神经营养素-4及其受体的研究进展

神经营养素-4(NT-4)作为神经营养素家族的新成员,与其他家族成员-神经生长因子(NGF),脑源性神经生长因子(BDNF),神经营养素-3(NT-3),神经营养素-5(NT-5),神经营养素-6(NT-6)一起对神经元的生存及发育起重要作用。近来的研究结果显示,它在基因结构,氨基酸序列,生理功能等方面与其他家族成员相比有进化的保守性,又有自己进化的特殊性。它在哺乳动物体内有广泛表达,通过低亲和力NGF受体(P75~(LNCFR)),高亲和力trkA受体,高亲和力trkB受体发挥作用。NT-4在神经退行性疾病中的临床应用价值也在研究中。     

体外培养神经干细胞PDGF、EGF和GDNF的表达

目的为研究体外培养小鼠神经干细胞（NSC）血小板源性生长因子（PDGF）、表皮生长因子（EGF）和胶质细胞源性神经营养因子（GDNF）的基因表达.方法取小鼠胚胎海马NSC培养并鉴定,提取其总RNA,用RT-PCR技术检测培养NSC内PDGF、EGF、GDNFmRNA的表达.结果培养NSC中PDGF mR-NA表达最强,EGF mRNA明显表达,但几乎未检测到GDNF mRNA.结论为了解NSC分泌神经营养因子发挥生物学作用提供了理论基础.     

NGF、BDNF和NT-3在鸡胚脊髓发育中的表达变化

目的 探讨神经生长因子(NGF)、脑源性神经营养因子(BDNF)和神经营养因子3(NT-3)在鸡胚脊髓发育中的表达变化.方法 对发育第7 d(E7)和第14 d(E7)鸡胚腰段脊髓用NGF、BDNF和NT-3抗体进行免疫组化和Western blot检测.观察NGF、BDNF、NT-3在脊髓两时相的分布和含量变化.结果 脊髓发育第7 d,NGF仅在腹侧白质表达,BDNF阳性细胞主要分布于脊髓腰段腹角神经元的核周质及神经突起内,而NT-3阳性细胞则分布于腹角前外侧群神经元;脊髓发育至第14 d,不但白质NGF表达进一步增强,脊髓灰质内亦出现少量NGF阳性细胞,尤其是背角细胞可见强的NGF表达;BDNF除腹角染色外,也扩展至整个背角神经元及神经突起,并出现一些BDNF阳性胶质细胞;NT-3除分布于腹角前外侧群神经元外,中间带、背角内亦出现了一些NT-3阳性神经元.Western blot进一步证明上述3种因子的表达量均随发育进程增强,尤以BDNF为甚,其E14的表达量约为E7的2.7倍.结论 NGF、BDNF和NT-3在脊髓的表达随发育进程由腹角向背角扩展,且表达量逐渐升高.提示,NGF、BDNF和NT-3可能与促进脊髓的发育有关.     

人巨细胞病毒诱导分化中的神经干细胞分泌神经生长因子前体

目的 研究人巨细胞病毒(human cytomegalovirus, HCMV)感染对人神经干细胞(neural stem cells,NSC)向星形胶质细胞分化过程中神经生长因子(nerve growth factor, NGF)及其受体p75NTR、trkA表达的影响,为阐明HCMV感染致NSC损伤的分子机制提供理论依据.方法 体外培养人海马NSC,感染组以感染复数(multiplicity of infectin,MOI)为5的HCMVAD169株感染NSC,对照组只加入与病毒悬液等体积的培养液,在感染病毒的同时,诱导感染组和对照组NSC向星形胶质细胞分化,分别在感染后0、1、3、5、7、9d收获细胞,用RT-PCR、免疫荧光和Western blot方法检测细胞内NGF及其受体p75NTR、trkA的转录水平和蛋白表达水平.结果 对照组NSC不表达NGF及其受体P75NTR和trkA.感染组细胞在第3天开始出现NGFmRNA的表达,第5天出现P75NTR mRNA的表达,且其表达强度随时间增强;第5天出现相对分子质量为40000和100000NGF前体蛋白(ProNGF)和P75NTR蛋白,随时间延长,表达强度升高.免疫荧光检测显示,NGF前体蛋白位于细胞的细胞质;整个感染过程中未检测到trkA的表达.结论 HCMV感染可诱导向星形胶质细胞分化的海马NSC分泌NGF前体蛋白及其受体p75NTR.     

NGF、BDNF和NT-3在背根节卫星细胞的表达

目的：观察神经因子（NGF）、脑源性神经营养因子（BDNF）和神经营养因子－3（NF－3）及其mRNA在成年猫背根节（L6）卫星细胞的表达情况。方法：成的雄猫5只，随机取一侧的L6背根节（DRG）制作20μm厚冰冻切片，行免疫组化及原位杂交染色。观察NGF、BDNF和NT－3及其mRNA在DRG卫星细胞的分布以及亚细胞定位。结果：在正常DRG，可见NGF、BDNF和NT－3及其mRNA阳性卫星细胞。各因子mRNA的阳性反应物定位于胞质。BDNF－IR定位于胞质，而NGF－IR和NT－3－IR则定位于胞核。结论：背根节部分卫星细胞内有NGF、BDNF和NT－3及其mRNA的分布，BDNF和NGF、NT－3亚细胞定位的不同提示成年猫背根节卫星细胞内不同生长因子发挥作用的机制可能不同。     

神经营养因子对体外培养多巴胺能神经元营养作用比较研究

目的：比较5种神经营养因子对体外培养多巴胺能（DA）神经元营养作用差别。方法：在培养孕14－16d大鼠胚胎黑质神经元中加入5种神经营养因子（NTF）。采用免疫组化染色及计算机图像的分析系统对培养细胞进行观察。结果：脑源性神经营养因子（BDNF）、血小板源性生长因子（PDGF）及碱性成纤维细胞生长因子（bFGF)能促进中脑DA神经元发育,提高神经元及长突起神经元存活率。BDNF在整个培养期都有较强营养作用,PDGF在早期、bFGF在中期有轻度作用,神经生长因子（NGF）和白细胞介素－6（IL－6）则无作用。结论：体外DA神经元培养过程中,BDNF有较强的神经营养作用,PDGF和bFGF次之,NGF和IL－6无作用。     

新生大鼠海马神经干细胞的体外培养及鉴定

目的探讨新生大鼠海马神经干细胞（NSC）的体外培养和诱导分化的条件和特点。方法分离出生1d大鼠海马,在表皮生长因子、碱性成纤维生成因子和B27联合作用下使其稳定增殖,用5-溴脱氧尿苷（BrdU）标记处于增殖状态的神经干细胞,应用免疫荧光染色方法行巢蛋白（Nestin）、5-溴脱氧尿苷（BrdU）、β-Ⅲ型微管蛋白（Tuj-1）、波形蛋白（Vimentin）和Galc-C免疫荧光染色,对NSC的增殖及其分化的细胞进行鉴定。结果体外培养的NSC增殖成神经干细胞球并传代,鉴定为Nestin染色阳性细胞和5．溴脱氧尿苷（B枷）标记染色阳性细胞,并可诱导分化为神经元细胞（Tuj-1染色阳性细胞）、神经胶质细胞（Vimentin染色阳性细胞）和少突胶质细胞（Galc-C染色阳性细胞）。结论采用无血清培养基中加入特定生长因子的培养技术,可培养出在体外稳定增殖并有多向分化潜能的新生大鼠海马NSC。     

神经营养素-3基因转染神经干细胞的实验研究

目的：用神经营养素-3（NT-3）基因修饰神经干细胞,并观察在转染后的神经干细胞内的表达情况,为进一步的研究奠定基础。方法：采用阳离子脂质体介入法,将含绿色荧光蛋白（GFP）基因的重组腺病毒表达载体pAd—NT—3转染原代培养的神经干细胞,观察GFP及NT-3两种蛋白的表达,镜下测定转染率,采用免疫组化和逆转录酶-多聚酶链反应（RT-PCR）方法进行鉴定。转染后的神经干细胞经G418筛选,获得成功转染NT-3基因的NSCs克隆。结果：镜下观察到绿色荧光蛋白长期表达在转染后的神经干细胞,转染率可达40％。免疫组化和RT-PCR结果显示NT-3在转染后的神经干细胞可以长期表达。结论：NT-3基因,通过腺病毒的介导,以阳离子脂质体为载体,可有效的转染培养的神经干细胞并长期表达。     

抗抑郁药对正常大鼠脑内脑源性神经营养因子和神经营养因子3及其受体表达的影响

目的 探讨3种不同类型抗抑郁药对脑源性神经营养因子(BDNF)、神经营养因子3(NT-3)及其功能性受体TrkB/C在抗抑郁效应及抑郁症病理过程中可能的作用.方法 正常成年SD大鼠48只随机分成8组,分别给予氟西汀、丙米嗪、吗氯贝胺和作为对照的生理盐水处理,每个处理组按给药持续时间再分为短程(10d)和长程(28 d)组.采用免疫组化和逆转录聚合酶链反应检测部分脑区BDNF/TrkB,NT-3/trkC蛋白和信使核酸(mRNA)表达水平.结果 ①与对照组相比,短期给予抗抑郁药即可影响BDNF蛋白表达改变(P<0.05),不同类型药物影响的部位有所不同.长期给药表达明显增强(P<0.05)部位增多,TrkB表达也受明显调节(P<0.05).NT-3表达较局限,短期给药下丘脑表达水平被上调(P<0.05),长期给药杏仁核与下丘脑均有明显增强(P<0.05).TrkC仅在长期用药后海马的阿蒙角表达增强(P<0.05).⑦短期给药BDNF/TrkB与NT-3/TrkC mRNA表达水平未见明显变化(P>0.05).长期给药后海马BDNF/TrkB与NT-3/TrkC mRNA,杏仁核BDNF与NT-3受到明显上调(P<0.05);下丘脑处BDNF mRNA表达水平被下调,丙咪嗪组明显(P<0.05),下丘脑处TrkB与NT-3 mRNA接受长期抗抑郁药上调(P<0.05),TrkC mRNA表达水平未见明显改变(P>0.05).结论 抗抑郁药可调节相关脑区BDNF/TrkB,NT-3/trkC蛋白与核酸两个不同水平的表达变化,不同类型的药物影响的部位不完全一致,配体与受体变化也有差异,显示神经营养素家族在不同抗抑郁药物的临床效应以及抑郁症病理过程存在一定模式.     

树突状细胞通过NT-3/TrkC信号通路调控神经干细胞存活的体外研究

目的 研究共培养状态下树突状细胞(dendritic cell,DC)对神经干细胞(neural stem cell,NSC)存活的影响及其作用机制.方法 体外分离、纯化SD大鼠原代DC和NSC,将二者用Transwell技术共培养,用NT-3特异性抗体中和NT-3的表达;然后采用qRT-PCR方法检测DC中神经营养素-3(neurotrophin-3,NT-3)的mRNA水平,流式细胞术检测NSC凋亡;同时用免疫荧光、Western blot技术确定NSC表面NT-3特异性受体TrkC的表达.结果 与DC单独培养组相比,共培养体系中,DC表达NT-3水平显著性增强(P＜0.05);同时共培养能显著增加NSC存活,该效应能被NT-3特异性中和性抗体阻断;共培养能够增加NSC中NT-3特异性受体TrkC表达(P＜0.05),并上调TrkC磷酸化水平,而NT-3特异性抗体能够抑制TrkC表达和磷酸化上调(P＜0.05).结论 DC和NSC共培养能够增加DC中NT-3表达,高表达的NT-3则通过NSC膜上的TrkC受体促进NSC的存活.     

RT-PCR检测R2L1细胞中Trk受体家族基因的表达

在Trk受体家族基因的非同源区中分别设计对TrkA，TrkB和TrkC受体基因特异的引物，采用RT－PCR法检测大鼠小脑神经细胞系R2和转染并表达了神经营养因子低亲和力受体p75NTR的R2细胞系R2L1细胞中Trk受体家族基因的表达，琼脂糖凝胶电泳分析RT－PCR产物表明，TrkA和TrkB受体基因在R1和R2L1细胞中均有表达，而无TrkC受体基因的表达。测序结果进一步证实了RT－PCR的结果，表明本方法能准确地检测Trk受体家庭基因的表达。     

The spatiotemporal change of neurotrophin family and their mRNA expression in spinal cord of cats after partial rhizotomy]

OBJECTIVE: To investigate the spatiotemporal change rule of NGF, BDNF, NT-3 and their mRNA expression in spinal cord of cats after partial dorsal rhizotomy. METHODS: Rhizotomy of unilateral L1-L5, L7-S2 dorsal roots of cats was performed, leaving L6 as a spared dorsal root. By using ABC immunohistochemistry and in situ hybridization techniques, the dynamic changes of the above three factors and their mRNA in spinal lamina II of different segments were analysed. RESULTS: 1. In normal cat, NGF and it's mRNA were detected in part of neurons; BDNF, in nerve fiber terminals, varicosities and neurons; NT-3, in part of neurons, neuroglias and few nerve fiber terminals and varicosities. The mRNAs of the later two were negative. 2. The population of NGF and NGGmRNA positive neurons, NT-3 positive neurons and neuroglias increased significantly 3d-5d after rhizotomy. However, the quantity and density of positive varicosity of BDNF decreased. At 10-11d, the population of NGF and NGF mRNA positive neurons was still on the high level as that at 3-5d, and that of NT-3 began to decrease; the quantity of BDNF recovered to normal except for L, segment, but the density of positive varicosity of BDNF did not yet. The mRNAs of BDNF and NT-3 were still negative. 3. The change of each factor varied with the segments. The highest level time of NGF was earlier in L5, L6 than in L3; the recovery of the quantity of BDNF was the latest in L7; the change of NT-3 positive neuroglia was the same at each segment, but the number of NT-3 positive neuron in L5, L7 returned to normal at 10-11d, and that of L3 did not. CONCLUSION: The three factors all play roles in spinal plasticity after partial rhizotomy, but they function at different time phase and last different time length.     

低强度脉冲超声对雪旺细胞增生及NT-3基因表达的影响

目的研究培养的雪旺细胞在低强度脉冲超声(low-intensity pulsed ultrasound,LIPUS)直接作用下,对细胞增生、NT-3及脑源性神经生长因子(BDNF)mRNA表达的影响。方法取新生1-3dWistar大鼠坐骨神经,经过酶消化分离雪旺细胞,培养在6孔板上。每天给予超声频率1MHz及声强(SATA)0.1W/cm25min连续刺激,持续14d。对照组除不给予超声刺激外,其他条件与实验组相同。采用5-溴-2-脱氧尿嘧啶实验(BrdU摄入实验)检测细胞增生率的变化,免疫组化及RT-PCR实验检测细胞因子的变化。结果免疫组化结果显示,分离的雪旺细胞标记物S-100鉴定98%以上阳性。BrdU摄入实验发现受超声刺激的细胞在培养第4,7,10,14天细胞增生率较对照组增高,其中前3个时间点差异具有统计学意义。在刺激第14天,实验组NT-3mRNA水平较对照组有显著上调,NT-3/β-actin比值分别为0.56±0.13和0.41±0.09(n=6,P<0.05)。而BDNF水平实验组较对照组显著下调,BDNF/β-actin比值分别是0.51±0.05和0.60±0.08(n=6,P<0.05)。免疫细胞化学证实2组雪旺细胞NT-3及BDNF均有超过98%的阳性率,但表达强度不同。结论给予低强度脉冲超声刺激可促进培养的雪旺细胞增生及神经生长因子表达的改变,本研究为低强度脉冲超声的应用提供了理论依据。     

腺病毒载体Ad-BDNF-EGFP的构建和在神经干细胞中的表达

目的研究腺病毒载体Ad-BDNF-EGFP的构建及其在神经干细胞(NSCs)中的表达。方法通过RT-PCR从大鼠海马中获得BDNF基因,通过基因克隆、HEK293包装,获得含增强绿色荧光蛋白基因的重组腺病毒表达载体pAd-BDNF-EGFP,将其感染原代培养的神经干细胞,观察EGFP及BDNF2种基因的表达,镜下测定转染率,并检测RT-PCR产物,证实BDNF的存在。转染后的神经干细胞经G418筛选,抗性细胞传代扩增后获得成功转染BDNF基因的NSCs克隆。结果荧光显微镜下可见感染后的NSCs表达EGFP而发出绿色荧光;通过RT-PCR证明感染后的NSCs具有表达BDNF的能力;用ELISA鉴定细胞上清中分泌的BDNF,72h的含量达到最高值,为12.78ng/mL;证明通过构建病毒的感染可以使神经干细胞获得分泌BDNF的能力,且EGFP基因可作为神经干细胞移植研究中良好的示踪剂。结论腺病毒病毒介导EGFP基因及BDNF基因在大鼠胚胎神经干细胞中成功表达,为应用以神经干细胞直接作为基因靶细胞,介导基因治疗中枢神经系统疾病奠定了基础。     

神经生长因子及其受体在哮喘大鼠肺组织的变化以及对气道炎症的影响

目的：探讨神经生长因子（NGF）和其受体酪氨酸激酶受体A (trkA)和总神经营养因子受体( p75)变化对哮喘大鼠气道炎症的影响。方法：通过鸡卵蛋白致敏激发建立哮喘模型,并将32只SD大鼠随机分为4组：正常对照组、哮喘组、外源性NGF干预组（NGF组）及抗NGF抗体干预组（抗NGF组）。各组测定支气管肺泡灌洗液(BALF)总细胞及细胞分类计数,并行支气管肺组织切片HE染色观察病理改变;通过逆转录-聚合酶链反应（RT-PCR）半定量检测哮喘组和对照组肺组织NGF mRNA,4组肺组织trkA和p75 mRNA表达变化。结果：哮喘组与对照组比较,BALF总细胞计数、嗜酸性粒细胞（Eos）计数及淋巴细胞（Lym）计数显著增多（均P<0.001）,支气管肺组织炎症表现显著;肺组织NGF mRNA及trkA和p75 mRNA表达明显增强（均P<0.01）;哮喘组NGF mRNA与BALF细胞总数、Lym数呈正相关（均P<0.001）。NGF组与哮喘组比较,BALF总细胞、Eos及Lym计数均显著增多（均P<0.01）,支气管肺组织炎症表现更为显著,p75和trkA mRNA表达明显增强（均P<0.05）。抗NGF组与哮喘组比较,BALF总细胞、Eos及Lym计数显著减少（均P<0.001）,支气管肺组织炎症表现显著减轻,p75和trkA mRNA表达明显减弱（均P<0.01）。结论：致敏哮喘大鼠肺组织内NGF mRNA表达水平显著增高,并与气道炎症密切相关;NGF上调trkA和p75 mRNA表达,从而增强NGF的功能效应,共同参与哮喘的气道神经源性炎症。     

星形胶质细胞条件培养液影响神经干细胞突触形成的神经营养机制探讨

目的 探讨神经营养素家族蛋白[包括脑源性神经营养因子(BDNF),神经生长因子(NGF),神经营养素-3(NT-3)]是否参与星形胶质细胞条件培养液(ACM)影响神经干细胞(NSC)突触形成的过程.方法 实验分两步,(1)PC12细胞分别经10μg/ Aβ1-4诱导不同时间点(0、4、612、24 h)后分为两部分,一部分应用流式细胞技术检测不同时间点PC12细胞凋亡率,另一部分别与星形胶质细胞共育2 d,将收集的ACM分为两部分,一部分应用ELISA法检测ACM中的BDNF、NGF、NT-3蛋白含量.(2)将另一部分ACM以1:3比例同DMEM/F12培养基混合,分别对胚胎大鼠皮质神经干细胞进行诱导分化,激光共聚焦扫描显微镜观察突触素和生长相关蛋白-43(GAP-43)表达,透射电镜观察成熟突触结构数目.结果 在AB1-40作用6 h时间点,PC12细胞凋亡率达高峰(P<0.05);星形胶质细胞与Aβ1-40诱导6 h后的PC12细胞共育2 d后,收集到ACM中的BDNF蛋白总量(A值=1.53±0.25)明显增高(P<0.05),并且收集到的ACM诱导神经干细胞突触素(A值=33.39 4±2.71)、GAP-43(A值=49.18±6.45)表达明显升高、成熟突触结构数目(4.70±0.52个/视野)明显增多,与其他组比较,差异有统计学意义(P<0.05).结论 星形胶质细胞与AB1-40枷诱导凋亡的PCI2细胞共育后,ACM提高了神经干细胞突触形成,ACM中BDNF可能参与了这一过程.     

大鼠脊髓横断损伤后不同时间神经营养素表达的变化

目的:探讨大鼠脊髓全横断后不同时间神经营养因子表达的变化。方法:30只成年健康SD大鼠,随机分为正常组(手术对照组)和脊髓全横断1d、3d、7d、14d、21d组,共6组,每组5只。采用免疫组织化学ABC法结合图像灰度分析法,检测脊髓全横断后各组神经生长因子(NGF)、脑源性神经营养因子(BDNF)和神经营养素-3(NT-3)表达的变化。结果:脊髓全横断后手术对照组NGF、BDNF、NT-3的表达较少,损伤后表达明显增加,NGF、BDNF和NT-3在损伤后1-7d表达的阳性细胞数逐渐增加,与对照组比较差异有显著性(P<0.01),7d达到最高;NGF和NT-3的高表达一直维持到21d,而BDNF在损伤后14d恢复到正常。结论:在脊髓横断损伤中,神经营养因子NGF、BDNF和NT3的表达增加,可能起着保护作用。