人羊膜上皮细胞的分离、培养及鉴定

目的建立人羊膜上皮细胞分离、培养及鉴定方法。方法从足月分娩人胎盘剥离羊膜,采用胰蛋白酶消化法分离人羊膜上皮细胞（hAECs）,采用免疫细胞化学、免疫荧光染色及流式细胞术分析其表型特征,使用含表皮生长因子LG—DMEM培养基培养。结果采用低速旋转胰蛋白酶消化法从羊膜分离的hAECs数为（6．13±1．42）×10^7,份（n=12）,所分离的hAECs明显表达上皮细胞标志物角蛋白CK19,不表达间充质细胞标志物波形蛋白,不同程度地表达CD29、CD44和CD71。在表皮生长因子存在的条件下,hAECs生长增殖较快,培养至第6天细胞总数可增殖171倍。结论建立了人羊膜上皮细胞分离、培养及鉴定方法,hAECs具有上皮细胞的特异标志和间充质干细胞的某些表型特征。     

人羊膜间充质干细胞的分离、培养及鉴定

目的建立人羊膜间充质干细胞分离、培养及鉴定方法。方法采用低速旋转-胰蛋白酶-胶原酶消化法分离人羊膜间充质干细胞（hAMSCs）,采用免疫细胞化学和流式细胞术分析其表型特征,使用含10％FBS低糖-DMEM培养基培养。结果从羊膜分离的hAMSCs数为（6．72±1．21）×10^7/份（n=12）,所分离的kAMSCs明显表达间充质细胞标志物波形蛋白,不表达上皮细胞标志物角蛋白CK19,高表达CD29和CD44。培养10天hAMSCs数量可增殖167倍。结论建立了人羊膜间充质干细胞分离、培养及鉴定方法,hAMSCs具有骨髓间充质干细胞的表型特征。     

人皮肤成纤维细胞原代培养及生物学特性

目的 探索和建立人皮肤成纤维细胞原代培养的方法,为皮肤成纤维细胞在临床医学中的应用提供可靠的科学依据.方法 胰蛋白酶消化法分离培养人皮肤成纤维细胞;细胞生长曲线及MTT法测定细胞增殖能力;流式细胞仪测定细胞生长周期及细胞增殖指数;倒置显微镜下观察成纤维细胞生长状态;HE染色观察细胞爬片下的形态及着色;免疫组织化学染色观察成纤维细胞中间丝波形蛋白;电子显微镜下观察成纤维细胞超微结构,结果体外用胰蛋白酶消化法建立了人皮肤成纤维细胞;传5代内细胞及传5代内冻存复苏后人皮肤成纤维细胞增殖能力均很强;倒置镜下观察、HE染色、波形蛋白免疫组化染色及电镜下观察鉴定培养细胞的形态及生物学特性符合成纤维细胞.结论 本研究确立了体外人皮肤成纤维细胞原代培养.     

人羊膜上皮细胞原代培养及肝细胞特异性蛋白的表达

目的完善人羊膜上皮细胞（AECs）的原代培养技术,检测肝细胞特异性蛋白在AECs中的表达。方法采用胶原酶-胰蛋白酶联合消化法分离获取AECs并进行愿代培养。分别向培养液中添加10、20、40ng／mL表皮生长因子（EGF）和10ng／mL的碱性成纤维细胞生长因子（bFGF）,倒置显微镜观察细胞生长和增殖情况,从中选择最适宜AECs原代培养的细胞培养液。以培养液中未添加生长因子的原代培养细胞作为对照。将羊膜组织石蜡切片和AECs细胞爬片进行免疫组化染色,     

改良的胶原酶滑膜细胞分离培养法

目的 探讨一种改良的滑膜细胞培养法。方法 修剪、收集关节滑膜层,依次以胶原酶、0.2%胰蛋白酶、0.2%胰蛋白酶-0.02%EDTANa2消化,100目筛网过滤,D-hanks液洗网后培养,行显微镜、电镜、ABC法免疫组化鉴定。结果 培养的细胞具有成纤维细胞样形态和特征,免疫组化染色示vimentin阳性、CD68阴性,纯度达98%以上,符合B型滑膜细胞特点。结论 改良的胶原酶消化法是一种有效的滑膜细胞培养方法。     

BXSB狼疮小鼠胸腺上皮细胞培养方法的建立

目的：比较不同培养条件下原代狼疮小鼠胸腺上皮细胞生长情况。 方法：分别采用剪切法、剪切加胶原酶消化法、剪切加胰蛋白酶消化法建立培养体系获取自发性系统性红斑狼疮小鼠（BXSB小鼠）胸腺上皮细胞;用光镜、免疫细胞化学染色法进行细胞鉴定。 结果：含血清的培养基与含生长因子的培养基均能培养出较纯的胸腺上皮细胞;剪切法成纤维细胞污染较多,剪切加胰蛋白酶消化法细胞生长状态较差,经剪切加胶原酶消化的BXSB胸腺植块,生长状态好,成纤维细胞污染少;当原代培养的细胞长满瓶壁的90％左右时可传代,角蛋白染色阳性细胞纯度达95％以上。 结论：剪切加胶原酶消化法仅用含血清的培养基即可培养出符合实验要求的BXSB小鼠胸腺上皮细胞,是低成本、简便易行的系统性红斑狼疮模型鼠胸腺上皮细胞培养体系。     

人羊膜上皮细胞的原代及传代培养

目的 建立体外培养人羊膜上皮细胞的方法,观察体外培养的羊膜上皮细胞的生物学特性.方法 取足月剖宫产术后羊膜,经胶原酶和胰蛋白酶消化后,获取的羊膜上皮细胞接种于含10%胎牛血清培养基中进行原代和传代培养,探索其合适的培养条件,用倒置显微镜观察培养的人羊膜上皮细胞体外生长的特征.用苏木精-伊红染色、扫描电镜和细胞角蛋白免疫组织化学染色的方法对培养细胞进行形态学观察和鉴定.结果 人羊膜上皮细胞可以在体外成功的培养传代,体外可连续传8～10代.体外培养细胞呈多角形,长满后呈上皮细胞特有的铺路石样外观.扫描电镜观察细胞表面有丰富的微绒毛.细胞角蛋白keratin单克隆抗体染色阳性.结论 人羊膜上皮细胞在体外可成功进行原代和传代培养,体外培养的人羊膜上皮细胞在一定时间内可维持增殖能力.     

改良的胶原酶滑膜细胞分离培养法

目的 探讨一种改良的滑膜细胞培养法。方法 修剪、收集关节滑膜层,依次以胶原酶、０．２％胰蛋白酶、０．２％胰蛋白酶－０．０２％ＥＤＴＡＮａ２消化。１００目筛网过滤,Ｄ－ｈａｎｋｓ洗液网后培养,行显微镜、电镜、ＡＢＣ法免疫组化鉴定。结果 培养的细胞具有成纤维细胞样形态和特征,免疫组化染色显示ｖｉｍｅｎｔｉｎ阳性、ＣＤ６８阴性,纯度达９８％以上,符合Ｂ超滑膜细胞特点,结论 改良的胶原酶消化法是一种有效的     

肺泡Ⅱ型细胞培养方法的改良及其应用

目的：研究不同方法对体外培养肺泡Ⅱ型上皮细胞纯度、活力、产量、存活时间的影响。方法：采用不同浓度胰蛋白酶消化法和胰蛋白酶加胶原酶消化法消化、分离组织，低密度接种，常规浓度含血清培养和无血清培养，抗大鼠IgG包被与不包被，倒置显微镜观察细胞生长，检测细胞活力，免疫组织化学方法鉴定细胞纯度和电镜检测鉴定细胞。结果：两种方法消化、分离组织，肺泡Ⅱ型上皮细胞纯度、活力、产量、存活时间经统计学分析无显著性差异。结论：不同浓度胰蛋白酶消化分离肺组织程序相对简单、低密度接种、无血清培养所得细胞纯度能够满足体外研究肺泡Ⅱ型上皮细胞功能的需要，从而简化了体外培养肺泡Ⅱ型上皮细胞的程序。     

大鼠结肠原代成纤维细胞的分离、培养和鉴定

目的：建立简单高效的大鼠结肠成纤维细胞体外原代培养和鉴定方法,为进一步研究结肠纤维化疾病提供细胞模型。方法：取成年雄性Wistar大鼠结肠组织,采用组织块贴壁法进行成纤维细胞体外原代培养,胰酶联合差速组织块贴壁培养法分离成纤维细胞,HE染色观察细胞形态表现,免疫组织化学法观察细胞中波形蛋白（Vimentin）、α平滑肌肌动蛋白（α-SMA）、S100钙结合蛋白A4（S100A4）和E钙黏蛋白（E-cadherin）的表达,并与大鼠胸主动脉平滑肌A7R5细胞对比进行鉴定。结果：结肠组织块贴壁培养8d后成纤维细胞爬出,12d进入增殖时期,15~20d基本长满。倒置显微镜下观察,细胞呈扁平多突的纺锤形或星形;HE染色,成纤维细胞核大,卵圆形,着色浅,核仁明显。免疫组织化学染色,成纤维细胞Vimentin呈阳性表达,α-SMA、S100A4和E-cadherin均呈阴性表达;对照组大鼠胸主动脉平滑肌A7R5细胞S100A4呈阴性表达,α-SMA、Vimentin和E-cadherin均呈阳性表达。结论：采用胰酶联合差速组织块贴壁培养法成功原代培养出大鼠结肠成纤维细胞。     

原代心肌细胞培养

目的:探讨SD大鼠乳鼠心肌细胞的分离及培养方法,并进行形态学观察。方法:取出生1～3 d的SD大鼠的乳鼠,胰蛋白酶和Ⅱ型胶原酶分别消化心肌组织,差速贴壁法分离心肌细胞,并加入适量BrdU纯化心肌细胞,显微镜下观察心肌细胞形态及纯度。结果:成功分离培养心肌细胞并观察其形态,计算存活率92%,纯度90%,2～3 d出现同步搏动。结论:胰蛋白酶联合Ⅱ型胶原酶消化可分离存活率较高的心肌细胞,用差速贴壁法并加入适量BrdU可纯化心肌细胞,使细胞搏动良好。     

大鼠腓肠肌肌源细胞的培养与鉴定

目的寻求大鼠肌源细胞体外大量培养及鉴定的方法,为临床直接使用自体肌源细胞注射治疗肌组织损伤疾病奠定实验基础。方法利用胶原酶和胰蛋白酶消化3周龄大鼠腓肠肌,应用选择性培养基抑制非肌源细胞生长,采取改良的差速贴壁法纯化肌源细胞,通过形态观察、免疫组化及RT-PCR进行鉴定。结果使用F-10培养基获得了大量高纯度的大鼠肌源细胞;倒置显微镜下可观察到聚集成团和散在分布的两种形态的肌源细胞;免疫组化显示肌源细胞Desm in阳性率约90%,聚集成团的为CD34＋,大部分单个存在的为CD34-;RT-PCR显示传代细胞中均有Desm in基因的表达。结论此培养方法可在体外获得大量大鼠肌源细胞,有助于基因工程及组织工程等领域的研究。     

人类关节滑膜A型和B型细胞的分离和体外培养

目的建立一种有效分离、培养高纯度人类关节滑膜Ａ、Ｂ型细胞的方法。方法胶原酶和胰蛋白酶联合消化人关 节滑膜组织碎片,细胞悬液经 １２０目筛网滤过,与 ＣＤ１４ ｍｉｃｒｏｂｅａｄｓ混合孵育后通过磁性 ＭＡＣＳ分离柱收集非粘附细 胞及粘附细胞进行培养。用光镜、电镜、细胞免疫化学、流式细胞仪法鉴定该两种细胞类型。结果分离培养的滑膜细胞 纯度达９８％以上;粘附细胞具有巨噬细胞的特性,抗ＣＤ６８、ＣＤ１４阳性,符合巨噬细胞样滑膜细胞（Ａ型细胞）的特征; 非粘附细胞具有成纤维细胞的特性,抗Ｖｉｍｅｎｔｉｎ、Ｆｉｂｒｏｎｅｃｔｉｎ阳性,符合成纤维细胞样滑膜细胞（Ｂ型细胞）的特征。结 论胶原酶和胰蛋白酶联合消化,兔疫磁柱法是一种确切有效的分离人类关节滑膜Ａ、Ｂ型细胞的方法。     

人胚胎肾间质成纤维细胞培养及其鉴定

目的：探讨人胚胎肾脏成纤维细胞培养方法。方法：利用人胚胎肾脏肾髓质进行培养，然后通过细胞形态学，超微结构，免疫细胞化学等方法进行分析鉴定。结果：培养的细胞为长梭形，单核，超微结构为典型的成纤维细胞，并表达成纤维细胞表面抗原，波形蛋白，结蛋白，不表达角蛋白。结论：成功地培养出人胚胎肾间质成纤维细胞。     

血清饥饿对原代人脐静脉内皮细胞周期同步化的影响

目的探讨人脐静脉内皮细胞（human umbilical vein endothelial cells, HUVECs）的最佳饥饿条件,以建立高效稳定的 HUVECs体外分离提取方法,并为HUVECs相关实验提供研究基础。方法用0.1%Ⅱ型胶原酶灌注脐静脉腔消化15 min,收集 细胞并用内皮细胞专用培养基（含5%内皮细胞基础培养基、1%内皮细胞生长因子、1%青链霉素）,置37 ℃,5% CO2培养箱培 养。在倒置显微镜下观察细胞形态特点,并用细胞免疫荧光方法对所得细胞进行鉴定。用流式细胞术检测所得HUVECs的纯 度,并检测0%、0.1%、0.5%、1%血清浓度的培养基饥饿处理0、6、12、18、24 h对细胞周期的影响。结果0.1%Ⅱ型胶原酶消化可 以得到HUVECs,细胞培养呈典型的铺卵石状排列,细胞较密处呈涡旋状排列。免疫荧光检测细胞VIII因子相关抗原表达呈阳 性。流式检测细胞纯度高达99.67%。不同血清浓度培养基培养6 h可获得70%左右的G0/G1期细胞;培养12 h可获得80%~90% 的G0/G1期细胞;培养18、24 h 可获得95%左右的G0/G1期细胞。结论0.1%Ⅱ型胶原酶充盈静脉管腔可以获得高纯度的原代 HUVECs。完全无血清培养基培养12 h即可获得纯度超过80%的G0/G1期HUVECs。     

应用联合酶建立BALB/c鼠枯否氏细胞体外分离培养方法

目的用作用功效不同的酶联合消化分离BALB/c鼠枯否氏细胞(KC),建立简便易行,产量、活性、纯度较稳定的KC分离培养方法。方法将0.1%型胶原酶、0.2%链霉蛋白酶、0.01%Dnase酶按1∶1∶1比例混合原位灌注和离体消化肝组织,经Percoll梯度离心,贴壁培养纯化细胞,应用荧光显微镜观察、免疫组织化学染色、吞噬功能实验进行鉴定。结果KC获得率为(2~3)×106/鼠肝,细胞存活率达96%,免疫组化和吞噬实验鉴定细胞纯度达92%。KC贴壁后形态大小不规则,呈多角形或星形,免疫组织化学染色显示溶菌酶阳性,胞浆内见吞噬的碳素墨汁颗粒。结论用作用功效不同的酶联合消化KC,经梯度离心和贴壁培养,可获得高产量、高活性、高纯度的BALB/c鼠KC,为进一步研究KC在肝脏疾病中的作用提供可靠的细胞来源。     

人外周血树突状细胞的诱导与鉴定

目的：体外诱导、培养人外周血单核细胞获得不同成熟阶段的树突状细胞（DCs）。方法：用贴壁法从健康人外周血浓缩白细胞获取单核细胞,第一阶段在GM-CSF+IL-4存在的条件下培养7 d,获得未成熟DCs;第二阶段在GM-CSF+TNF-α联合诱导下培养至14 d,获得成熟的DCs。对DCs的形态进行显微镜下观察,用流式细胞仪检测其表型,用MTT的方法对DCs的功能进行检测。结果：获得的未成熟DCs中度表达CD1a、共刺激分子,高表达HLA-DR分子,在DCs的成熟期共刺激分子、HLA-DR及CD83、CD25分子均高度表达,刺激同种异型T淋巴细胞增殖的能力强。结论：成功地建立了诱导人外周血单核细胞获得不同发育阶段DCs的方法,并获得了大量纯度较高的DCs。     

新生大鼠心肌细胞的分离与培养

目的:建立一种简单实用的新生大鼠心肌细胞分离与培养的方法。方法:用胰蛋白酶、Ⅱ型胶原酶和分散酶消化心室肌组织,用差速贴壁法纯化心肌细胞进行培养。用台盼蓝染色法检测细胞存活率,倒置显微镜下观察细胞形态变化和细胞搏动频率。结果:从第3天开始,大部分心肌细胞出现搏动,存活率均在96%以上。培养3d的心肌细胞搏动频率较小,到第6天搏动频率达到高峰,随后几天趋于稳定。结论:应用此方法培养的心肌细胞纯度高,存活时间长,是一种稳定、可靠的新生大鼠心肌细胞的培养方法。