muscle cells (SMC) grown in culture. Tissue cultures maintained in defined medium neither grew nor synthesized angiotensinogen. However, in the presence of 5% homologous serum both cell proliferation and angiotensinogen synthesis became apparent. Substitution of normal control serum with that of bilaterally nephrectomized rats or animals given dexamethasone (10mg/kg, ip) led to a further significant increase in angiotensinogen production. In contrast, serum from adrenalectomized rats suppressed angiotensinogen synthesis below the rate observed with normal serum. A positive linear correlation (r=0.96, p0.01) was evident between the serum angiotensinogen level and the rate of de novo synthesis of this protein. No correlations were found between cell proliferation and either angiotensinogen synthesis or serum angiotensinogen levels. Dexamethasone added to serum did not stimulate the rate of angiotensinogen synthesis and appeared to inhibit cell proliferation. Stimulation or suppression of angiotensinogen synthesis was not accompanied by a statistically significant change in angiotensinogen specific mRNA. The data indicate a complex regulation of angiotensinogen in vascular smooth muscle cells in culture.     

Proliferative Effect of Insulin on Cultured Smooth Muscle Cells From Rat Mesenteric Resistance Vessels

The present study evaluates the growth promoting effect of insulin on the proliferative activity of cells from rat mesenteric arteries in culture in order to test the hypothesis that insulin may play a pathogenetic role in the hypertrophy of resistance vessels. The proliferative effect of insulin was studied in cultured vascular smooth muscle cells (SMC) obtained from two functionally different rat vessels: mesenteric arteries and aorta. Growth characteristics (cell number and growth rate) of mesenteric and aortic cells were determined after a quiescent period and followed-up for 24, 72, and 120 h after the addition of insulin. At all studied time intervals, aortic SMC exhibited a significatively higher cell number and specific growth rate than did mesenteric SMC. Aortic SMC also displayed a greater proliferation than did mesenteric SMC in the presence of 10% fetal calf serum (FCS). At a physiological concentration of 100 μU/mL, the proliferative effect of insulin, after a quiescent period, was seen only in aortic SMC, at 72 and 120 h. Higher insulin concentration (500 μU/mL) increased significantly the cell number in SMC of both arteries. The proliferative effect was significant at all studied periods for aortic SMC; however, in mesenteric SMC, insulin increased the cell number only at 72 and 120 h. The proliferative effect of insulin was observed on SMC obtained from functionally different arteries such as aorta and mesenteric, being greater in the former. The different behavior of these SMC in the presence not only of insulin, but also of 10% FCS, provides further evidence for the existance of intervascular heterogeneity. The mild stimulatory effect of insulin in vitro may contribute in this way to the vascular hypertrophy of pathological entities exhibiting hyperinsulinemia.     

反义c-jun表达质粒对血管平滑肌细胞表型转化标志的影响

为研究c-jun反义RNA对血管平滑肌细胞表型转化的影响,本文应用可表达c-jun反义RNA的真核细胞表达载体转染大鼠血管平滑肌细胞,采用Northern印迹、Westem印迹和氚标胸腺嘧啶核苷掺入实验,观察反义c-jun对血管平滑肌细胞表型标志基因平滑肌α-肌动蛋白、平滑肌胚胎型肌球蛋白重链和骨桥蛋白表达和DNA合成的影响。结果发现,在血管平滑肌细胞中表达的c-jun反义RNA可使血管平滑肌细胞去发化标志基因平滑肌胚胎型肌球蛋白重链和骨桥蛋白mRNA表达较对照分别下降50％和95％,骨桥蛋白水平较对照下降75％,同时血管平滑肌细胞的DNA合成受到显著抑制,实验组氚标胸腺嘧啶核苷掺入值对照降低37％。c-jun反义RNA对血管平滑肌细胞分化标志基因平滑肌α－肌动蛋白的表达无明显影响。提示c-jun基因表达产物在维持血管平滑肌细胞于去分化状态中起重要作用。     

肝素对大鼠血管平滑肌细胞同型半胱氨酸诱导的基质金属蛋白酶-2表达的影响

目的研究肝素对大鼠血管平滑肌细胞同型半胱氨酸诱导的基质金属蛋白酶一2（MMP-2）表达的影响。方法利用免疫印迹法和明胶酶谱分析法研究大鼠血管平滑肌细胞中不同浓度的同型半胱氨酸（0～1000umol／L）及不同浓度的肝素（0～1D0ug／m1）对MMP-2表达的影响。结果同型半胱氨酸的浓度在50umol／L、100umol／L、500umol／L、1000umol／L时,MMP-2分别为1．32±012、1．65±0．17、2．48士0．21、2．71±0．24,MMP-2的表达可随同型半胱氨酸浓度的增高而显著增加;作用72hMMP-2的表达与24h和48h比,差异有显著统计学意义（P〈0．01）。在细胞外加入肝素后同型半胱氨酸对MMP-2表达的诱导增强作用可被抑制,当肝素浓度为1．0umol／L、10．Oumol／L、50．0umol／L、100．0umol／L时,MMP-2浓度分别为2．17±0．19、1．67±0．14、1．34±0．14、0．65±0．04。结论大鼠血管平滑肌中同型半胱氨酸可增加MMP-2的表达。细胞外加入肝素可抑制此作用。高同型半胱氨酸血症与动脉粥样硬化发生相关;肝素可防止动脉粥样硬化的发生,对血管具有保护作用。     

同型半胱氨酸抑制培养的大鼠血管平滑肌细胞牛磺酸转运

为了研究同型半胱氨酸对血管平滑肌细胞牛磺酸转运的影响 ,采用培养的大鼠血管平滑肌细胞和3 H标记的牛磺酸 ,并测定血管平滑肌细胞牛磺酸转运。实验发现 ,同型半胱氨酸呈浓度依赖性抑制血管平滑肌细胞转运牛磺酸 ,1 0 0 μmol L和 50 0 μmol L同型半胱氨酸组血管平滑肌细胞牛磺酸转运的最大速率 (Vmax)较对照组分别降低 31 % (P <0 .0 5)和 51 % (P <0 .0 1 ) ,但组间Km值无显著差异 ;5mmol LH2 O2 亦抑制血管平滑肌细胞牛磺酸摄入 ,Vmax较对照组降低 48% (P <0 .0 1 ) ,但Km值增加 45 % (P <0 .0 1 ) ,其转运效率 (Vmax Km)较 50 0 μmol L同型半胱氨酸组更低 (3 .72± 0 .32比 5 .33± 0 .69,P <0 .0 1 )。 2 0mmol L牛磺酸和 50 0 μmol L同型半胱氨酸同时孵育 ,血管平滑肌细胞牛磺酸转运较 50 0 μmol L同型半胱氨酸组增加 ,Vmax增加 35 % (P <0 .0 5) ,两组间Km值亦无显著差异 ,转运效率增加 40 % (P <0 .0 5)。结果提示 ,同型半胱氨酸抑制血管平滑肌细胞牛磺酸转运 ,其机制不能用同型半胱氨酸产生过氧化物来解释 ,外源性给予牛磺酸可拮抗同型半胱氨酸抑制血管平滑肌细胞牛磺酸转运障碍     

多沙唑嗪抑制大鼠血管平滑肌细胞增殖的实验研究

为探讨多沙唑嗪对大鼠血管平滑肌细胞增殖的抑制作用。将不同浓度的多沙唑嗪作用于体外培养的血管平滑肌细胞，采用氚-胸腺嘧啶核苷（^3H-TdR)掺入的方法检测平滑肌细胞的增殖。结果发现，多沙唑嗪能够抑制血管平滑肌细胞和不表达α1受体的成纤维细胞的增殖，用不可逆的α1受体阻滞剂酚苄明处理平滑肌细胞，多沙唑嗪仍表现为抑制增殖的作用。以上提示，多沙唑嗪对大鼠平滑肌细胞增殖的抑制作用与其对α1受体的阻滞作用无关。     

血管损伤影响离体平滑肌细胞增殖与钙稳态有关

本实验采用球囊剥脱术在体损伤血管，于术后３天和１０天取出血管做平滑肌细胞培养。结果发现，血管损伤后血管平滑肌细胞增殖活性显著增加，ＤＮＡ和蛋白质合成加速，细胞数目增多。在血管平滑肌细胞增殖过程中，钙内流增加，胞内钙含量升高。应用１０μｍｏｌ·Ｌ￣（－１）异搏定不但对钙稳态变化有一定的抑制作用，而且还对血管损伤诱导的平滑肌细胞增殖有抑制作用。这些结果提示血管损伤可致血管平滑肌细胞增殖；钙稳态失衡可能是血管损伤诱导血管平滑肌细胞增殖的细胞学机制之一。