碱性成纤维细胞生长因子对大鼠心脏微血管内皮细胞血管形成及血管内皮生长因子受体1的影响

目的探讨碱性成纤维细胞生长因子对诱导大鼠心脏微血管内皮细胞形成管腔样结构的影响,以及对血管内皮生长因子受体Flt-1的作用。方法分离、培养大鼠心脏微血管内皮细胞。应用Matrigel检测不同浓度碱性成纤维细胞生长因子作用后心脏微血管内皮细胞形成管腔的情况。逆转录聚合酶链反应检测各组血管内皮细胞Flt-1mRNA的表达量。结果应用Matrigel可诱导心脏微血管内皮细胞管腔样结构形成,随着碱性成纤维细胞生长因子浓度升高(0、51、0和20μg/L),管腔样结构形成的数量逐渐增多,当碱性成纤维细胞生长因子浓度达到40μg/L时管腔样结构的数量有所减少(P<0.05)。Flt-1 mRNA的表达量随碱性成纤维细胞生长因子作用浓度的升高(0、5、10和20μg/L)而逐渐增高,当碱性成纤维细胞生长因子浓度达到40μg/L时其mRNA水平有所降低(P<0.05)。结论应用Matrigel可在体外诱导培养的大鼠心脏微血管内皮细胞形成管腔样结构。碱性成纤维细胞生长因子对大鼠心脏微血管内皮细胞形成管腔样结构有促进作用,并在一定范围内呈剂量依赖性关系。碱性成纤维细胞生长因子影响大鼠心脏微血管内皮细胞膜受体Flt-1的表达,在一定范围内亦呈剂量依赖性,且这种剂量依赖性同微血管内皮细胞管腔样结构形成的数量一定范围内呈现一致性。     

N-乙酰基-丝氨酰-天门冬酰-赖氨酰-脯氨酸对大鼠心脏成纤维细胞c-Jun氨基末端激酶通路活化的影响

目的 探讨N-乙酰基-丝氨酰-天门冬酰-赖氨酰-脯氨酸(AcSDKP)对血小板源生长因子诱导的大鼠心脏戍纤维细胞增殖及胶原合成以及c-Jun氨基末端激酶表达的影响.方法 选用新生Wistar大鼠心脏成纤维细胞作为实验研究材料,MTT法检测心脏成纤维细胞代谢活性的改变,免疫细胞化学法检测Ⅰ型、Ⅲ型胶原表达的改变,Western Blotting检测大鼠心脏成纤维细胞中磷酸化JNK(p-JNK)和JNK蛋白及Ⅰ型、Ⅲ型胶原蛋白的表达.结果 10μg/L血小板源生长因子刺激下,代表大鼠心脏成纤维细胞代谢活性的OD值增加,Ⅰ型、Ⅲ型胶原表达增强,表明血小板源生长因子刺激了心脏成纤维细胞增殖,促进了胶原的合成.同时p-JNK蛋白表达增高,而JNK蛋白表达无明显改变.10-9mol/L AcSDKP能够抑制血小板源生长因子诱导的大鼠心脏成纤维细胞代谢活性,同时抑制了Ⅰ型、皿型胶原及p-JNK蛋白的表达,而JNK蛋白表达无明显改变.结论 AcSDKP能够通过阻断血小板源生长因子介导的JNK通路激活进而抑制大鼠心脏成纤维细胞增殖和胶原蛋白表达.     

血管紧张素(1-7)对血管紧张素Ⅱ诱导心脏成纤维细胞增殖和胶原合成的影响

目的探讨血管紧张素(1-7)对血管紧张素Ⅱ诱导心脏成纤维细胞增殖和胶原合成的影响。方法分离培养SD仔鼠心脏成纤维细胞,四氮唑盐比色法检测细胞增殖,流式细胞分析技术测定细胞周期,逆转录—聚合酶链式反应测定心脏成纤维细胞Ⅰ、Ⅲ型胶原mRNA的表达。结果①1.0μmol/L血管紧张素Ⅱ作用24h,心脏成纤维细胞的四氮唑蓝比色分析法吸光度值(0.24±0.01)较无血清对照组(0.14±0.01)明显增加(P<0.01);0.001~1.0μmol/L血管紧张素(1-7)和1.0μmol/L血管紧张素Ⅱ共同干预后吸光度值逐渐降低,分别为0.20±0.01、0.19±0.01、0.13±0.01、0.16±0.03,均显著低于血管紧张素Ⅱ组(P<0.01)。②血管紧张素Ⅱ组心脏成纤维细胞的S期百分率(14.0%±0.9%)和增殖指数(23.4±1.8)较对照组(5.4%±0.7%和10.8±2.4)明显增高(P<0.01);0.1μmol/L血管紧张素(1-7)干预后S期百分率(8.5%±0.7%)和增殖指数(16.2±2.0)较血管紧张素Ⅱ组降低(P<0.01)。③血管紧张素Ⅱ刺激后心脏成纤维细胞的Ⅰ、Ⅲ型胶原mRNA表达水平分别为较对照组明显增高(P<0.01);给予0.001~1.0μmol/L血管紧张素(1-7)和1.0μmol/L血管紧张素Ⅱ共同干预后,胶原表达水平浓度依赖性的下降,均显著低于血管紧张素Ⅱ组(P<0.05)。结论血管紧张素(1-7)具有抑制血管紧张素Ⅱ浓度增加引起的心脏成纤维细胞增殖和胶原合成的作用。     

洛伐他汀对醛固酮诱导鼠心肌成纤维细胞增殖及其 iNOS-NO 系统活性的调控作用

目的：探讨洛伐他汀对醛固酮诱导心肌成纤维细胞（ CFs）增殖及诱导型一氧化氮合酶-一氧化氮（ iN-OS-NO）系统活性的调控作用。方法用胰酶消化法分离、培养新生SD大鼠CFs,采用MTT比色法、硝酸还原酶法、分光光度法和半定量RT-PCR技术,观察不同浓度洛伐他汀对CFs增殖、NO含量、iNOS活性和iNOS mRNA表达的影响。结果洛伐他汀（1×10-8～1×10-5 mol/L）能剂量依赖性抑制醛固酮诱导CFs的增殖,升高CFs的NO含量、iNOS活性及增加iNOS mRNA的表达（P均＜0．05）,甲羟戊酸（1×10-3 mol/L）、法尼酯焦磷酸（5μmol/L）可完全逆转洛伐他汀的上调作用。洛伐他汀干预下醛固酮诱导CFs的NO生成量与iNOS活性、iNOS活性与iNOS mRNA表达均呈正相关（r分别为0．826、0．752,P均＜0．01）;CFs增殖数目与NO含量呈负相关（r＝-0．908,P＜0．01）。结论洛伐他汀可上调醛固酮诱导CFs的iNOS-NO系统活性,抑制CFs增殖,并呈剂量依赖性,其作用机制可能与甲羟戊酸途径调节有关。     

瑞舒伐他汀对乳鼠心脏成纤维细胞增殖和凋亡的影响

目的 研究瑞舒伐他汀(Ros)对SD乳鼠心脏成纤维细胞(CFs)增殖的抑制作用,探讨其诱导CFs凋亡的作用机制.方法 采用新生SD大鼠CFs进行体外培养,单独给予10-5,10-6,10-7,10-8mol/L Ros或与10-5mol/L焦磷酸法尼酯(FPP)联合进行干预,应用MTT比色、BrdU比色、瑞氏-吉姆萨染色倒置生物显微镜、Hochest 33258染色荧光显微镜、流式细胞分析技术等方法观察Ros对CFs增殖的抑制作用和其对CFs凋亡的诱导作用.结果 Ros不仅可明显抑制新生SD大鼠CFs增殖和DNA合成,且可诱导CFs凋亡.10-5mol/L FPP可部分逆转此作用.结论 Ros为有效的抗心脏纤维化药物,不仅可明显抑制纤维化进程,还可逆转已出现的纤维化.     

心脏营养素1对培养的心肌细胞心房钠尿肽mRNA表达的影响及机制

目的观察心脏营养素1在诱导培养心肌细胞心房钠尿肽基因表达中的作用及其机制,以进一步明确心脏营养素1诱导心肌肥大的作用。方法差速贴壁纯化培养新生大鼠心肌细胞,利用逆转录聚合酶链反应技术检测心房钠尿肽mRNA表达量。结果(1)在培养的心肌细胞中分别加入10-91、0-8和10-7mol/L心脏营养素1,72h后心房钠尿肽mRNA相对表达量分别为1.18±0.14、1.58±0.20和2.03±0.30,其中10-8和10-7mol/L心脏营养素1与对照组(1.08±0.15)相比有显著性差异,呈剂量依赖性。(2)用10-8mol/L心脏营养素1刺激心肌细胞,24h7、2 h和120 h后心房钠尿肽mRNA相对表达量分别为1.16±0.18、1.47±0.17和1.97±0.24,与同时间段对照组相比,72 h和120 h组有显著性差异,呈明显的时间依赖性。培养120 h与培养72 h相比,差异也有显著性统计学意义(P<0.05)。(3)在心肌细胞培养基中分别加入细胞外信号调节激酶1/2选择性抑制剂PD098059(50μmol/L)和蛋白激酶C抑制剂Calphostin C(10μmol/L),30 min后再加入10-8mol/L心脏营养素1,前者的心房钠尿肽mRNA相对表达量为1.94±0.15,与对照组(1.04±0.17)相比有极显著性差异(P<0.01),与单纯心脏营养素1组相比也有显著性差异;后者的心房钠尿肽mRNA相对表达量为1.27±0.17,与对照组(1.04±0.17)相比无显著性差异。结论心脏营养素1呈剂量和时间依赖性增加心房钠尿肽mRNA表达的作用,此作用是通过丝裂原激活蛋白激酶信号通路介导而实现的,蛋白激酶C可能不直接参与介导心脏营养素1诱导心肌细胞心房钠尿肽mRNA的表达。     

丝裂原活化蛋白激酶在醛固酮诱导心室成纤维细胞增殖中的作用

目的:探讨醛固酮诱导心肌成纤维细胞(CFs)增殖的信号转导机制.方法:用胰酶消化法分离、培养新生大鼠CFs,采用3H-胸腺嘧啶核苷(3H-TdR)掺入法、western-blotting技术从DNA合成、蛋白表达等方面观察MAPK活化与醛固酮促CFs增殖的关系.结果:①醛固酮剂量依赖性促CFs DNA合成,10-5mol/L PD98059 [(782±152)个·min-1] 可逆转 10-7mol/L醛固酮 [(1879±169)个·min-1]的作用;②10-7mol/L醛固酮对活化MAPK蛋白表达有显著增强作用,在4 h达峰作用(8.11±0.46),10-7mol/L 醛固酮的作用(8.11±0.46)被10-5mol/L PD98059 (1.21±0.10, P<0.01)阻断.结论:醛固酮能激活CFs的MAPK,MAPK表达及活化参与醛固酮诱导的CFs增殖.     

尼可地尔预处理对内皮素1刺激的大鼠心脏成纤维细胞增殖的影响及机制探讨

目的观察尼可地尔预处理对内皮素1（ET-1）刺激的大鼠心脏成纤维细胞增殖的影响并探讨其机制。方法取新生大鼠心肌组织中的心脏成纤维细胞，接种于6孔培养板，待细胞生长至亚融合状态时，无血清培养液培养24h。将细胞分为6组：空白组仍用原培养液培养；尼可地尔组分别用含1、3和10μmol／L尼可地尔预处理成纤维细胞30min，再加入ET-110nmol／L处理24h；N-乙酰基-L．半胱氨酸（NAC）组用5mmol／L的NAC培养液预处理成纤维细胞30min，再加入ET-110nmol／L处理成纤维细胞24h；ET-1组加入ET-110nmol／L处理24h。CCK8法测算各组细胞增殖率；荧光探针法检测细胞内活性氧（ROS）；实时定量荧光PCR法和Westernblot法检测细胞内转换生长因子β1（TGF-β1）mRNA和蛋白表达。结果ET-1组细胞增殖率明显高于空白组，尼可地尔10μmol／L组及NAC组细胞增殖率明显低于ET-1组，尼可地尔1、3、10μmol／L组ROS、TGF．β1-mRNA及蛋白表达均明显低于ET-1组，P均〈0．05。结论尼可地尔预处理对ET-1刺激的大鼠心脏成纤维细胞增殖有明显抑制作用；其机制可能与降低ROS及TGF-βl表达有关。     

血管紧张素Ⅱ和醛固酮对培养鼠心脏成纤维细胞Bcl-2蛋白表达的影响

目的 研究血管紧张素Ⅱ(AngⅡ)和醛固酮对培养的大鼠心脏成纤维细胞Bcl-2蛋白表达的影响,探讨其引起心肌间质成纤维细胞数目增多的原因。方法培养SD大鼠乳鼠心脏成纤维细胞,以10^-8mol／L AngⅡ或10^-8mol／L醛固酮作用于心脏成纤维细胞,24h后收集细胞涂片,进行免疫组化染色,观察Bel-2蛋白的表达情况。得到阳性结果加其拮抗剂。结果10^-8mol／LAngⅡ对心脏成纤维细胞刺激24h后,Bcl-2蛋白的表达呈阴性;10^-8mol／L醛固酮作用24h后,Bcl-2蛋白的表达呈阳性,其受体拮抗剂螺旋内酯可拮抗醛固酮的作用。结论醛固酮促进心脏成纤维细胞Bel-2蛋白的表达,提示醛固酮有可能通过抑制其凋亡的途径使心脏成纤维细胞数目增多,这一作用是通过其核受体实现的：AngⅡ无类似作用,其引起心脏成纤维细胞增多的机制需进一步研究。     

醛固酮促进血管紧张素Ⅱ诱导大鼠心脏成纤维细胞合成胶原

为探讨醛固酮对大鼠心脏成纤维细胞血管紧张素Ⅱ 1型受体表达的影响及醛固酮对血管紧张素Ⅱ促进心脏成纤维细胞胶原代谢效应的影响 ,采用3 H 脯氨酸掺入法对体外分离培养的心脏成纤维细胞分别检测醛固酮、血管紧张素Ⅱ以及二者共同作用后对心脏成纤维细胞胶原合成量的影响 ;分别利用放射配体结合实验和半定量逆转录—聚合酶链反应测定经醛固酮处理后细胞血管紧张素Ⅱ 1型受体及其mRNA的表达水平 ,并比较其与对照组间的差异。结果发现血管紧张素Ⅱ (10 -7mol/L)可使心脏成纤维细胞胶原合成量显著增加 (P <0 .0 1) ,醛固酮对心脏成纤维细胞的胶原合成无影响 ,但醛固酮可明显地增强血管紧张素Ⅱ促进心脏成纤维细胞胶原合成的效应 ;经醛固酮 (10 -7mol/L)处理的心脏成纤维细胞血管紧张素Ⅱ 1型受体的表达与对照组比较明显升高 (2倍 ) ,细胞血管紧张素Ⅱ 1型受体mRNA的水平也较对照组显著增加 (1.5倍 )。结果说明醛固酮虽然不能通过直接作用影响心脏成纤维细胞的胶原代谢 ,但它可以通过上调心脏成纤维细胞血管紧张素Ⅱ 1型受体的表达来增强血管紧张素Ⅱ致心脏成纤维细胞胶原合成增多的效应     

Intracellular expression of CD61 precedes surface expression

 We report a case of acute myeloid leukemia which we have classified as acute megakaryoblastic leukemia because of intracytoplasmic expression of CD61. Light microscopy demonstrated agranular blasts which, by cytochemical staining, were negative for myeloperoxidase. Using flow cytometry, the blast cells were seen to be positive for HLA-DR, CD7, CD13, CD33, and CD34, thus revealing their myeloid origin. Immunophenotyping on fixed blood smears additionally showed positive reaction with the CD61 antibody, demonstrating the megakaryoblastic differentiation of the blasts. After permeabilization of the cell membrane, the intracytoplasmic CD61 expression was confirmed by flow cytometry. Cytogenetic analysis disclosed a del(7)(q21–22). Our findings suggest that cytoplasmic expression of CD61 may precede the cell-surface expression of this antigen and should therefore be investigated in all cases of acute leukemias with undifferentiated morphology and negative cytochemistry to set apart early FAB-M7 from FAB-M0. Received: February 8, 1999 / Accepted: May 5, 1999     

新布尼亚病毒真核表达载体的构建及表达

目的 探究SFTSV-NSs基因的结构和功能以及病毒在感染细胞过程中与宿主的相互作用,通过构建SFTSV-NSs真核表达载体SFTSV-NSs-FLAG,并将其转染进293细胞内,为进一步研究SFTSV-NSs基因的结构和功能奠定基础。方法 利用RT-PCR 扩增SFTSV-NSs基因序列并测序,并将纯化得到的SFTSV-NSs cDNA 片段连接到pFLAG-CMV-3载体,通过EcoRI/BamHI双酶切鉴定重组质粒。将重组表达体pSFTSV-NSs-FLAG导入293细胞中,共聚焦显微镜下观察SFTSV-NSs在细胞中的定位、 Western Blot 检测SFTSV-NSs 蛋白在293细胞中的表达情况。结果 成功克隆测序SFTSV-NSs基因;成功构建SFTSV-NSs真核表达载体pSFTSV-NSs-FLAG,并将其转染到293细胞中。在293细胞中的表达检测结果显示共聚焦显微镜下观察重组体主要集中在细胞质中,并形成类包涵体样结构;且Western Blot 检测结果显示SFTSV-NSs 蛋白在293细胞中表达。结论 为进一步研究SFTSV-NSs基因的结构和功能以及病毒在感染细胞过程中与宿主的相互作用提供新思路。     

成纤维细胞激活蛋白载体的构建及表达

目的建立成纤维细胞激活蛋白(FAP)表达系统,以获得完整蛋白。方法采用RT-PCR方法,自人新鲜胃癌组织中扩增FAP-cDNA,同时将FAP-cDNA克隆到pMD18-T中,表达正确后,再定向插入真核表达载体pQE30中,转化大肠埃希菌JM109,经异丙基-B-D-硫代半乳糖苷(IPTG)诱导表达。结果测定FAP-cDNA序列与GeneBank(基因库)中的FAP序列相同;构建出重组表达载体pQE30-FAP;转化大肠埃希菌JM109,并获得完整蛋白,经验证为诱导后的表达蛋白。结论成功构建pQE30-FAP表达载体,Western-Blotting验证为完整蛋白,为进一步获得抗FAP抗体奠定了基础。     

人硫氧还蛋白真核载体的构建及表达

目的构建人硫氧还蛋白基因的重组真核表达载体。方法人硫氧还蛋白的cDNA克隆至pGEM-TEasy载体,经DNA测序证明后,将其克隆至真核表达载体pShttle构建重组pShttle-hTRX,pShttle-hTRX转染Hela细胞系进行瞬时表达,通过Westernblot、免疫组化、活性测定、酶切、PCR扩增等方法证实构建载体的正确性。结果构建携带人硫氧还蛋白基因的真核表达载体pShttle-hTRX,转染HeLa细胞后可检测到hTRX的转录和表达。结论正确构建了携带人硫氧还蛋白基因的真核表达载体,本结果可用于探讨硫氧还蛋白的生物学作用。     

Construction and expression of recombined human AFP eukaryotic expression vector

AIM: To construct a recombined human AFP eukaryotic expression vector for the purpose of gene therapy and target therapy of hepatocellular carcinoma (HCC). METHODS: The full length AFP-cDNA of prokaryotic vector was digested, and subcloned to the multi-clony sites of the eukaryotic vector. The constructed vector was confirmed by enzymes digestion and electrophoresis, and the product expressed was detected by electrochemiluminescence and immunofluorescence methods. RESULTS: The full length AFP-cDNA successfully cloned to the eukaryotic vector through electrophoresis, 0.9723 IU/ml AFP antigen was detected in the supernatant of AFP-CHO by electrochemiluminescence method. Compared with the control groups, the differences were significant (P<0.05). AFP antigen molecule was observed in the plasma of AFP-CHO by immunofluorescence staining. CONCLUSION: The recombined human AFP eukaryotic expression vector can express in CHO cell line. It provides experimental data for gene therapy and target therapy of hepatocellular carcinoma.     

人白细胞介素10真核表达载体的构建及表达

目的 建立人白细胞介素10(hIL-10)真核表达系统并观察其在HeLa细胞中的表达。方法 用RT-PCR方法自活化的人外周血淋巴细胞扩增hIL-10 cDNA，将其克隆至pMDl8-T中，测序正确后，再定向插入真核表达载体pCIneo中，经脂质体介导转染HeLa细胞，检测其在细胞内外的表达和分泌。结果 RT-PCR扩增的hIL-10 cDNA序列与GenBank中hIL-10 cDNA序列一致；构建了真核重组表达载体pCIneo-hIL-10；转染HeLa细胞后可检测到hIL-10的转录和表达。结论 成功构建了hIL-10真核表达系统，为今后的临床研究及基因工程药物的生产奠定基础。     

小鼠白介素-10真核表达载体的构建及表达

目的构建小鼠白介素-10(murineinterleukin-10,mIL-10)的真核表达载体,并研究其在293T细胞中的表达。方法 RT-PCR扩增小鼠脾脏IL-10基因后,克隆到真核表达载体pcDNA3.0上,酶切和测序鉴定重组质粒的大小、序列。采用脂质体转染法将重组质粒pcDNA3.0-mIL-10瞬时转染293T细胞,用Westernblot法检测IL-10表达。结果重组质粒pcDNA3.0-mIL-10构建成功,而且转染了293T细胞中提取的蛋白可检测到活性蛋白。结论经酶切和测序鉴定重组质粒pcDNA3.0-mIL-10构建成功,并在293T细胞中成功表达活性蛋白,为进一步研究其生物学功能奠定了基础。