恶性疟原虫乳酸脱氢酶活性测定及在药物疗效监测方面的初步观察

目的探讨疟原虫乳酸脱氢酶(Plasmodiumlactatedehydrogenase,pLDH)活性与原虫密度、培养时间的关系,以及在监测药物疗效等方面的作用。方法利用酶比色法对不同原虫密度、不同培养时间以及药物治疗前后患者的血样进行pLDH活性检测。结果pLDH的活性随恶性疟原虫感染率的提高、培养时间的增加而明显地升高,最大活性是在虫体培养36~48h之间,虫体主要处在裂殖体期和滋养体期;混合感染(恶性疟原虫和间日疟原虫)患者经药物治疗后血液中pLDH活性明显降低,治疗5d后已检测不到pLDH的活性。结论pLDH活性检测对于疟原虫克隆株鉴定、药物的疗效监测等方面具有一定的应用价值。     

恶性疟原虫乳酸脱氢酶活性的初步检测

以３－乙酰吡啶（ＡＰＡＤ）作为辅酶而设计的数量酶比色法检测恶性疟原虫乳胶脱氢酶活性。结果显示：ＰＬＤＨ的ＯＤ值随恶性疟原虫率的提高而明显升高,特别是当原虫率达１％以上时,ＰＬＤＨ的ＯＤ值更显著,但在低原虫率（０．４％以下）时,阳性血样与阴性血样ＯＤ值有时错位或不能区别。同时显示,同样的原虫率血样裂殖体（Ｓ）和大滋养体（Ｔ）期比环状体（Ｒ）期ＰＬＤＨ的ＯＤ值明显升高。     

重组恶性疟原虫乳酸脱氢酶的纯化及免疫活性测定

目的:研究恶性疟原虫乳酸脱氢酶(LDH)重组蛋白纯化和复性的最佳条件。方法:重组质粒PGEX-4T-1-LDH在E.coli BL21中表达，表达产物用酶裂解法洗涤、变性、复性、Q-Sepharose High Performance离子交换层析方法纯化。结果:获得具有生物活性的蛋白，其纯度达到95％。结论:此方法操作简便，纯化效果好。     

恶性疟原虫乳酸脱氢酶单克隆抗体的制备及其特性鉴定

为制备抗恶性疟原虫乳酸脱氢酶（LDHp）单克隆抗体（McAb）,并对其特异性进行鉴定,用纯化的LDHp重组抗原免疫BALB/c小鼠,采用杂交瘤技术制备McAb,筛选出分泌高滴度McAb的杂交瘤细胞株,测定其免疫球蛋白亚类及其效价,ELISA、Westen blotting试验分析其特导性。结果,制备出2A5和 1H10两株能稳定分泌抗LDHp　McAb的杂交瘤细胞株,两株单抗均为IgG2b,2A5和1H10培养上清的ELISA效价分别为1:512和1:256,腹水效价分别为1:25600和1:12800,两株单抗与间日疟、红细胞、弓形虫、日本血吸虫等抗原均不发生交叉反应,能识别恶性疟原虫的33Kda虫源蛋白。证明制备的抗LDHp杂交瘤细胞株能分泌高滴度和高特异性的单抗。     

用乳酸脱氢酶为靶分子的免疫层析技术检测恶性疟原虫

目的建立一种免疫胶体金层析(GICA)法用于恶性疟原虫的检测。方法采用杂交瘤技术制备恶性疟原虫乳酸脱氢酶(LDHpf)单抗，利用筛选出来的单抗制成诊断恶性疟原虫的免疫层析条，以镜检和PCR法为对照，用GICA条检测门诊“四热”病人血样，评价其敏感性和特异性，并对其稳定性进行了初步研究。结果筛选出4株抗LDHpf单抗．间接ELISA表明4株单抗仅与恶性疟原虫发生反应，而与间日疟原虫、红细胞蛋白、刚地弓形虫和日本血吸虫不发生交叉反应。Western—blot结果显示4株单抗能识别恶性疟原虫相对分子质量约为33000处的虫源蛋白。以镜检法和PCR法为标准，CICA条检测恶性疟原虫的敏感性分别为88.37％和86．67％．DICA与镜检法的符合率均为91．55％。结论GICA检测恶性疟原虫简易快速、灵敏度高，无需特殊仪器设备，有望成为一种恶性疟原虫快速免疫诊断试剂盒。     

间日疟原虫乳酸脱氢酶的表达、纯化及免疫活性的鉴定

目的 在大肠杆菌中表达间日疟原虫乳酸脱氢酶(PvLDH)与谷胱甘肽S-转移酶(GST)融合蛋白,对重组蛋白进行纯化并测定其免疫活性.方法 将构建的LDH/pGEX-4T-1重组菌BL21接种于LB培养基中,异丙基硫代半乳糖苷(IPTG)诱导重组融合蛋白的表达,重组蛋白纯化后免疫小鼠制备特异性血清,ELISA检测血清效价,Western-blotting鉴定其免疫活性.结果 重组质粒在大肠杆菌中表达PvLDH与谷胱甘肽S-转移酶(GST)的融合蛋白,表达产物主要以包涵体形式存在,经复性、纯化后免疫小鼠,能诱导小鼠产生特异性体液免疫应答,ELISA法测效价为1:51200,Western-blotting结果显示该血清能特异性与间日疟和恶性疟患者全血发生反应,而不能与正常人起交叉反应.结论 PvLDH在大肠杆菌中获得高效表达且表达产物具有良好的抗原性和免疫原性.     

恶性疟原虫谷氨酸脱氢酶的表达及免疫活性鉴定

目的：在大肠杆菌中表达恶性疟原虫谷氨酸脱氢酶（GDH）与谷胱甘肽S-转移酶融合蛋白，测定重组蛋白的免疫活性。方法：采用PCR方法特异性扩增恶性疟原虫（海南株）GDH基因，双酶切后克隆入pGEX-4T-1载体中进行诱导表达，重组蛋白纯化后免疫小鼠制备特异性血清，并用琼脂双向扩散法检测效价，ELISA、Westernblotting检测重组抗原的免疫活性。结果：获到了重组表达的抗原蛋白，表达产物能与鼠抗恶性疟原虫血清发生特异反应，并能诱导小鼠产生特异性体液免疫应答，免疫琼脂扩散法检测抗体滴度为1：16。结论：恶性疟原虫GDH在大肠杆菌中获得高效表达且表达产物具有良好的抗原性。     

用乳酸脱氢酶为靶分子的免疫层析技术检测恶性疟原虫

目的 建立一种免疫胶体金层析(GICA)法用于恶性疟原虫的检测。方法 采用杂交瘤技术制备恶性疟原虫乳酸脱氢酶(LDHpf)单抗,利用筛选出来的单抗制成诊断恶性疟原虫的免疫层析条,以镜检和PCR法为对照,用GICA条检测门诊"四热"病人血样,评价其敏感性和特异性,并对其稳定性进行了初步研究。结果 筛选出4株抗LDHpf单抗,间接ELISA表明4株单抗仅与恶性疟原虫发生反应,而与间日疟原虫、红细胞蛋白、刚地弓形虫和日本血吸虫不发生交叉反应。Western-blot结果显示4株单抗能识别恶性疟原虫相对分子质量约为33000处的虫源蛋白。以镜检法和PCR法为标准,GICA条检测恶性疟原虫的敏感性分别为88.37%和86.67%,GICA与镜检法的符合率均为91.55%。结论 GICA检测恶性疟原虫简易快速、灵敏度高,无需特殊仪器设备,有望成为一种恶性疟原虫快速免疫诊断试剂盒。     

儿童恶性血液血清免疫抑制酸性蛋白及乳酸脱氢的测定

采用单向琼脂免疫扩散法，检测小儿恶性血液病患者、正常儿童血清免疫抑制酸性蛋白及ＬＤＨ水平。结果表明：恶性血液病患者血清ＩＡＰ及ＬＤＨ明显升高。ＩＡＰ、ＬＤＨ异常率分别为：ＡＬＬ组９０％、７３．３％；ＡＮＬＬ组８９．４％、７８．９％；淋巴瘤组８０％、１００％。     

唾液乳酸脱氢酶及其同工酶对牙周病的诊断效能

目的探讨唾液乳酸脱氢酶（LD）活性及其同工酶在诊断牙周病中的意义。方法牙周病患者52例（其中牙龈炎18例、中度牙周炎23例和重度牙周炎11例）和健康对照20例被纳入研究。测定所有受试者总LD活性其及同工酶含量,并比较同工酶的相对含量和绝对含量的诊断性能。结果LD酶在所观察的疾病组间差异均有统计学意义（F=14．297,P=0．000）。ROC曲线分析显示：对诊断牙周病总LD活性与同工酶绝对含量较佳,其特异性在90．0％～100．0％,敏感度在69．2％～76．2％,Youden指数在0．592～0．731,阳性预测值在95．1％～100．0％,阴性预测值在56．3％-76．2％60．0,曲线下的面积在0．836～0．896。相对含量检测无统计学意义。结论唾液LD及其同工酶活性可能反映牙周组织损伤,提示LD及其同工酶可能是易于诊断牙周病的有用指标。但同工酶的相对含量测定对诊断牙周病的意义不大。     

疟原虫乳酸脱氢酶Mab在疟疾诊断和疗效考核上的应用

目的评估疟疾乳酸脱氢酶单克隆抗体快速检测试剂在疟疾诊断和鉴别诊断上的特异性和敏感性以及考核疟疾治疗效果。方法使用OptiMal—IT金标层析快速检测试剂诊断和鉴别诊断间日疟57例，恶性疟5例；用传统的厚薄血片进行病原学对比诊断。同时用OptiMal—IT金标层析法考核治疗效果。结果OptiMal—IT金标层析法与病原学诊断间日疟和恶性疟原虫虫的符合率为100％，疟原虫患者治疗后3d OptiMal—IT金标层析法检测为阴性。结论OptiMal—IT金标层析法是一种快速、简便、特异性强、敏感性高的疟疾诊断和鉴别诊断试剂，可以用于快速应急检测，同时疟疾患者治疗后，若患者体内无活的疟原虫，OptiMal—IT金标层析为阴性，提示疟疾乳酸脱氢酶单克隆抗体OptiMal—IT金标层析可现场应用于疟疾快速诊断和疟疾治疗效果考核。     

间日疟原虫乳酸脱氢酶单克隆抗体的制备及其鉴定

目的研制间日疟原虫乳酸脱氢酶(PvLDH)单克隆抗体,并对抗体特性进行了初步鉴定。方法用纯化的重组PvLDH蛋白免疫BALB/c小鼠,取其脾细胞与小鼠骨髓瘤细胞SP2/0进行融合,间接ELISA法筛选阳性杂交瘤细胞,测定其免疫球蛋白亚类及效价,结合ELISA、Western blot试验分析其特异性。结果共获得5株稳定分泌抗PvLDH重组蛋白单克隆抗体的杂交瘤细胞,分别为6D1、6D2、5A10、5C7、4A8。5株单抗培养上清的ELISA效价为1∶512～1∶1024,腹水效价为1∶12800～1∶25600,其中5C7、6D1经Western-blot鉴定能与天然的恶性疟原虫和间日疟原虫的LDH发生特异性反应。结论本研究方法成功制备并获得了针对PvLDH的单克隆抗体,为进一步研究疟疾诊断试剂奠定了基础。     

高中生应对效能量表的编制及初步应用

目的 探明高考考生应对效能的状况.方法 采用自编的高中生应对效能量表,随机抽取金华市389名高三和高复生进行研究.结果 经过探索性因素分析,量表由胜任力,自信水平,对应激源的认知和对应对方式的认知四个因子组成,累计解释率为53.837%,重测信度是0.72,内部一致性系数是0.93,分半信度是0.83.独生子女在总分、自信水平、胜任力和对应激源的认知上显著高于非独生子女.男生在自信水平上显著高于女生.高考考生与高复考生没有显著差异.城市、城镇和农村考生之间没有显著差异.结论 提高女生和非独生子女考生的应对效能水平应该成为今后学校心理辅导和预防心理危机的课题.     

高中生应对效能量表的编制及初步应用

目的探明高考考生应对效能的状况。方法采用自编的高中生应对效能量表,随机抽取金华市389名高三和高复生进行研究。结果经过探索性因素分析,量表由胜任力,自信水平,对应激源的认知和对应对方式的认知四个因子组成,累计解释率为53.837%,重测信度是0.72,内部一致性系数是0.93,分半信度是0.83。独生子女在总分、自信水平、胜任力和对应激源的认知上显著高于非独生子女。男生在自信水平上显著高于女生。高考考生与高复考生没有显著差异。城市、城镇和农村考生之间没有显著差异。结论提高女生和非独生子女考生的应对效能水平应该成为今后学校心理辅导和预防心理危机的课题。