犬骨髓基质细胞体外成骨的实验研究

目的:研究犬骨髓基质细胞(bonemarrowderivedstromacell,BMSC)定向分化为成骨样细胞(osteoblasts-like,OBL)后的体外成骨能力和细胞内钙离子浓度的变化。方法:分离、培养犬骨髓基质细胞,并使用诱导培养液进行成骨诱导,取第3代成骨样细胞。通过碱性磷酸酶(alkalinephosphatase,ALP)染色和vonKossa染色检测BMSC分化为OBL的程度。检测细胞增殖率,比较细胞与多孔支架材料β-磷酸三钙(β-TCP)黏附前后的生长情况,用对BMSC分化前后、OBL黏附多孔β-TCP前后细胞内钙离子浓度荧光值进行统计学分析。结果:ALP染色和vonKossa染色均显示为阳性。细胞增殖率曲线结果显示,细胞黏附多孔β-TCP后增殖率没有明显差异。统计学分析发现,BMSC分化前后和OBL黏附β-TCP前后细胞内钙离子浓度荧光值均有明显的差异,P<0.05,有统计学意义。结论:犬OBL有很好的体外增殖能力和成骨能力,黏附多孔β-TCP之后,细胞的生长状况没有差别,多孔β-TCP材料对BMSC细胞内钙离子浓度有很大的影响。     

犬骨髓基质细胞和β-磷酸三钙复合物的体外构建

目的：研究犬骨髓基质细胞（bone marrow stromal cells，BMSCs）在体外骨诱导环境下和支架材料β-磷酸三钙（β-TCP）复合的可能性和生物材料的性能。方法：抽取犬骨髓3ml，在DMEM成骨条件培养液条件下贴壁法进行体外培养，将培养的第3代细胞接种于预制的3mm^3大小的β-TCP上进行体外骨诱导条件下培养，于培养第4h、第2d、第5d取细胞材料复合体进行扫捕电镜检查。结果：扫描电镜观察：材料呈多孔三维立体网状结构，平均孔径约450μm，孔内连接径约100μm。细胞接种在材料上4h后可见附着：2d后．细胞呈多角形向外伸展；5d后，细胞和材料表面紧密贴附，细胞充分伸展，分泌基质。结论：β-TCP具有良好的多孔三维立体结构和生物相容性．利于BMSCs的附着和生长，可作为骨组织工程支架材料复合种子细胞进行体内成骨研究。     

水凝胶与陶瓷化骨及β-磷酸三钙复合对骨髓基质细胞成骨能力的影响

目的：观察水凝胶（hydrogel，HG）分别与陶瓷化骨（ceramic bovine bone，CBB）、β-磷酸三钙（β-tricalcium phosphate，β-TCP）复合成的复合材料对骨髓基质细胞（MSCs）的生长、分化的影响，寻找更适合骨组织工程的复合物支架材料。方法：将诱导的骨髓基质细胞接种于CBB/HG、β-TCP/HG上，另外MSCs分别接种于单纯的CBB、β-TCP上作为对照，进行体外培养。5、10d取材，细胞计数观察贴附及增殖情况，扫描电镜观察细胞形态以及材料的贴附情况，检测碱性磷酸酶的活性以及免疫组织化学方法检测Ⅰ型胶原的分泌情况。结果：骨髓基质细胞与各组材料均能形态良好贴附，两种复合材料上贴附的细胞数量明显高于对照组，CBB/HG、β-TCP/HG两组间细胞的碱性磷酸酶的活性以及Ⅰ型胶原的分泌量无明显差别，但显著高于对照组。结论：CBB/HG、β-TCP/HG均能促进骨髓基质细胞分化及基质分泌，是一良好的组织工程骨构建复合材料。     

磷酸钙钠/β-磷酸三钙陶瓷支架接种骨髓基质细胞成骨性能的研究

目的：观察磷酸钙钠／β-磷酸三钙(NaCaPO2/β-TCP)支架接种骨髓基质细胞后植入裸鼠皮下的成骨性能。方法：通过理化方法,将煅烧牛松质骨转化为NaCaPO2/β-TCP双相钙磷陶瓷。获取兔髂骨松质骨骨髓基质细胞,体外分离、扩增、诱导后,接种于NaCaPO2/β-TCP支架。将支架／细胞复合物植入裸鼠背部皮下,NaCaPO2/β-TCP陶瓷单纯植入作为对照。植入后4、8周取材,通过大体、组织学观察,评价成骨活性。结果：支架／细胞复合物植入后4周,材料表面见相对较成熟的骨组织,内部主要为软骨;植入后8周,大量骨小梁形成。可见骨髓腔、骨髓细胞及脂肪细胞,在支架材料和骨组织的邻接区域见成骨细胞及破骨细胞。可见软骨内成骨方式。结论：NaCaPO2/β-TCP支架接种骨髓基质细胞后显示良好的成骨活性,能够促进未成熟骨矿化,可以作为骨组织工程支架材料。     

大鼠骨髓基质细胞与β-磷酸三钙体外复合培养

目的观察大鼠骨髓基质细胞与β-磷酸三钙复合后，细胞在材料表面的贴附、伸展及生长情况，探讨将细胞与β-磷酸三钙的复合体植入体内的最佳时间。方法分离的骨髓基质细胞用舍10％胎牛血清的DMEM培养，添加矿化液，将诱导培养后的细胞与预先处理过的β-磷酸三钙复合，复合后每日检测细胞生长增殖情况，并在扫描电镜下观察细胞在β-磷酸三钙表面的贴附情况。结果骨髓基质细胞接种后，在材料表面贴附良好，复合后7天细胞数量最多，是植入体内的最佳时间。结论β-磷酸三钙的生物相容性良好，可以作为骨组织工程的支架材料。骨髓基质细胞贴附材料后继续保持增殖活性，表达成骨细胞的表型，是理想的种子细胞。     

犬骨髓基质细胞和β-磷酸三钙复合物在裸鼠体内的成骨性能

目的：观察犬骨髓基质细胞（bone marrow stromal cells，BMSCs）和支架材料β-磷酸三钙（β-TCP）复合物植入裸鼠体内的成骨情况。方法：首先在体外构建BMSCs和β-TCP的复合物，大小3mm^3左右。实验分为3组：裸鼠体内植入单纯β-TCP，植入未经体外培养的BMSCs和β-TCP复合体，植入体外培养5d的BMSCs和β-TCP复合体。植入后1周、1个月和3个月取出标本，进行大体观察、X线片观察、灰度测定、组织学观察及成骨图像分析。结果：植入后3个月，BMSCs＋B-TCP体外培养组X线片密度最高，DigiDens X线片灰度值3组分别为：0．605〉0．555〉0．473（P〈0．01）。HE染色显示：1个月后，BMSCs＋β-TCP体外培养组见新骨和血管形成；3个月后，BMSCs＋β-TCP体外培养组新骨形成明显，并有大量血管生成．BMSCs＋β-TCP体外未培养组少量成骨，单纯β-TCP组未见明显成骨。成骨罔像分析3组成骨密度均数分别为：23．99％、8．36％、1．23％（P〈0．05）。结论：BMSCs＋β-TCP复合物植入裸鼠体内4周出现新骨形成．3个月时．骨形成明显并有血管化生成。     

骨髓基质细胞复合三维支架修复犬下颌骨节段性缺损

目的：探讨犬骨髓基质细胞（bone marrow stromal cells，BMSCs）体外复合预制三维下颌骨缺损仿真β-磷酸三钙（β-TCP）支架对犬下颌骨节段性缺损进行修复的可行性。方法：通过计算机辅助设计／制作和快速原型技术，制作3cm长犬下颌骨节段性缺损β-磷酸三钙支架，体外接种第3代骨髓基质细胞，培养5d天后回植，对犬一侧下颌骨节段性缺损进行修复．并设单纯材料作为对照组。术后1周、1个月、3个月观察局部伤口情况，术后1、3个月行X线片和三维CT成像，术后3个月将标本进行生物力学检测和组织学观察。结果：X线片观察显示，术后3个月，对照组缺损区低密度影，BMSCs＋β-TCP组缺损区见高密度组织；三维CT成像显示术后3个月，对照组修复区吸收明显，达1／2以上：BMSCs＋β-TCP组修复区未见明显吸收；生物力学检测显示，对照组和BMSCs＋β-TCP组的牙槽嵴高度分别为9．16mm和18．54mm，最大弯曲载荷分别为42．90N和102．77N，应力分别为1．930N／mm^2和3．504N／mm^2。应变分别为54．50％和16．98％。经统计学处理，均有显著性差异；组织学观察显示术后3个月，BMSCs＋β-TCP组成骨良好．支架周围可见多核巨细胞吞噬材料，并可见软骨形成区。结论：应用β-TCP三维支架复合犬BMSCs进行犬下颌骨节段性缺损修复存在一定的可行性。     

多孔β-磷酸三钙陶瓷支架材料对骨髓基质细胞增殖及分化作用的实验研究

目的:观察β-磷酸三钙陶瓷对骨髓基质细胞(BMSCs)增殖及分化特点的影响,验证其是否适于作为骨组织工程的支架材料。方法:将兔的BMSCs经过体外培养传代后,与多孔β-磷酸三钙陶瓷支架材料在培养板内共培养1、3、5、7、9d。采用形态学观察、MTT法及ALP检测试剂盒等方法检测BMSCs在材料表面的增殖和分化能力。结果:BMSCs能在该支架材料表面正常粘附和增殖,在体外培养时BMSCs大量增殖后有较高的碱性磷酸酶活性。结论:多孔β-磷酸三钙陶瓷适合作为支架材料负载BMSCs构建组织工程骨。     

β-磷酸三钙生物陶瓷对狗骨膜细胞生物学行为的影响

目的检测β-磷酸三钙（β-TCP）生物陶瓷对狗骨膜细胞生长、增殖和分化特点的影响，探讨β-TCP作为牙周组织工程支架材料的可行性。方法组织块法培养的骨膜细胞经传代培养后，接种于β-TCP上培养。通过MTT、流式细胞术和碱性磷酸酶试剂盒检测骨膜细胞的增殖和成骨分化情况，并通过扫描电镜观察细胞在材料表面生长情况。结果骨膜细胞能在β-TCP上贴附生长，其增殖和成骨分化能力无明显改变。结论β-TCP有望作为骨膜细胞的载体应用于牙周组织工程研究。     

多孔β-磷酸三钙的制备与性能检测

目的：制备多孔β-磷酸三钙（β-TCP）并检测其作为植骨材料的可行性和性能指标。方法：健康牛股骨松质骨经脱细胞、脱脂处理后在高温下经二次煅烧后,制备主要成份为β-TCP的脱有机质骨多孔颗粒,并进行X线衍射、扫描电镜、孔隙率和生物力学检测。结果：X线衍射检测结果显示制备的多孔颗粒主要成份为β-TCP,扫描电镜结果显示孔隙由大孔/微孔结构组成,孔隙率为57.63%,保持天然松质骨双峰曲线的孔隙结构,压缩强度4.47±0.63MPa。结论：多孔β-TCP的性能指标理想,有望成为一种理想的植骨材料。     

BMP-2和地塞米松联合诱导大鼠牙囊细胞与β-磷酸三钙生物陶瓷相容性的实验研究

目的：以BMP-2和地塞米松诱导的大鼠牙囊细胞作为种子细胞,β-磷酸三钙作为细胞支架材料,体外构建细胞生物材料复合体,观察大鼠牙囊细胞在β-磷酸三钙生物陶瓷材料的贴附、增殖情况。方法：收集培养的第3代RDFCs,血清饥饿同步化后,细胞分为四组,分别为BMP-2、Dex、BMP-2＋Dex诱导组及空白对照组。诱导3d后,将密度为4×106/ml的细胞悬液0.1ml均匀接种到预制好的β-TCP支架材料上,分别于体外培养3d、7d取细胞材料复合体,通过细胞计数、扫描电子显微镜观察细胞在材料表面的贴附、增殖情况。结果：细胞计数发现,7d时BMP-2＋Dex诱导组细胞数量显著高于BMP-2诱导组、Dex诱导组（P〈0.01）。扫描电镜观察,β-TCP表面呈多孔三维立体网状结构。细胞接种3 d和7d时,单位面积内BMP-2＋Dex诱导组细胞数量均明显高于BMP-2诱导组、Dex诱导组、对照组。结论：β-磷酸三钙具有良好的生物相容性,利于大鼠牙囊细胞的贴附和生长,证明BMP-2和地塞米松联合作用促进大鼠牙囊细胞的增殖、分化的协同效应,为进一步使用BMP-2和地塞米松诱导大鼠牙囊细胞,并与β-磷酸三钙生物陶瓷复合后体内移植实验提供依据。     

珊瑚转化型羟基磷灰石与纯相β-磷酸三钙对成骨细胞增殖活性实验研究

目的:研究珊瑚转化型羟磷灰石(CHA)、纯相β一磷酸三钙(β-TCP)对成骨细胞增殖的影响.从细胞水平评价生物材料的生物相容性,为组织工程人工骨材料的选择提供实验依据.方法:培养ST2细胞株并诱导生成成骨细胞,接种在CHA、β-TCP种植材料的表面,采用附着细胞直接计数法、MTT法检测种植后3,5,7天的细胞增殖率.结果:CHA、β-TCP均具有较好的细胞相容性,成骨细胞在CHA表面的增殖速度较β-TCP快.讨论:体外复合细胞培养可以直接观察细胞与两种可降解的生物材料(CHA、β-TCP)复合生长的情况,可以较好地评价材料细胞相容性.结论:珊瑚转化型羟基磷灰石(CHA)细胞相容性更好,更适宜作为骨组织工程支架材料.     

SDF-1α复合Pluronic F-127对兔上颌窦底提升术成骨影响的实验研究

目的 :通过制备基质细胞衍生因子(SDF1-α)的Pluronic F-127复合凝胶材料,观察这种复合材料在体外对兔骨髓间充质干细胞(BMSCs)的矿化及成血管作用和复合凝胶材料在兔上颌窦外提升术中的成骨及成血管效果。方法:将兔骨髓间充质干细胞、50ng/ml SDF1-α和质量百分比浓度0.1%的Pluronic F-127复合培养,MTT法检测其细胞毒性,碱性磷酸酶活性测定及茜素红染色。将18只新西兰大白兔双侧进行上颌窦外提升术,双侧植入不同的复合材料(共3种)并进行对照。材料分别为:β-磷酸三钙(β-TCP),生理盐水及SDF-1α复合Pluronic F-127凝胶。于术后4、8、12周处死,X线片观察双侧上颌窦骨质形成情况,行HE染色、CD31+、CD34+、BMP-2及VEGF免疫组织化学染色观察成骨及成血管作用,并进行统计学分析。结果:体外实验采用MTT法证实了0.1%w/w Pluronic F-127无细胞毒性(P>0.05)。BMSCs-SDF1α复合凝胶碱性磷酸酶染色下,细胞质可见大量碱性磷酸酶染色沉淀,其余3组未见沉淀。BMSCs-SDF1α复合凝胶、BMSCs-单纯凝胶、单纯BMSCs在成骨诱导培养条件下均产生矿化结节,非成骨诱导组未见矿化结节形成。体内实验,X线片结果显示BMSCs-SDF1-α复合凝胶及β-TCP充填侧均有阻射影,生理盐水组未见明显阻射影;HE染色结果显示BMSCs-SDF1-α复合凝胶成骨效果与β-TCP成骨效果明显,生理盐水组未见骨质形成,统计学分析表明BMSCs-SDF1-α复合凝胶成血管作用较β-TCP及生理盐水组明显增加。结论:SDF-1α复合Pluronic F-127凝胶能够成功诱导BMSCs分化为成骨细胞,无细胞毒性,在体外及兔上颌窦内成骨、成血管效果明显。     

脐带间充质干细胞复合β-磷酸三钙生物陶瓷体内外成骨能力的初步研究

目的:观察人脐带间充质干细胞(human umbilical cord mesenchymal stem cells,hUCMSCs)和支架材料β-磷酸三钙(β-TCP)生物陶瓷复合的体内外成骨情况。方法:在体外构建hUCMSCs和β-TCP的复合物,将细胞以3×105/mL的浓度接种到支架材料上进行复合体构建,并进行电镜观察、特异性免疫荧光染色、MTT、ALP检测。将复合物植入裸鼠体内,进行成骨能力研究。实验分为3组,即植入单纯β-TCP支架组、植入体外成骨诱导2周的hUCMSCs和β-TCP复合物组、单纯植入体外成骨诱导2周的hUCMSCs组。植入后2个月取出标本,进行大体观察、X线片观察和组织学观察。采用SPSS16.0软件包对实验数据进行重复测量随机区组设计的方差分析。结果:hUCMSCs植入支架4h后,即可见细胞在支架上附着,1周后可见细胞在支架中大量增殖,β-TCP具有一定的骨诱导性。复合物植入裸鼠内2个月,hUCMSCs和β-TCP复合组X线密度最高。HE染色显示,2个月后,hUCMSCs和β-TCP复合组见不规则新骨和血管形成,单纯β-TCP组未见明显新骨和血管形成。Masson染色显示,2个月后,hUCMSCs和β-TCP复合组见大量胶原形成,单纯β-TCP组未见明显胶原形成。VG染色显示,2个月后,hUCMSCs和β-TCP复合组孔隙中有大量类骨质及少量骨陷窝形成,单纯β-TCP组未见类骨质形成。结论:hUCMSCs和β-TCP具有良好的生物相容性,两者构建的复合物在植入裸鼠体内2个月时可见新骨及血管化形成。     

三维多孔β-磷酸三钙修复下颌骨节段性缺损的生物力学分析

目的：观察三维多孔β-磷酸三钙（β-TCP）形成的组织工程骨对犬下颌骨极限节段性缺损的修复能力。方法：将经过诱导的犬骨髓基质细胞（BMSCs）与3.0cm×2.0cm×1.0cm的多孔β-TCP支架复合后植入犬的下颌骨3.0cm长的全层节段性缺损处。术后6个月通过CT影像学评价β-TCP/BMSCs复合体对犬下颌节段性缺损的修复能力,并和单纯植入β-TCP材料的对照组对比,同时将缺损区组织工程骨的生物力学性能和正常的犬下颌骨对比。结果：CT影像显示实验组犬的下颌骨极限缺损区已修复,下颌骨呈连续性,且形态较对照组完美。多孔β-TCP/BMSCs构建的组织工程骨和犬正常下颌骨的抗折强度测定结果无显著性差异,而抗压强度有显著性差异,组织工程骨抗压强度小。结论：三维多孔β-TCP/BMSCs复合体构建的组织工程骨修复的犬下颌骨节段性缺损能够耐受正常生理功能需要,达到了形态和功能修复的目的,为临床下颌骨缺损修复提供了重要的实验依据。     

新型多孔纳米双相磷酸钙陶瓷支架体外细胞相容性的实验研究

目的　评价新型多孔纳米双相磷酸钙陶瓷支架材料的体外细胞相容性。方法　SD大鼠骨髓基质细胞 (BMSCs)经矿化诱导培养、扩增并检测证实其已具成骨细胞表型后,分别与多孔纳米双相磷酸钙陶瓷支架(实验组)、普通多孔羟基磷灰石陶瓷支架(对照组)体外复合培养。扫描电镜观察BMSCs在材料上的生长及生理功能表达情况;测定细胞碱性磷酸酶活性及骨钙素的含量;流式细胞仪检测细胞的凋亡及周期、倍体,比较细胞的粘附能力、增殖活力及成骨活性。结果　BMSCs经体外诱导形成钙结节,Ⅰ型胶原和碱性磷酸酶免疫染色结果阳性。两组材料上皆有细胞附着生长,但实验组细胞的粘附能力、增殖活力及成骨活性均强于对照组。结论　SD大鼠BM- SCs与新型多孔纳米双相磷酸钙陶瓷支架材料有良好的细胞相容性。     

多孔型活性CPC复合骨髓基质细胞构建组织工程骨的实验研究

目的:观察多孔型活性磷酸钙骨水泥用作骨组织工程支架材料的可行性.材料与方法:抽取成年毕格犬的骨髓,贴壁法获得骨髓基质细胞,经成骨诱导培养液体外培养、扩增、诱导后观察细胞增殖情况.将培养的第3代细胞接种于多孔型活性磷酸钙骨水泥,进行超微结构观察,并将多孔型活性磷酸钙骨水泥/骨髓基质细胞复合物植入毕格犬背部皮下,2,4周后进行组织学检测.结果:碱性磷酸酶染色呈阳性;Von Kossa染色可见钙结节形成;骨钙素免疫细胞化学染色呈阳性;超微结构观察可见细胞生长附着于材料网孔内表面;组织学检测提示4周时复合物内有新骨形成.讨论:活性多孔CPC/BMSCs骨修复材料孔径250μm,孔隙率为70%,易于BMSCs的渗入发育成骨.结论:多孔型活性磷酸钙骨水泥/骨髓基质细胞复合物显示良好的成骨活性,多孔型活性磷酸钙骨水泥可以用于骨组织工程支架材料.     

口腔颌面部整复

带颈横血管上斜方肌肌皮瓣即刻修复舌癌术后缺损21例报道;骨髓基质细胞复合三维支架修复犬下颌骨节段性缺损;犬骨髓基质细胞和β-磷酸三钙复合物在裸鼠体内的成骨性能;犬骨髓基质细胞和β-磷酸三钙复合物的体外构建;无机诱导因子支架材料行颌骨重建的放射学评价     

三维打印β-TCP颌骨修复支架的生物学评价

目的:探讨三维打印β-磷酸三钙(β-Tricalcium Phosphate, β-TCP)颌骨修复支架的生物学特性及体内成骨作用。方法:采用自动注浆技术制作β-TCP支架,将前成骨细胞(MC35T3-E1)接种在支架上,扫描电镜(SEM)观察材料结构与细胞黏附,CCK-8法检测细胞增殖,ALP法检测碱性磷酸酶活性。将2种支架复合重组人骨形成蛋白-2(recombinant human bone morphogenetic protein-2, rhBMP-2)后植入大鼠体内,发泡法制作的β-TCP支架为对照组,6周后取材行组织学观察。结果:三维打印支架具有规则多孔的立体结构,适合细胞黏附,且增殖及分化能力均高于对照组(P<0.05)。组织学显示复合rhBMP-2后三维打印支架新骨生成量高于发泡法制作的β-TCP支架(P<0.05)。结论:三维打印TCP支架生物相容性良好,复合rhBMP-2后可异位成骨。     

人牙周韧带细胞和β-磷酸三钙多孔生物陶瓷的牙周组织工程研究

目的：以多孔β-磷酸三钙(β-TCP)生物陶瓷材料作为组织工程支架,以人牙周韧带细胞(PDLCs)作为种子细胞,探索构建组织工程化牙周膜的可行性。方法：将体外培养7d的PDLCs和β-TCP的复合物,植入裸鼠背部一侧皮下,在对称部位植入单纯的β-TCP作为空白对照。术后4周、8周、12周分别取材,进行组织学检测。结果：实验组8周后支架材料部分吸收,可见未降解的支架材料孔洞内广泛分布着新生组织,其内可见小血管、腺体等结构;12周时支架材料大部分吸收,取而代之的是大量片状的新生结缔组织。空白组组织形成较少,支架材料降解与实验组相似。结论：体外培养的PDLCs与β-TCP复合后,能在体内增殖、分化,形成结缔组织,从而证明以β-TCP作为支架材料进行的牙周组织工程是可行的。