两段法培养适合临床移植应用的黑素细胞的安全性研究

目的：探讨使用两段法培养黑素细胞，以消除佛波醇酯(TPA)的致瘤危险，增加培养细胞的安全性，从而适合临床移植的需要。方法：两段法培养黑素细胞：先用含TPA培养液培养纯化黑素细胞，然后用不含TPA的培养基继续扩增传代。通过细胞形态、生长特性、细胞周期等检测观察有无TPA时培养细胞的特性。接种裸鼠检测培养细胞的致瘤性。结果：用含TPA培养液容易获得纯化的黑素细胞；扩增传代时改用不含TPA的培养基，黑素细胞由细长的多分支逐渐变成两极的宽梭形。生长速度略微减慢，细胞周期显示增殖减缓。裸鼠致瘤实验阴性。结论：两段法培养黑细胞成功率高，和以往培养基中含TPA的培养方法相比，所培养黑素细胞形状变化明显，生长减慢，用于临床移植时更加安全。     

经裸鼠体内多次传代所致的高致瘤HL-60细胞模型的建立及其细胞生物学特征

本研究探讨裸鼠体内多次传代的高致瘤性HL-60细胞的生物特性的变化,探索高致瘤性HL-60细胞致瘤率提高的机制。用裸鼠体内和体外传代方法建立高致瘤性白血病细胞系HL-60模型,并对其生物特性改变进行比较。用台盼蓝染色法检测HL-60细胞生长水平,流式细胞术分析细胞周期,电子显微镜观察HL-60细胞的超微结构和荧光水平。结果表明:细胞生长速度加快,细胞群体倍增时间缩短;S期细胞比率有上升的超势。细胞线粒体数目显著下降(p0.01),且多数内室扩张,嵴数目减少,有的空泡化;细胞微丝荧光减弱,差异显著(p0.01);克隆形成率有明显的增加。结论:裸鼠体内多次传代的HL-60细胞高致瘤性与致瘤细胞增殖能力增强,细胞中线粒体数目与结构的改变和细胞骨架微丝的变化有关。     

人羊膜间充质干细胞移植对荷瘤鼠C6胶质瘤生长的抑制

背景:实验室前期课题成果显示,脐血或羊膜间充质干细胞具有亲肿瘤及抑瘤特性。目的:探讨人羊膜间充质干细胞对C6胶质瘤细胞生长的抑制作用。设计、时间及地点:细胞学体内对照观察,于2008-06/09在郑州大学微生物与免疫教研室完成。材料:胎盘来源于郑州大学一附院妇产科健康剖宫产产妇,C6胶质瘤细胞株由北京神经外科研究所惠赠,10只BALR/c裸鼠由上海斯莱克实验动物有限责任公司提供。方法:无菌条件下取胎盘,分离部分羊膜,体外分离培养人羊膜间充质干细胞,传至第3代用于实验。10只裸鼠背部双侧皮下注射含3×106个C6胶质瘤细胞的DMEM/F12培养基,建立双侧荷瘤鼠模型。成功造模后,模型对照组于裸鼠左侧皮下注射DMEM/F12培养基50μL,细胞移植组于同一裸鼠右侧皮下注射含2×106个羊膜间充质干细胞的等量DMEM/F12培养基。主要观察指标:肿瘤生长情况,周围组织浸润及新生血管形成等病理学观察,免疫组化法检测肿瘤中细胞周期素D1的表达。结果:细胞移植后14,21d,细胞移植组肿块体积明显小于模型对照组(F=54.127,P<0.05)。模型对照组瘤体呈结节状,部分肿瘤组织中心有坏死现象,内部有新生血管形成,肌层及皮肤浸润较明显,已达腹膜;细胞移植组瘤体分叶较少,无新生血管形成,仅有局部的皮肤浸润,未见肌层浸润。模型对照组细胞周期素D1蛋白呈阳性表达,而细胞移植组表达阳性率较低。结论:人羊膜间充质干细胞可明显抑制荷瘤鼠C6胶质瘤细胞的生长,同时可抑制细胞周期素D1蛋白的异常表达。     

梯度血清递减体外培养人脐带间充质干细胞

背景：人脐带间充质干细胞的扩增与培养条件密切相关,而含体积分数10%-20%胎牛血清的培养基可促进细胞生长。目的：建立梯度血清递减扩增培养脐带间充质干细胞的培养技术。方法：采用胶原酶Ⅱ消化分离获得脐带间充质干细胞悬液,并通过贴壁培养进行纯化,细胞贴壁后采用梯度血清递减方法,即第1代80%含血清培养基,20%无血清培养基;第2代50%含血清培养基,50%无血清培养基;第3代20%含血清培养基,80%无血清培养基;第4代100%无血清培养基。另一种传代中始终采用含体积分数10%胎牛血清的α-MEM完全培养液。用流式细胞仪检测细胞的表面标记,进行成骨诱导试验,同时与经典的含10%胎牛血清的α-MEM培养体系进行比较。结果与结论：梯度血清递减培养法与经典α-MEM培养体系所获得的细胞在扩增能力、细胞形态、免疫表型等方面相似。细胞在两种培养体系中均能保持良好的分化潜能。但梯度血清浓度法培养间充质干细胞可使用更少量胎牛血清,提高临床应用安全性。     

CD147-shRNA重组质粒对裸鼠肝癌细胞SMMC-7721皮下移植瘤的抑制作用

目的研究CD147-shRNA重组质粒对裸鼠肝癌细胞SMMC-7721皮下移植瘤生长的抑制作用。方法将SMM@7721细胞、转染空载质粒的SMMC7721／pBS／U6以及转染本室前期构建的靶向肝癌细胞CD147的重组质粒的肝癌细胞SMMC-7721／pBS／U6／CD147-shRNA3接种到裸鼠皮下,观察移植肿瘤的生长情况。结果转染CD147-shRNA重组质粒的肝癌细胞移植瘤生长速度明显减慢;瘤块平均体积减小,重量减小,移植瘤生长明显减缓,抑瘤率为64．8％。结论转染CD147-shRNA重组质粒的SMMC-7721细胞致瘤性明显降低。     

两种方法建立人胃癌裸鼠移植瘤模型的比较

目的采用两种不同方法建立人胃癌裸鼠皮下移植瘤模型。方法人胃癌细胞悬液直接注射法:将处于对数生长期的人胃癌细胞悬液接种于裸鼠皮下;胃癌裸鼠瘤转瘤法:将胃癌细胞悬液接种入裸鼠,待肿瘤生长直径在8 mm左右时,处死裸鼠并取其肿瘤组织边缘新鲜的组织,接种于裸鼠皮下,形成皮下移植瘤。观察并比较两种方法所建立的模型肿瘤移植成功率及瘤体生长速度,实验结束后MSP法检测移植瘤组织中Reprimo基因的甲基化水平并采用免疫组织化学法检测移植瘤的Ki-67和CD31分子表达。结果细胞悬液直接注射组的瘤体成瘤速度较瘤转瘤组慢(P<0.05);瘤转瘤组的Reprimo基因甲基化水平及Ki-67和CD31的表达均高于细胞悬液直接注射组(P<0.05)。结论胃癌裸鼠皮下瘤转瘤法的瘤体生长状况优于胃癌细胞悬液直接注射法。     

兔结膜上皮细胞组织块培养

目的研究结膜上皮细胞体外培养的方法，并进一步探索无血清培养系统用于结膜上皮细胞培养的可行性。方法分别用含胎牛血清培养液和不含血清培养液进行组织块培养，观察两种培养方法在细胞形态、细胞生长情况和增殖及细胞分化方面的差异。结果无血清培养系统中结膜上皮细胞的增殖、克隆形成及细胞传代能力均较含血清培养系统高，而且具备结膜上皮细胞全部组织结构及功能特点。结论无血清培养系统的组织块培养法可为结膜上皮细胞的疾病、药理毒理研究及培养移植的结膜上皮细胞提供更为安全有效的细胞模型。     

大鼠骨髓来源肝干细胞的成瘤性

背景:通过动员自身或移植外来的骨髓来源肝干细胞可促进肝再生,但是,在大规模临床应用前,其安全性需要进一步研究.目的:采用含体积分数5%淤胆血清的培养基诱导大鼠骨髓间充质干细胞向肝干细胞方向分化,将这些骨髓来源肝干细胞接种到裸鼠体内,观察其是否具有成瘤性.方法:用含体积分数5%淤胆血清的培养基培养大鼠骨髓间充质干细胞;以免疫荧光法检测白蛋白、甲胎蛋白及细胞角皮素18在诱导后细胞的表达;以糖原染色及尿素合成检测细胞功能. 将培养14 d的大鼠骨髓来源肝干细胞接种于裸鼠皮下,观察局部有无新生物形成.结果与结论:用含体积分数5%淤胆血清的培养基培养大鼠骨髓间充质干细胞,4 d后出现细胞集落,细胞为圆形;7 d后集落变大,其周围开始出现多角形细胞;培养14 d后可见细胞呈多角形和排列成铺路石样,免疫荧光染色发现这些细胞表达角皮素18、甲胎蛋白和白蛋白,糖原染色显示细胞内有糖原颗粒;培养第12～15天的培养液中尿素氮浓度逐渐升高.经诱导的大鼠骨髓来源的肝干细胞接种到裸鼠皮下,30 d后局部未见新生物形成,组织结构未见异常.结果提示用体积分数5%淤胆血清培养基诱导的大鼠骨髓源性肝干细胞可能无成瘤性.     

不同血清微环境对大鼠骨髓间充质干细胞体外培养的影响

背景:骨髓间充质干细胞在培养过程中,常在基础培养基中添加一定的血清,最常见的是小牛血清和胎牛血清,但这存在着一定的生物安全性件隐患.目的:观察不同血清微环境对大鼠骨髓间充质干细胞体外培养的影响.方法:自成年大鼠骨髓中分离骨髓间充质干细胞,采用全骨髓贴壁法培养.分别以下列血清微环境培养:自身血清组:分离细胞后原代用含大鼠自身血清的培养基培养,传代后换用含胎牛血清的培养基培养:同种异体衄清组:分离细胞后原代用含同种异体血清的培养基培养,以后用胎牛血清培养基培养;胎牛血清组:分离后用含胎牛血清培养基培养,以后一直用含胎牛血清培养基培养:DMEM组:分离细胞后原代用不含血清的DMEM培养基培养,传代后换用含胎牛血清的培养基培养.在倒置相差显微镜下观察细胞的形态;细胞的贴比率:生长曲线;流式细胞仪观测细胞表面CD11b、CD45和CD90表达.结果与结论:大鼠自身血清微环境及同种异体血清微环境细胞形态均一性、在融合度均高于其他组;首次传代天数低于其他组.24,48,72 h贴比率自身血清组、同种异体血清组和胎牛血清组均高于DMEM组(P＜0.01).在细胞生长曲线中大鼠自身血清组倍增速率最快,其次为同种异体血清组,再者为胎牛血清组,而DMEM组细胞未见明显倍增现象.流式细胞仪检测含血清培养基培养条件下各组第3代细胞CD11b和CD45阳性细胞率均达到98%以上,CD90阳性率小于2%,可以得到纯度较高的骨髓间充质干细胞.但是在无血清微环境条件下,CD11b的阳性率为95.83%、CD90阳性率达2.07%,而CD45阳性率仅为64.79%.可见无血清环境下培养的骨髓间充质干细胞纯度明显低于含血清微环境.提示大鼠自身血清微环境下更有利于骨髓间充质干细胞的贴壁、生长及纯化.     

结肠癌干细胞样细胞的无血清法培养及特性鉴定

目的运用无血清细胞培养法培养出源于结肠癌细胞株SW620的细胞球,并实现其在体外的繁殖及传代,为深入研究结肠癌提供坚实的基础。方法逐步驯化人结肠癌细胞株SW620适应无血清培养条件,1周后,收集悬浮生长的细胞球。采用免疫荧光法检测胚胎干细胞标记物SSEA-4、TRA-1-60在SW620细胞及细胞球的表达情况;采用PI染色法检测2种细胞的细胞周期;采用脂肪诱导分化液对2种细胞进行体外诱导培养;采用裸鼠成瘤实验比较2种细胞的成瘤能力。结果 SW620细胞在无血清培养液中培养1周后,可生出悬浮生长的细胞球。胚胎干细胞标记物SSEA-4、TRA-1-61在所有细胞球细胞中均呈阳性表达;在SW620细胞中的表达率分别为(25.74±7.62)%、(27.74±4.31)%,两者相比,差异具有统计学意义(P0.05)。细胞球细胞有(7.18±1.35)%处于分裂期(S期),(84.19±2.52)%处于分列前期(G0/G1期);SW620细胞有(20.89±3.84)%处于S期,(63.02±6.73)%处于G0/G1期,两者相比差异有统计学意义(P0.05)。脂肪诱导液中培养7d后,油红特异性染色的脂肪颗粒在每100个细胞球细胞中为(583.80±77.69)个;在每100个SW620细胞中为(169.20±26.43)个,两者相比差异有统计学意义(P0.05)。2×104个细胞球细胞即可在裸鼠皮下成瘤,移植瘤体积为(2 279.98±346.27)mm3;2×105个SW620细胞才能形成裸鼠皮下移植瘤,移植瘤体积为(889.75±78.79)mm3,两者相比差异有统计学意义(P0.05)。结论人结肠癌细胞SW620经过无血清驯化,可培养出细胞球,并可进行体外的大量繁殖和稳定传代;细胞球表现出肿瘤干细胞样细胞的特性。