正交设计优化茴香随机扩增多态DNA反应体系的研究

目的 建立茴香的随机扩增多态DNA(RAPD)最佳反应体系.方法 正交设计及方差分析应用于建立RAPD反应体系的研究.结果 茴香的RAPD最佳反应体系为25μl的反应体系中,含10 × Buffer 2.5μl,2.0 m MdNTPs 3.0μl,2.0 U/μlTaq酶1.0 μl,2.0 μmol/L随机引物4.0 μl,30.0 ng/μl模板DNA30 ng,ddH2O 13.5μl.结论 正交设计及方差分析适用于茴香RAPD反应体系的建立.     

金钗石斛相关序列扩增多态性反应体系的正交优化研究

目的建立金钗石斛Dendrobiumnobile相关序列扩增多态性(SRAP)反应体系,为金钗石斛分子生物学研究提供技术支持。方法运用L25(56)正交设计对影响金钗石斛SRAP反应的5个因素:模板DNA、Mg2+、dNTPs、Taq酶、引物在5个水平上进行优化试验,对PCR结果进行极差分析。结果金钗石斛SRAP反应最佳体系为:25μL PCR体系中含有20 ng模板DNA,2.0 mmol/L Mg2+,0.2 mmol/L dNTPs,1 UTaq酶,0.6μmol/L引物。各因素对SRAP反应的影响依次为:Taq酶Mg2+dNTPs模板DNA引物。结论所建立的金钗石斛SRAP反应体系具有标记位点清晰、多态性丰富、稳定性好等特点,可用于金钗石斛分子生物学的研究。     

栀子及其近缘类群的随机扩增多态DNA分析

目的探索栀子与其变种雀舌栀子、重瓣栀子及变型水栀子之间的亲缘关系。方法从56个随机引物中筛选出12个引物对栀子及其近缘类群进行RAPD分析,应用SPSS10.0分析软件中的Jaccard方法计算任意两样品间的相似系数,用组内聚类方法计算得出聚类树状图。结果共得到251个有效位点。聚类分析显示,栀子与重瓣栀子最先聚类,然后与水栀子聚类,最后与雀舌栀子聚类。结论重瓣栀子与栀子亲缘关系最近,雀舌栀子与栀子的亲缘关系最远。     

白芷扩增片段长度多态性反应体系的建立及优化

目的 建立白芷扩增片段长度多态性(AFLP)反应体系及筛选出扩增条带丰富的引物.方法 以12份白芷为试材,对AFLP分析过程中包括提取DNA的方法、DNA的提取质量和浓度、Mse Ⅰ/EcoR Ⅰ酶切反应时间等进行了研究,从64对引物中筛选适合白芷的引物.结果 改良的CTAB方法提取的DNA质量比较好,建立了一种适于白芷AFLP银染技术的优化体系:模板DNA的用量为400 ng,酶切体系中Mse Ⅰ和EcoR Ⅰ反应时间为4 h,筛选出了7对适合白芷的引物.以引物E+AGC/M+CAA构建的白芷种质资源的AFLP指纹图谱,扩增带多,多态性强.结论 建立了适用于白芷的AFLP反应体系,并筛选出了适合白芷的引物,为今后利用AFLP标记技术进行白芷鉴定及种质遗传多样性分析提供了标准化程序.     

珍稀药用金钗石斛组培苗遗传稳定性直接扩增长度多态性检测

目的 研究珍稀药用金钗石斛DNA指纹图谱,初步探讨直接扩增长度多态性(DALP)分子标记技术在石斛组织培养过程中遗传稳定性检测上的应用.方法 采用直接扩增长度多态性(DALP)技术对金钗石斛野生移栽苗和组培苗进行基因组DNA多态性分析.结果 从12对引物组合中筛选出6对能获清晰条带的引物组合,分别利用琼脂糖和聚丙烯酰胺对DALP-PCR产物进行凝胶电泳,发现两组苗扩增的DNA带型基本一致,未发现明显变异,说明金钗石斛茎尖离体继代培养具有较高的遗传稳定性.结论 DALP分子标记技术可用于石斛遗传稳定性和遗传多样性研究.     

金钗石斛化学成分的研究

目的 研究金钗石斛的化学成分,为阐明其活性成分提供依据.方法 利用乙醇进行提取,硅胶柱层析、制备薄层层析和Sephadex LH-20柱层析进行分离纯化,波谱分析(核磁共振氢谱、碳谱和质谱)确定结构.结果 分离并鉴定了4 个化合物,分别为: moscatin (Ⅰ),gigantol (II),batatasin III (III),stigmasterol (IV).结论 化合物Ⅰ为首次从该植物中得到.     

金钗石斛居群遗传多样性分析及DNA指纹图谱构建

目的 探讨不同地区金钗石斛Dendrobium nobile居群间的遗传多样性及遗传分化关系。方法 基于引物结合位点间扩增（inter-primer binding site，iPBS）分子标记对广西5个县共35份金钗石斛进行遗传关系、遗传多样性和种群间遗传分化分析，并构建能区分35份金钗石斛种质的DNA指纹图谱。数据分析使用NTSYS-pc 2.10e统计软件计算遗传相似系数并构建聚类分析图谱，采用Popgene 1.32软件计算遗传多样性指数与居群遗传分化系数。结果 8条iPBS引物共扩增出158条条带，多态性条带为143条，多态条带百分率（percentage of polymorphic bands，PPB）为90.51%；在遗传距离0.70处，35份种质分为7大类群，居群在分子水平上出现明显分化；遗传相似系数（genetic similarity coefficient，G_s）变化范围为0.559 0～0.975 9，变幅为0.416 9；平均观测等位基因数（observed number of alleles，N_a）、平均有效等位基因数（effective number of alleles，N_e）、Nei’s基因多样性指数（Nei’s gene diversity index，H_e）、Shannon多样性信息指数（Shannon information index，I）分别为1.898 7、1.505 0、0.300 7、0.454 2，居群间存在丰富遗传多样性；基因多样度（total genetic diversity，H_t）、各居群基因分化系数（gene diversity within population，H_s）、居群间遗传分化系数（coefficient of gene differentiation，G_st）分别为0.299 8、0.214 9、0.283 0，居群间遗传变异占总变异的28.30%，居群内的遗传变异占总变异的71.70%，遗传变异主要来源于居群内部；基因流（gene flow，N_m）为1.266 5，居群间存在较高水平的基因交流。引物2219和2399可单独鉴别出35份种质，试验基于引物2399的“0，1”矩阵构建35份种质的指纹图谱，此图谱可为金钗石斛品种的分类与鉴定提供参考。结论 金钗石斛居群间遗传多样性较丰富，总变异主要来源于居群内变异，居群间存在较高水平的基因交流。揭示了金钗石斛种质间的遗传关系及其居群遗传多样性，为野生金钗石斛种质的保护工作的开展奠定基础。     

美花石斛RAPD-PCR反应体系的建立

目的建立美花石斛基因组DNA的RAPD-PCR最佳反应体系。方法在提取纯化美花石斛基因组DNA的基础上,利用PCR扩增技术和方法,对Mg2 ,dNTP,模板DNA,引物,Taq聚合酶等反应条件进行优化。结果反应体系的最佳条件是总体积为25μl,其中Mg2 浓度1.2 mmol.L-1,Taq聚合酶1.2U,引物浓度0.3 mmol.L-1,模板DNA 46 ng和dNTPs 160 mmol.L-1;PCR扩增程序为94℃预变性3 min,94℃变性50 s,40℃退火1 min,72℃延伸2 min,循环40次,72℃延伸5 min。结论该反应体系具有经济,简便以及扩增条带较清晰而稳定等特点。     

沉香随机扩增多态性DNA反应体系的建立

目的对影响沉香随机扩增多态性DNA（RAPD）反应的各因素进行优化,建立适用于沉香RAPD的最佳反应体系。方法采用改良的CTAB法提取基因组DNA,变化单一因素的方法对模板DNA浓度、Taq酶用量、dNTPs、引物浓度、Mg^2＋浓度、退火温度对RAPD影响进行分析。结果建立了适合沉香RAPD分析的最佳反应体系：在20μl反应体系中,模板DNA用量20ng、Taq酶1．0U、dNTPs浓度为0．3～0．4mmol·L^-1、随机引物浓度为0．6μmol·L、Mg^2＋浓度1．5—2．0mmol·L^-1、PCR反应条件：94℃,10min;94℃,1min;36℃,1min;72℃,2min;45个循环,72℃,8min。结论该反应体系具有良好的稳定性和重复性。     

金钗石斛化学成分的研究

 目的　对金钗石斛 (Dendrobium nobile Lindl)茎的化学成分进行研究。方法　使用硅胶柱色谱进行分离纯化,理化性质和光谱分析鉴定结构。结果　分离并鉴定了5个单体化合物及2个系列混合物。分别为海松二烯,3-甲氧基-4-羟基反式肉桂酸二十二烷酯,3-甲氧基-4-羟基反式肉桂酸二十四烷酯,豆甾醇,对羟基顺式肉桂酸三十烷酯,对羟基反式肉桂酸直链烷酯的4个系列化合物的混合物,直链烷醇的5个系列化合物的混合物。结论　以上成分均为首次从该种植物中分得,其中海松二烯为首次从该属植物中分得。     

金钗石斛多糖的组织化学定位研究

目的优化金钗石斛多糖组织化学定位方法,明确金钗石斛多糖的分布和积累特征。方法采用徒手切片和冰冻切片方法制作金钗石斛根、茎和叶片横切片,利用组织化学定位方法对金钗石斛多糖进行定位分析。结果徒手切片法比冰冻切片法更适用于金钗石斛多糖的组织化学定位研究,金钗石斛多糖主要分布在根的皮层薄壁细胞、茎的维管束周围薄壁细胞核叶片薄壁细胞内。多糖在茎内分布最多,其次是叶片,根中分布较少。结论组织化学定位方法是一种研究和分析金钗石斛多糖的快速简便的技术和方法,金钗石斛叶片的开发多糖潜力较大,应充分利用。     

金钗石斛生物碱药理作用研究进展

综述金钗石斛生物碱药理作用研究进展。金钗石斛生物碱是金钗石斛药用的主要活性成分,具有抗白内障、抗肿瘤、保护神经、降血糖、降血脂、抗氧化等药理作用。     

自动电位滴定法测定金钗石斛药材中总生物碱的含量

目的:测定金钗石斛药材中总生物碱的含量。方法:药材以90%乙醇回流提取3次,醇提液浓缩至无醇味后以3%盐酸溶解,酸水溶液经强酸型阳离子交换树脂柱吸附,以去离子水洗脱至中性后,收集5%氨水-50%乙醇液洗脱流份(以生物碱的检识反应判定终点)并浓缩至干,即得含量测定用供试品。供试品在冰醋酸中以高氯酸滴定液(0.1mol/L)自动滴定,由此以石斛碱(C16H25NO2)为基准物计算金钗石斛中生物碱的含量(每1mL高氯酸滴定液相当于石斛碱26.3mg)。结果:三个批次金钗石斛药材的总生物碱含量测定结果分别为0.85%、0.63%、1.03%。结论:经方法学考察,该含量测定方法具有良好的专属性和灵敏度,检测结果稳定可靠,可用于金钗石斛药材中总生物碱的定量分析。     

金钗石斛提取物抗白内障的体外实验研究

目的研究金钗石斛总生物碱和粗多糖对白内障的抑制作用。方法采用溶剂提取法分离提取金钗石斛总生物碱和粗多糖;DMEM低糖培养基体外培养Wistar大鼠晶状体,将晶状体分为7个组,分别在培养后6、12、18、24 h四个时段观察并记录晶状体混浊度的改变;最后,检测各组晶状体水溶性蛋白、GSH的含量、及T-SOD和MDA的活性。结果在培养的各个时段,正常对照组晶状体始终保持透明,各药物组晶状体混浊度与模型组相比明显较轻（P〈0.05）,而石斛总生物碱高剂量组和阳性对照组混浊程度最轻;金钗石斛总生物碱组、粗多糖组晶状体水溶性蛋白、GSH含量及T-SOD活性均升高,同时MDA的活性降低;其中总生物碱高剂量组晶状体水溶性蛋白含量显著高于阳性对照组水平（P〈0.05）,其MDA活性则显著低于阳性对照组（P〈0.05）。结论金钗石斛总生物碱和粗多糖在体外均有一定的抗白内障之效,而总生物碱的效果优于粗多糖。     

异地板蓝根基因组DNA指纹图谱建立及RAPD-PCR反应体系优化

目的：采用RAPD法研究不同地区板蓝根基因组DNA遗传差异性,药材的真假。方法：利用RAPD（ random amplified polymorphic DNA）技术,在分子水平上对不同地区板蓝根基因组DNA进行了遗传差异性分析,同时优化板蓝根RAPD-PCR反应体系。结果：指纹图谱显示出不同地区板蓝根资源丰富的遗传多样性,可以辨别出药材的真假和优劣。结论：RAPD技术为鉴别中药材板蓝根真伪和优劣提供了现实意义,为临床安全和合理用药提供理论依据,并建立适合板蓝根RAPD-PCR的最佳反应体系。     

金钗石斛中生物碱与多糖联合酶提工艺的优化

目的优化金钗石斛中生物碱与多糖的联合酶提工艺。方法以加酶量、酶解温度、酶解时间、料液比为影响因素,石斛碱、总生物碱、多糖含有量为评价指标,正交试验优化联合酶提工艺。结果木瓜蛋白酶提取的最佳条件为加酶量0.10 g,酶解温度45℃,酶解时间2 h,料液比1∶50,石斛碱、总生物碱、多糖含有量分别为3.495 5、4.341 8、35.898 7 mg/g;纤维素酶提取的最佳条件为加酶量0.30 g,酶解温度50℃,酶解时间2 h,料液比1∶40,3种成分含有量分别为3.514 8、4.351 3、36.331 2 mg/g;果胶酶提取的最佳条件为加酶量0.45 g,酶解温度55℃,酶解时间2.5 h,料液比1∶40,3种成分含有量分别为3.524 4、4.452 8、26.324 2 mg/g。结论该方法稳定、可靠、快速,可用于联合酶提金钗石斛中生物碱与多糖。     

金钗石斛试管苗繁育技术操作规程(草案)

1范围本部分规定了金钗石斛试管苗的繁育、炼苗环境、适宜条件及出瓶苗、出圃苗的质量分级。本标准适用于云南省西双版纳州金钗石斛种植单位及种植户。2规范性引用标准下列文件中的条款通过本标准的引用而成为本标准的条款。本标准操作实施时,所参照的标准均有效。在参照时作修     

金钗石斛光合作用特征的初步研究

利用LiCor-6400光合测定系统测定了不同天气条件下，金钗石斛叶片24hCO2吸收的动态变化，以及CO2吸收对有效光合辐射的响应。结果表明：晴天，白天和夜间金钗石斛都能吸收CO2，中午有光下呼吸现象，CO2的交换方式具景天酸代谢途径（CAM）的特点；阴雨天，中午没有光下呼吸现象，白天都在吸收CO2，夜间21：00仍有CO2吸收，23：00以后至次日凌晨处于暗呼吸状态。金钗石斛叶片CO2吸收对光照强度的效应表现出强光抑制现象，饱和光照强度为1000μmol/m^2s。叶片受到强光照射后，光合饱和点降低，CO2吸收速率下降，说明金钗石现象，饱和光照强度为1000μmol/m^2s。叶片受到强光照射后，光合饱和点降低，CO2吸收速率下降。说明金钗石斛是兼性景天酸代谢植物，随着环境条件变化，光合作用可在CAM途径与C3途径间变化，这一光合特性可能是金钗石斛适应需荫环境和生物缓慢，稀少的主要原因之一。     

地龙ISSR-PCR反应体系的建立与优化

目的 建立和优化地龙ISSR-PCR反应体系.方法 以地龙药材为实验试材,采用异丙醇沉淀法提取了地龙总DNA模板,对地龙ISSR-PCR反应体系中各个主要影响因子进行了优化和筛选.结果 建立了标记位点清晰、稳定、重复性好,可用于地龙ISSR分析的最佳反应体系,50 μl体系中含有:1×Taq酶配套缓冲液,DNA模板50 ng,2.5U Taq DNA聚合酶,2 mmol/L MgCl2,0.8 μmol/L引物,0.2 mmol/L dNTPs.扩增程序为:94℃预变性5 min;94℃变性30 s,(据不同引物的退火温度)复性30 s,72℃延伸1.5 min,共35个循环;72℃延伸5 min,反应结束后,4℃保存.结论 这一优化体系的建立为今后利用ISSR标记技术进行地龙类药用动物鉴定及种质资源遗传多样性分析奠定了基础.