人信号转导抑制分子突变重组质粒的构建及鉴定

目的 构建人细胞因子信号转导抑制分子(SOCS)3编码区(CDS)和3’非编码区(UTR)突变基因重组真核表达质粒.方法 以pEGFP-C1-SOCS3野生型表达质粒为模板,PCR方法扩增获得野生型SOCS3 CDS和3'UTR基因的序列.根据SOCS3 mRNA与miR-155预测结合靶点,分别设计3个SOCS3突变型:3' UTR-1、3'UTR-2和CDS.通过融合PCR方法将获得的SOCS3突变基因上、下游片段连接,再将融合片段定向克隆到pEGFP-C1表达载体上,筛选重组阳性菌株,提取重组质粒,利用PCR方法和核酸序列测定验证重组质粒构建的正确性.结果 成功构建人SOCS3 CDS和3'UTR区突变基因重组表达质粒.结论 构建的突变重组质粒将为进一步探讨人SOCS3和miR-155相互作用的研究提供实验依据.     

α4整合素及其配体的分子结构和功能

整合素(Integrin)分子由α和β两个亚基组成,α4整合素有α4β1和α4β7两种,它们的配体分别是VCAM-1(vascular cell adhesion molecule-1)和MAdCAM-1(mucosal adressin cell ad-hesion molecule-1)。α4整合素及其配体通过介导淋巴细胞与内皮细胞的相互作用,参与了多种生理和病理过程。抗α4的单克隆抗体(mAb),已成功地用于治疗和预防实验诱导的一些疾病。     

人整合素分子α4亚基片段的克隆及大肠杆菌的表达

目的 克隆并原核表达α４亚基笥段。方法 从ＩＬ－６细胞系中提取总ＲＮＡ,以ＲＴ－ＰＣＲ方法分两段扩增人整素分子α４亚基片段２．０ｋｂ ｃＤＮＡ,将两片段连接,并将其中的１．７ｋｂ基因片段亚克隆至表达载体ＰＧＥＸ－ＫＧ中,ＩＰＴＧ诱导表达。结果 ＲＴ－ＰＣＲ扩增并克隆了α４的两段ＣＤＮＡ,序列分析表明：与文献报道的μ４ＣＤＮＡ序列基本一致。两片段成功连接后将其中的１．７ｋｂ亚克隆至表达载体ＰＧＥＸ－     

重组pEGFP-C2-p100-TSN点突变质粒构建及表达

目的 将6个不同的p100-TSN.Mutants基因片段分别定向连入PEGFP-C2质粒中,使P100-TSN突变蛋白能够与绿色荧光蛋白在COS7细胞中融合表达,从而为进一步研究p100蛋白TSN结构域的功能奠定实验基础. 方法 利用EcoR Ⅰ和XhoⅠ双酶切方法从6个pcDNA3.1 (+) -p100-TSN.Mutants重组质粒中分别获得p100-TSN.Mutants的cDNA片段,将其连入pEGFP-C2质粒载体中,再将成功构建的6个pEGFP-C2-p100-TSN.Mutants质粒分别转染COS7细胞中,荧光显微镜下观察绿色荧光蛋白表达.结果 ①将重组质粒进行双酶切鉴定可见p100-TSN.Mutants的cDNA片段;②转染重组质粒后可观察到绿色荧光蛋白的表达.结论 ① 6个pEGFP-C2-p100-TSN.Mutants重组质粒构建成功;② p100-TSN突变蛋白可与绿色荧光蛋白在COS7细胞中融合表达.     

2型糖尿病伴甲状腺功能减退患者同型半胱氨酸和血脂水平检测

流行病学研究发现,2型糖尿病（T2DM）人群中甲状腺功能异常的发生率明显增高,且以甲状腺功能减退（甲减）为主,其病情的严重程度比单纯T2DM或单纯甲减更为严重。同型半胱氨酸（Hcy）水平升高,是单纯T2DM和甲减的实验室共同表现之一。本文报道T2DM伴甲减患者Hcy和血脂水平变化及其与单纯T2DM和甲减的差别。     

人TNFα—EGF重组质粒的构建

本实验将编码人ＴＮＦα分子上与其受体相关的部分核苷酸序列缺失，代之以人ＥＧＦ基因ｃＤＮＡ，实现基因重组，转化子经快速细胞破碎法切初筛，经Ｄｏｔ ｂｌｏｔ和Ｓｏｕｔｈｅｒｎ ｂｌｏｔ鉴定，从中挑选出２０个人ＴＮＦα－ＥＧＦ阳性重组质粒。为进一步获得重组嵌合人ＴＮＦα－ＥＧＦ分子和ＴＮＦα分子和ＴＮＦα作用机制的深入探讨奠定了初步基础。     

人TNFα－EGF重组质粒的构建

本实验将编码人ＴＮＦａ分子上与其受体相关的部分核苷酸序列缺失，代之以人ＥＧＦ基因ｃＤＮＡ，实现基因重组。转化子经快速细胞破碎法初筛、经Ｄｏｔｂｌｏｔ和Ｓｏｕｔｈｅｒｎｂｌｏｔ鉴定，从中挑选出２０个人ＴＮＦａ－ＥＧＦ阳性重组质粒，为进一步获得重组嵌合人ＴＮＦａ－ＥＧＦ分子和ＴＮＦａ作用机制的深入探讨奠定了初步基础。     

血清同型（半）胱氨酸水平对动脉粥样硬化及脑梗塞发病的作用

脑梗塞的临床治疗目前尚缺乏有效的措施。因此卒中的一级预防尤为重要。在卒中危险因素的研究中发现 ,在缺血性脑卒中特别是青少年脑梗塞的致病因素中 ,除熟知的年龄、吸烟、高血压、糖尿病等因素外 ,血清同型 (半 )胱氨酸［Ｈｏｍｏｃｙｓｔｅｉｎｅ简写为Ｈｅ］水平升高也是独立的致病危险因素。因此 ,在未发生脑梗塞之前检测血Ｈｅ水平可监控、干预治疗 ,减少缺血性脑血管病的发生。本文就Ｈｅ与缺血性卒中的关系、机理、基因调控以及治疗作一综述。１Ｈｅ的代谢机制Ｈｅ为一类含巯基氨基酸 ,结构式为 :ＮＨ２ＳＨ－ＣＨ２－ＣＨ２－ＣＨ…     

pEGFP-N1-PGC-1α重组质粒的构建及体外表达

目的 构建PGC-1α真核表达载体pEGFP-N1-PGC-1α重组质粒,鉴定及体外表达.方法 通过RT-PCR方法从组织中克隆PGC-1α基因片段,酶切后将其定向插入真核表达载体pEGFP-N1中,构建pEGFP-N1-PGC-1α重组质粒.结果 双酶切法、测序法鉴定表明目的基因正确插入质粒.结论 成功构建了pEGFP-N1-PGC-1α真核表达载体,转染huh-7细胞后,可瞬时、有效表达,为进一步研究PGC-1α调节HBV、HPV生物合成奠定了基础.     

实验性变态反应性神经炎中整合素α6β4的表达及意义

目的 研究实验性变态反应性神经炎(EAN)中整合素α6β4的mRNA表达变化,探讨α6β4与许旺细胞功能状态的关系,以及其表达变化与髓鞘损伤和修复过程的关系。方法 建立Lewis大鼠EAN动物模型,取18只模型鼠坐骨神经,用原位杂交和半定量逆转录-聚合酶链反应(RT-PCR)方法检测模型的不同时期Lewis大鼠神经局部的整合素α6β4表达,以正常鼠(3只)为空白对照。结果 原位杂交结果表明在EAN的发病过程中,α6的表达未见明显变化,而β4的表达在急性期明显减弱,恢复期或后期逐渐恢复。β4表达减弱主要体现为阳性信号的稀疏而不反映为单个信号的量的变化。以GAPDH为内参照,对整合素α6β4的mRNA水平做半定量分析,结果显示：EAN病变过程中,α6的mRNA表达变化不明显,而β4的mRNA呈现早期减少后期逐渐恢复进而高于正常的变化过程。结论 炎症因素造成了许旺细胞变性损伤,影响其整合素的表达,许旺细胞出现了与胚胎发育过程类似的表型转换。从这个意义上,可以把α6β4看作许旺细胞分化状态的一个标志,至少可以看作是标志EAN病变过程的一个重要分子。α6β4表达变化与髓鞘的损伤和修复过程密切相关。     

人整合素分子α4亚基片段的克隆和表达

目的克隆并表达人整合素分子α4亚基1.2kbcDNA片段。方法从HL-60细胞系中提取总RNA,以RT-PCR法扩增人整合素分子α4亚基片段1.2kbcDNA(1753～2934bp),并将该片段亚克隆至表达载体pGEX-3X,用IPTG诱导表达。结果克隆了α4亚基1.2kbcDNA片段。序列分析表明,其所编码的氨基酸序列与文献相比较只有一处错义突变(Arg→Gln),经分析该突变对抗原性影响不大。将该片段亚克隆至表达载体pGEX-3X,经IPTG诱导在大肠杆菌中获得高效表达。结论获得了α4亚基1.2kbcDNA片段及其原核表达产物,对研究α4整合素的功能具有重要的意义。     

NOX4报告基因重组质粒的构建及表达调控初探

目的：构建NOx4荧光素酶报告基因质粒载体,探讨NOX4基因表达调控机制。方法：以细胞基因组DNA为模板作,采用PCR扩增NOX4基因上游调控序列（533bp）,插入质粒DGL3-basic载体,构建重组质粒pGL3-NOX4,重组质粒经酶切和测序鉴定。将pGL3-NOX4转染A549细胞,通过细胞因子刺激观察报告基因表达水平。结果：酶切及测序证实NOX4报告基因质粒构建成功。转染报告基因的A549细胞以细胞因子刺激,结果显示NOx4表达增强。结论：成功构建了NOX4荧光素酶报告基因质粒载体,为进一步研究NOX4基因的表达规律及生理功能奠定了基础。     

hLMO4基因重组质粒的构建及蛋白表达和定位

目的构建hLMO4真核表达载体并证实融合蛋白在细胞内表达及定位。方法提取人乳腺癌MCF-7细胞的mRNA,反转录为cDNA。PCR扩增hLMO4全长编码基因,亚克隆至pCDNA3.1-myc-hisA表达载体中。将构建的重组质粒测序并转染到胃癌细胞BGC823中,提取细胞蛋白进行Western blot检测。利用共聚焦激光扫描显微镜观察pEGFP-LMO4在乳腺癌MCF-7细胞内定位。结果hLMO4全长基因序列克隆到了真核表达载体pCDNA3.1-myc-hisA中,酶切鉴定片段为500bp。Western blot检测到了融合蛋白表达,分子量约为23KD。pEGFP-LMO4在乳腺癌MCF-7细胞内定位以细胞核为主,在细胞浆内少量表达。结论成功的构建了hLMO4全长基因真核表达载体,pEGFP-LMO4蛋白定位于乳腺癌细胞质和核内。     

pVAX1-IL-4/SYN-B融合质粒的构建及表达

目的构建含人白介素4(human IL-4,hIL-4)基因与人α-突触核蛋白(humanα-synuclein,hα-syn)B细胞表位基因的真核表达质粒,并研究其在COS-7细胞内的表达。方法RT-PCR扩增人IL-4基因后,通过基因重组技术将其与α-synuclein蛋白B细胞表位基因融合,在两者之间引入柔性短肽(GSGGGSG)。将融合产物克隆到真核表达载体PVAX1上,利用电泳和测序鉴定融合质粒的大小、方向和序列。采用脂质体转染法,将融合质粒转入COS-7细胞中,用Western blotting技术检测其表达。结果电泳和测序结果与预期一致,并命名为PVAX1-IL-4/SYN-B;质粒转染COS-7细胞株成功,并且能在细胞内高效表达。结论成功构建PVAX1-IL-4/SYN-B融合质粒,并在哺乳动物COS-7细胞中高效表达,为研究融合质粒在帕金森病动物模型中的免疫效果奠定了基础。     

R31L TNF-α突变体重组质粒的构建、真核表达及其产物的胞毒效应

目的：研究膜型、分泌型TNF-α的31位氨基酸在其生物学效应中的作用,进一步探讨TNF-α结构与生物学效应的关系。方法：采用重叠PCR方法将wt TNF-α31位精氨酸（R）密码子（CGC）定点突变替换成亮氨酸（L）密码子（CTC）,构建R31L TNF-α-pcDNA3.0重组质粒,经酶切、PCR及DNA测序鉴定后,采用脂质体转染法将其瞬时转染COS-7细胞进行表达,通过MTT法检测R31LTNF-α突变体的胞毒效应。结果：酶切、PCR及测序鉴定证实目的基因R31LTNF-α正确连接到pcDNA3.0的多克隆位点；TNF-α31位突变可增强sTNF-α的胞毒效应,突变体的CC50值是野生型的1/10,而对mTNF-α的生物学效应无明显影响。结论：本实验成功地构建了R31L TNF-α-pcDNA3.0重组质粒,且在真核细胞COS-7中获得表达；TNF-α31位置换成亮氨酸后,主要增强其分泌型分子的胞毒效应,而对其膜分子无作用。     

GFP-hERα重组质粒的构建及蛋白表达和细胞内定位的研究

目的 构建hERα真核表达载体并证实融合蛋白在细胞内表达及定位.方法 以pcDNA3.1-flaghERα仅重组质粒(Dr.Muyan M馈赠)为模板,PCR扩增hER α全长编码基因,亚克隆至pEGFP-C1表达载体.将构建的重组质粒测序并转染到乳腺癌细胞MCF-7中,提取细胞蛋白进行Western blot检测.利...     

人干扰素α高效表达质粒pEE14.1-IFN-α的构建和表达

目的:构建人干扰素α的高效表达质粒pEE14.1-IFN-α,并在真核细胞中验证其表达。方法:通过PCR获得人IFN-α基因,连入过渡载体pCI-GPI,然后克隆入高效表达载体pEE14.1中,构建重组表达质粒pEE14.1-IFN-α。瞬时转染293T细胞后48 h收获上清,采用ELISA,Western blot分别验证目的基因表达。结果:pEE14.1-IFN-α经酶切和测序分析,与预期设计完全一致,表明重组质粒构建成功。ELISA法检测瞬时转染细胞上清中α干扰素含量,浓度约为3.15 ng/mL,说明表达的蛋白有免疫活性,Western blot检测也显示该重组质粒在上清中分泌表达。结论:成功构建高效表达质粒pEE14.1-IFN-α,为慢性乙肝免疫治疗提供新的备选方案。     

pHIF-1α/EGFP-C2质粒的构建与鉴定

目的 构建pHIF-1α/EGFP-C2真核细胞表达质粒载体.方法 缺氧培养与化学性缺氧两种方法诱导A498人肾癌细胞中HIF-α mRNA水平升高.RT-PCR法扩增HIF-1α的cDNA片段,经T-A克隆扩增后,连接入pEGFP-C2质粒.结果 缺氧培养的A498人肾癌细胞组出现HIF-1α的cDNA扩增条带,DN...     

整合素α5和PDE4D相互作用调节内皮细胞的炎症信号

正动脉粥样硬化是一种以脂代谢紊乱和炎症为主要表现的疾病,然而它也与内皮细胞外基质(extracellular matrix,ECM)的重塑和纤维连接蛋白(fibronectin)在层粘连蛋白(laminin)-胶原基底膜间的沉积密切相关。为了研究纤维连接蛋白如何调节动脉中的炎症,Yun等将纤维连接蛋白受体整合素α5的胞质尾区替换为胶原/层粘连蛋白受体整合素α2的胞质尾区。这一     

阻塞性睡眠呼吸暂停低通气综合征合并心血管疾病患者同型半胱氨酸和血脂水平的检测分析

目的:检测阻塞性睡眠呼吸暂停低通气综合征(OSAHS)合并心血管疾病(CVD)患者的同型半胱氨酸(Hcy)和血脂水平,探讨其在OSAHS合并CVD中的作用。方法:收集本院OSAHS64例,分为单纯OSAHS组、OSAHS+CVD组,并选择单纯CVD和健康人群作为对照,分别行整夜多导睡眠监测(PSG)。测定呼吸暂停低通气指数(AHI)和血氧饱和度(SaO2)。同时采集空腹静脉血,检测血清Hcy以及总胆固醇(TC)、甘油三酯(TG)、高密度脂蛋白胆固醇(HDL-C)、低密度脂蛋白胆固醇(LDL-C)水平。结果:OSAHS+CVD组的Hcy高于正常对照组、单纯OSAHS组和单纯CVD组(P<0.01);单纯OSAHS组、OSAHS+CVD组和单纯CVD组的TC、TG、LDL-C值均比正常对照组高(P<0.05~0.01),HDL-C值比正常对照组低(P<0.01),但三疾病组间无统计学差异。结论:OSAHS患者Hcy水平升高可能是OSAHS患者易患高血压、冠心病等心血管疾病的机制之一。