抗HBsAg二硫键稳定性Fv抗体（dsFv）突变基因的构建与？…

ｄｓＦｖ是近年发展起来的一种新型基因工程抗体，具有分子小，稳定性好，生物学活性高等特点。我们采用ＰＣＲ定点突变方法，成功地构建了抗ＨＢｓＡｇ ｄｓＦｖ抗体的轻、重链突变基因，并进行了序列分析，证明在重链第４４位氨基酸和轻链第１００位氨基酸，已突变形成半胱氨酸（Ｃｙｓ），为进一步表达有活性的抗ＨＢｓＡｇ ｄｓＦｖ抗体奠定了基础。     

Fv抗体研究的新进展──二硫键稳定性Fv抗体(dsFv)

单链抗体（ｓｃＦｖ）虽然有诸多优点，如分子小，易通过血管壁，穿透实体瘤，但其稳定性差，亲和力较低。近年来出现了二硫键稳定性Ｆｖ抗体（ｄｓＦｖ），就是在ＶＨ和ＶＬ间通过形成二硫键来稳定Ｆｖ片段，ｄｓＦｖ极大地提高了Ｆｖ片段的稳定性和亲和力，不仅继承了ｓｃＦｖ的优点，也弥补了其缺点，从而极大地提高了ｄｓＦｖ和ｄｓＦｖ－免疫毒素在临床上的应用价值。     

Fv抗体研究的新进展—二硫键稳定性Fv抗体（dsFv）

单链抗体虽然有诸多优点，如分子的通过血管壁，穿透实体瘤，但其稳定性差，亲和力较低。近年来出现了二硫键稳定性Ｆｖ抗体，就是在ＶＨ和ＶＬ间通过形成二硫键来稳定Ｆｖ片段，ｄｓＦｖ极大地提高了Ｆｖ片段的稳定性和亲和力，不仅继承了ｓｃＦｖ的优点，也弥补了其缺点，从而极大地提高了ｄｓＦｖ和ｄｓＦｖ－免疫毒素在临床上的应用价值。     

一株人源性抗HBsAg抗体Fab片段的筛选及序列分析

一株人源性抗ＨＢｓＡｇ抗体Ｆａｂ片段的筛选及序列分析高辉高磊纪宗玲路凡陈南春陈苏民余宙耀张宜俊尤玉琴粟宽源（第四军医大学生物化学教研室，西安７１００３１空军广州医院全军肝病中心）乙型肝炎是我国常见的传染性疾病，目前尚无特效的治疗手段。研究发...     

人源性噬菌体抗体库的构建及HBsAg人单抗的筛选

用聚合酶链伸反应从人外周血淋巴细胞克隆出Ｆｄ段和ｋ链基因，重组到表达载体ｐＣＯＭＢ３中，构建了人源性噬菌体抗体，将乙肝病毒表面抗原固相化对噬菌体抗体库进行了三轮“吸附－洗脱－扩增”的筛选，使特异性噬菌体抗体得到了富集，筛选到了抗ＨＢｓＡｇ的人单抗。     

基因工程技术制备人源抗HBsAg抗体Fab片段

将从抗体文库中筛选出的抗HBsAg Fab阳性克隆转化大肠肝杆菌 ,IPTG诱导表达 ,经Western blot鉴定 ,证实上清中含有可溶性抗HBsAg Fab片段 ,应用自制的羊抗人免疫球蛋白片段抗体 (anti Fab )与Gama bind交联制备的亲和层析柱纯化表达产物 ,所得纯化产物在SDS PAGE中形成单一条带 ,经Western blot证实具备良好抗原特异性 ,Dot blot证实具备良好抗原结合活性。     

人源性抗HBs可变区单链抗体基因的构建及核酸序列测定

将通过噬菌体显示技术获得的一株人源性抗HBs Fab抗体基因重链和k轻链的可变区用编码柔性肽的Linker使其连接成单链,克隆入中间载体,并进行核酸序列测定,为其后的表达及双功能抗体的构建打下基础。     

抗人HBsAg单链抗体基因的构建及其在COS-7细胞中的表达

目的：构建抗人HBsAg单链抗体基因，并分析其在COS—7细胞中的表达。方法：以从噬菌体抗体库中筛选的抗HBsAg的Fab抗体基因为模板，分别扩增其轻、重链可变区(VL、VH)基因，通过重组PCR方法将轻、重链可变区基因用连接肽(C1y4Ser)3的编码序列连接，并引入前导肽编码序列，构建具有L—VH—Linker—Vl结构的单链抗体基因。将所构建的单链抗体基因克隆入绿色荧光蛋白(GFP)融合表达载体pEGFP—N3，并转染COS—7细胞进行表达。结果：经测序表明，前导肽、连接肽、VL及Vh的序列正确。酶切鉴定证实，成功地构建了GFP基因融合表达载体。瞬时转染COS—7细胞后，通过荧光显微镜观察证实有ScFv融合蛋白的表达。转染细胞的培养上清浓缩后，进行SDS—PAGE及westem blot分析，可检出ScFv融合蛋白的分泌性表达。培养上清的间接ELISA检测证实，所表达的单链抗体具有与HBsAg结合的特异性。结论：成功地构建了抗人HBsAg单链抗体基因，并可在COS—7细胞中分泌性表达。     

抗HBsAg抗体Fab段在大肠肝菌中的高效表达与复性

将抗ＨＢｓＡｇ抗体的轻链和重链Ｆｄ段基因,分别克隆于ｐＥＴ２０ｂ质粒中并分别转化到大肠肝菌ＢＬ２１（ＤＥ３）,ＬＰＴＧ诱导后,ＳＤＳ－ＰＡＧＥ分析发现在２７ＫＤ（Ｌ）和２５ＫＤ（Ｆｄ）处３有外源蛋白表达,表达蛋白含量分别为５３％和４８。Ｌ链和Ｆｄ包涵体蛋白经盐酸胍变性后,等量混合于折叠液中,Ｌ和Ｆｄ可复性形成了约５０ＫＤ的蛋白。     

抗HBsAg/RBC双特异噬菌体抗体的构建

目的 通过不同外壳蛋白的展示，构建抗HBsAag/RBC双特异噬菌体抗体。方法通过DNA重组技术，将抗HBsAg Fab与噬菌体基因8融合，抗RBC ScFv与噬菌体基因3融合，这2种融合基因以不同的启动子驱动，并克隆于同一噬菌体表达载体上，得到双特异噬菌体抗体表达载体，转化大肠杆菌后获取噬菌体抗体上清，用ELISA和红细胞凝集试验检测其双特异活性。结果ELISA和RBC凝集实验证明，本方法可形成双特异噬菌体抗体，可使含有HBsAg的RBC悬液产生凝集。用展示性能得到提高的蛋白8变种取代野生型蛋白8可提高双特异噬菌体抗体的活性。结论 HBsAb和RBC两种抗体分子能够通过不同噬菌体外壳蛋白同时展示于同一噬菌体表面，形成双特异噬菌体抗体。可用于人外周血HBsAg的快速血凝法检测。     

双特异单抗聚合体清除血液HBsAg及HBV的研究

目的　研究第二抗体交连的双特异单抗聚合体对乙肝病人血液HBsAg及HBV的清除能力 ,并初步探讨其机制。方法　用羊抗鼠IgG单抗将鼠抗人CR1单抗及鼠抗HBsAg单抗连接构建成双特异单抗聚合体 (heteropolymer,HP) ,将HP加入到乙肝病人枸橼酸钠抗凝全血中 ,离心测定血浆中HBsAg及HBV的含量变化 ;设立对照组 ,并采用放射免疫、荧光定量PCR以及细胞酶联等测定方法研究细胞结合的HBsAg及HBV的含量变化及红细胞膜CR1分子数量的变化。结果　由二抗构建的HP可在 5min内将全血中 95 %以上的HBsAg及 5 1%的HBV结合到红细胞上 ,使血浆中HBsAg的含量从 30 10ng ml降到 138ng ml;HBVDNA病毒也从 7.2× 10 1 1 copies L下降到 3.5× 10 1 1 copies L。红细胞在结合抗原物质的同时伴有CR1分子的丢失 ,但红细胞无溶血反应。结论　由二抗构建的HP与文献报道的生物素 亲合素构建的HP具有相同的生物学功能 ,并更有助于对抗原物质的结合与清除 ,以红细胞为载体的HP清除系统可能具有重要的医药或临床治疗研究价值。     

HBsAg腺病毒疫苗载体的构建及293细胞中的包装表达

目的：HBsAg与腺病毒骨架载体质粒构建，在293细胞中包装表达重组腺病毒颗粒，建立HBsAg腺病霉疫苗。方法：以pEcob-6为模板，PCR扩增目的基因HBsAg，腺病毒穿梭载体PAd-track-cmv与HBsAg重组为PAd-track-cmv-HBs穿梭质粒；腺病毒骨架载体质粒PAd-Easy-1再与PAd-track-emv-HBs同源重组为PAd-Easy-1-HBs质粒；用脂质体介导的转染法将PAd-Easy-1-HBs转染到293细胞，包装成重组腺病毒颗粒。酶联免疫吸附法测定细胞上清中HBsAg的表达，建立HBsAg腺病毒疫苗。结果：PAd-Easy-1-HBs转染到293细胞中，合成荧光蛋白，荧光显微镜下细胞发绿色荧光。再次感染293细胞，90％以上的细胞脱落。细胞上清液中也测定出有HBsAg的表达。结论：HBsAg腺病毒疫苗载体构建成功，并能在293细胞中完整包装成重组腺病毒颗粒，为免疫动物实验提供条件。     

重症肌无力治疗性单价IgG抗体基因的构建

目的:构建一株对重症肌无力(MG)具有特异性免疫治疗作用的单价IgG类抗体基因.方法:应用定点突变技术,将致病性抗乙酰胆碱受体(AChR)抗体IgG637的重(H)链第322位氨基酸进行K322A突变,获得的突变型抗体IgG637/K322A基因再进行H链互补决定区3(CDR3)缺失突变,获得突变型抗体IgG637/K322A/CDR3ΔPLKP基因.经转化大肠杆菌XL1-Blue进行增殖后,转染哺乳类细胞CHO-k1进行表达,表达产物经ELIAS检测与补体C3的结合活性,经RIA检测与特异性抗原人AChR的结合活性.突变抗体H链再经杵(T366Y)臼(Y407T)突变,以利于异源H链的配对.结果:突变型抗体IgG637/K322A丧失了与补体C3结合的能力,突变型抗体IgG637/K322A/CDR3ΔPLKP丧失了与人AChR结合的能力.测序证实已经获得了预想的杵臼突变序列.结论:已经成功的制备了无补体激活能力的单价IgG类抗AChR抗体基因.     

抗HBsAg人IgG表达载体的构建及其在CHO细胞中的表达

目的 尝试将１株来源于人源性噬菌体抗体库的抗ＨＢｓＡｇ人Ｆａｂ,转换成完整的抗ＨＢｓＡｇ人ＩｇＧ。方法 采用重叠ＰＣＲ方法,在抗ＨＢｓＡｇ人Ｆａｂ和Ｖκ的ＶＨ基因的５’端接上人工合成的人κ链的前导序列,构建表达完整ＩｇＧ１的真核表达载体,转染ＧＨＯ（ＤＨＦＲ＾－）细胞,用ＥＬＩＳＡ、ＲＴ－ＰＣＲ和免疫印迹检测抗ＨＢｓＡｇ人ＩｇＧ的表达。通过ＤＨＦＲ／ＭＴＸ体系及金属离子诱导提高Ｉｇ表达。结果：获得     

人源性抗HBsAg单链抗体在大肠杆菌中的表达及活性测定

目的 :制备有活性的人源性抗HBsAg单链抗体。方法 :应用噬菌体表面呈现技术获得人抗乙型肝炎表面抗原(HBsAg)抗体的Fab片段 ,并将VH 和VL 基因以 (Gly4Ser) 3linker连接成单链 ,插入表达载体pQE40 ,筛选大肠杆菌高表达菌株。结果 :工程菌表达优化试验表明 ,在OD6 0 0 为 0 6时开始诱导 ,持续 6h ,目的蛋白表达量最高可达菌体总蛋白的 31%。包涵体变性后上样镍离子螯合层析柱一步纯化 ,收集目的峰 ,透析复性 ,得纯度为 97%的重组单链抗体 ,其亲和常数为 0 2 3× 10 8mol L。结论 :抗HBsAg单链抗体在大肠杆菌内获得高效表达 ,经变性和复性 ,得到有活性的单链抗体 ,氨基酸组成正确。为进行临床前研究打下基础。     

将抗体库所获抗-HBs Fab转换为全长人IgG

目的 将大肠杆菌表达的抗－乙肝表面抗原（ＨＢｓ）人Ｆａｂ转换为真核表达的全长人ＩｇＧ１。方法 用重叠ＰＣＲ法将人工合成的人Ｖｋ前导序列拼到抗－ＨＢｓ的ＶＨ和ＶＫ上,构建人ＩｇＧ１真核表达载体。转染真核细胞,通过ＥＬＩＳＡ、ＲＴ－ＰＣＲ、免疫印迹检测抗－ＨＢｓ人ＩｇＧ的表达。结果 用轻链和重链同时表达的单一载体在ＣＨＯ细胞中获得了抗－ＨＢｓ人ＩｇＧ的表达。结论 通过噬菌体抗体库所获Ｆａｂ段可经拼接人     

人源抗HBs基因工程抗体在E. coli中的高效表达与折叠研究

目的 高效表达是基因工程抗体走向临床的关键问题之一.本试验旨在研究人源抗HBs基因工程抗体在E. coli中的高效表达与折叠.方法 本实验将抗HBsAg抗体的轻链(L)和重链Fd段基因,分别克隆于pET20b质粒中并分别转化到大肠肝菌BL21(DE3),IPTG诱导后,SDS-PAGE分析发现在Mr27 000(L)和Mr25 000(Fd)处有外源蛋白表达,表达蛋白含量分别为53%和48%.L链和Fd 包涵体蛋白经盐酸胍变性后,等量混合于折叠液中.结果 L和Fd可复性形成了Mr约50 000的蛋白,ELISA结果表明,复性蛋白具有与HBsAg结合的能力.结论 抗HBsAg抗体Fab段在大肠杆菌中的表达与复性的成功,表明包涵体表达基因工程抗体在技术是可行的.     

乙肝疫苗免疫前后人TCRVβ基因亚家族取用表达的研究

目的：研究Ｔ细胞受体（ＴＣＲ）Ｖβ基因亚家族在免疫后的表达特征。方法：运用ＲＴ－ＰＣＲ及Ｓｏｕｔｈｅｒｎ　ｂｌｏｔ技术对乙肝疫苗免疫前后健康成年人ＴＣＲ　Ｖβ１－２０基因亚家族的表达水平迸行了半定量研究。结果：Ｖβ６、Ｖβ１４基因亚家族的表达增高；ＶＢ４、ＶＢ９基因亚家族的表达下调。结论：免疫后诱导产生了ＨＢｓＡｇ特异的Ｔ细胞应答，该结果为制定预防和治疗ＨＢＶ感染的免疫策略提供了新的依据。     

卵泡抑制素与乙肝表面抗原融合基因表达质粒的构建及表达

目的：构建高免疫原性的抑制素真核表达载体。方法：通过PCR扩增pCMV-S基因中的S基因片段，然后将抑制素α(1-32)片段与S的融合基因克隆到真核表达质粒peDNA13．1(-)：酶切、测序鉴定后，采用脂质体包裹法将重组质粒转染Hela细胞，用SDS-PAGE和ELISA对其表达产物进行检测。用抑制素融合表达质粒免疫大白鼠，ELISA检测血中抗抑制素抗体水平。结果：酶切鉴定和序列分析表明，融合基因的表达质粒pClS构建成功。表达质粒在HeLa细胞中获得了表达，融合蛋白的分子量约为29kD，融合蛋白具有抑制素免疫原性。重组质粒免疫使大白鼠产生了抗抑制素抗体。结论：高免疫原性的抑制素表达质粒的构建为利用抑制素基因免疫技术诱导单胎动物生多胎奠定了基础。