恶性疟原虫乳酸脱氢酶活性测定及在药物疗效监测方面的初步观察

目的探讨疟原虫乳酸脱氢酶(Plasmodiumlactatedehydrogenase,pLDH)活性与原虫密度、培养时间的关系,以及在监测药物疗效等方面的作用。方法利用酶比色法对不同原虫密度、不同培养时间以及药物治疗前后患者的血样进行pLDH活性检测。结果pLDH的活性随恶性疟原虫感染率的提高、培养时间的增加而明显地升高,最大活性是在虫体培养36~48h之间,虫体主要处在裂殖体期和滋养体期;混合感染(恶性疟原虫和间日疟原虫)患者经药物治疗后血液中pLDH活性明显降低,治疗5d后已检测不到pLDH的活性。结论pLDH活性检测对于疟原虫克隆株鉴定、药物的疗效监测等方面具有一定的应用价值。     

伯氏疟原虫氯喹抗性株红内期虫体的凋亡

目的：研究伯氏疟原虫（Plasmodium berghei)氯喹抗性（RC）株红内期虫体细胞危机状态的性质。方法：应用光学显微镜和透射电镜及基因组DNA琼脂糖电泳技术,观察感染伯氏疟原虫RC株或氯喹敏感（N）株ICR小鼠在原虫血症上升期和感染RC株小鼠自愈期虫体的显微及超微结构,以及基因组DNA琼脂糖电泳图谱。结果：在光镜下,原虫血症上升期的RC株和N株虫体结构无异常;而RC株感染小鼠自愈期虫体密度下降,大部分虫体固缩,周围呈空泡状。在电镜下,原虫血症上升期的RC株和N株红内期虫体胞膜结构完整,核位于一侧,胞质内可见各种细胞器,代谢窗明显。N株滋养体可见食物泡和疟色素。但RC株感染小鼠自愈期红内期虫体呈球形或椭圆形;胞膜完整,核固缩,胞质浓缩,线粒体和膜状结构消失,未见代谢窗结构。原虫血症上升期的RC株和N株红内期虫体基因组DNA电泳均为一条带,而RC株感染小鼠自愈期红内期虫体基因组DNA电泳呈典型的梯形条带。结论：伯氏疟原虫RC株红内期虫体危机状态的性质是凋亡。     

恶性疟原虫乳酸脱氢酶活性的初步检测

以３－乙酰吡啶（ＡＰＡＤ）作为辅酶而设计的数量酶比色法检测恶性疟原虫乳胶脱氢酶活性。结果显示：ＰＬＤＨ的ＯＤ值随恶性疟原虫率的提高而明显升高,特别是当原虫率达１％以上时,ＰＬＤＨ的ＯＤ值更显著,但在低原虫率（０．４％以下）时,阳性血样与阴性血样ＯＤ值有时错位或不能区别。同时显示,同样的原虫率血样裂殖体（Ｓ）和大滋养体（Ｔ）期比环状体（Ｒ）期ＰＬＤＨ的ＯＤ值明显升高。     

恶性疟原虫红内期在体外存活时间的实验观察

目的 观察恶性疟原虫红内期在体外存活时间，分析其培养虫血的感染活力。方法 采用Tragers等常规体外培养方法，待恶性疟原虫体外连续培养的原虫率达到15％～20％时，吸取含虫血于保存液置4℃贮存，以后每天吸取少量虫血培养，24h观察原虫生长情况。结果 恶性疟原虫血4℃贮存2d疟原虫减虫率80．6％，10d几乎为100％；11d已未发现疟原虫。结论 估算体外培养的恶性疟原虫红内期在体外4℃贮存，存活时间不超过11d。     

恶性疟原虫顶端膜抗原1基因转染伯氏疟原虫模型的建立

目的：建立恶性疟原虫顶端膜抗原1（AMA-1）基因转染伯氏疟原虫的模型．方法：将含有恶性疟原虫AMA-1基因的重组转染质粒pDB.DTm. DB./AB. AF. DB．用Bgl Ⅰ酶切线性化．伯氏疟原虫经体外培养和分离后进行电转化,转化的原虫经药物筛选后进行PCR检测．结果：PCR检测显示转染伯氏疟原虫存在恶性疟原虫AMA-1基因．结论：成功建立了恶性疟原虫AMA-1基因转染伯氏疟原虫的模型,为进一步研究提供了基础．     

恶性疟原虫体外短期无血清培养上清可溶性抗原的纯化和分析

本实验对恶性疟原虫(FCC—1/HN)裂殖体体外短期无血清培养上清可溶性抗原进行了纯化,并用CIE及ELISA法检测和分析上清可溶性抗原的免疫学活性.结果表明,恶性疟原虫体外短期无血清培养上清中有可溶性抗原存在,抗原特异性与恶性疟原虫虫体抗原相似:经亲和层析纯化的上清抗原中不含可测水平的红细胞膜抗原成分.     

恶性疟原虫红内期的体外培养及其影响因素

液氮内保存的FCC—1株恶性疟原虫红内期用蜡烛缸—平皿法体外连续培养40天。疟原虫复苏后培养的第3天原虫密度开始上升.第11天达到最高峰,其中一皿的红细胞含虫率高达20.56%。影响恶性疟原虫体外培养的有关因素如RPMI—1640培养液,血清和红细胞,本文进行了讨论。     

感染型别及治疗方法对恶性疟原虫LDH抗原清除时间的影响

目的 比较不同疟原虫感染型别及治疗方法对患者体内恶性疟原虫LDH抗原清除时间的影响。方法 依据临床资料,在联合国刚果（金）稳定特派团维和二级医院及一级医院确诊的疟疾患者中按照其疟原虫感染型别及治疗过程的差异选取患者,组成4组,每组纳入10例。在疟疾病人疗程结束后的第3天、第7天、第14天、第21天分别采集外周血,使用基于LDH的疟原虫快速检测试剂盒检测患者体内的pf LDH抗原残留。结果 恶性疟原虫单一感染组与恶性疟原虫混合感染组在pf LDH转阴时间上差异无统计学意义（P>0.05）,两个青蒿琥酯注射治疗组与口服青蒿琥酯/阿莫地喹片治疗组在pf LDH转阴时间上差异均有统计学意义（P<0.05）, 两个青蒿琥酯注射治疗组之间在pf LDH转阴时间上差异无统计学意义（P >0.05）。结论 不同疟疾感染类型对于患者体内恶性疟原虫LDH抗原持续时间无影响,青蒿琥酯注射疗法较口服青蒿琥酯/阿莫地喹片疗法能更快地清除患者体内的恶性疟原虫LDH抗原。     

用猴血及猴血清培养恶性疟原虫的实验研究

本实验以猴血细胞配以不同比例的人血细胞及猴血清培养恶性疟原虫，研究猴血细胞对恶性疟原虫的敏感性，不同比例猴血细胞及猴血清对原虫感染率的影响，结果表明猴血细胞对人恶性疟原虫不敏感，一定比例的人，猴血细胞培养恶性疟原虫对其感染率的影响不大，但较低比例的人血细胞对恶性疟原虫的感染率有一定的影响，猴血清对人疟的生长没有显著的影响。     

一氧化氮对红内期约氏疟原虫感染的影响

目的：探讨的氏疟原虫感染早期一氧化氮（nitric oxide,NO)对红内期疟原虫的影响。方法：通过ELISA和Griess反应,观察疟原虫感染早期宿主体内细胞因子和NO对红内期虫体血症的影响及其效应。结果：疟原虫感染早期随着以IFN-γ分泌增加为主的Th1细胞免疫应答产生的过程,NO合成逐渐增加,红内期原虫血症受到抑制,一旦解除高水平NO的作用,虫体的增殖能力即可迅速得以恢复。结论：NO通过抑制裂殖子的侵袭力发挥抗红内期原虫感染的保护性免疫效应。     

TAT融合蛋白转导红内期恶性疟原虫

目的:探讨TAT-p53融合蛋白转导进入红内期恶性疟原虫的特性. 方法:将纯化的TAT-p53融合蛋白和p53蛋白分别与培养疟原虫共孵育30 min后,制备血涂片,利用间接免疫荧光方法检测融合蛋白的转导. 同时计算融合蛋白与疟原虫共孵育12 h前后的感染率变化,观察蛋白转导对疟原虫生长的影响. 结果:TAT-p53融合蛋白可以突破红内期疟原虫各层细胞膜,进入虫体细胞内,并可根据荧光观察到融合蛋白主要分布在疟原虫滋养体和晚期裂殖体,而p53蛋白不能进入疟原虫内. 融合蛋白与疟原虫共孵育12 h后其感染率与对照组之间无显著差异(P>0.05),说明蛋白转导对疟原虫的生长没有影响. 结论:TAT融合蛋白可以转导进入疟原虫内,这将为疟原虫相关基因功能的研究提供一种新方法.     

伯氏疟原虫哌喹抗性系的建立及其抗性表型特征观察

目的:建立伯氏疟原虫(P.b.)抗哌喹(PQR)系鼠疟模型;比较其抗性表型基本特征.方法:采用鼠-鼠间血传、药物剂量递增法对P.b.ANKA哌喹敏感株(PQS)进行抗性培育,通过测定PQS ED50和PQR ED50计算抗性指数及抗性稳定性;显微镜观察虫体形态变化、计数原虫率,记录分析小鼠接种后存活时间及肝、脾及体重变...     

IL-12在约氏疟原虫感染中作用的初步实验研究

目的:探讨IL-12在约氏疟原虫感染中的作用.方法:尾静脉注射法感染IL-12基因敲除小鼠和B6小鼠约氏疟原虫(17XNL),于感染后的第0、2或4、6天取小鼠尾静脉血,检测血清中的细胞因子;从感染后的第2天起,隔日检测小鼠虫体血症水平.结果:与B6小鼠相比,IL-12基因敲除小鼠在感染后虫体血症水平增长迅速且水平高;清除感染需时较长,但仍能完全清除虫体而存活.在感染后的第0、2、6天血清中无IL-12、IFN-γ,而B6小鼠IL-12、IFN-γ(D4)水平均较高.两者在TNF-α水平上无差别.结论:尽管IL-12对小鼠感染约氏疟原虫后的存活很重要,但无IL-12的小鼠感染约氏疟原虫后仍能存活.     

基于CRISPR/Cas9的PALM基因敲除约氏疟原单克隆虫株的构建

目的：基于CRISPR/Cas9技术构建并鉴定Plasmodium yoelii 17XNL PALM基因敲除单克隆虫株。方法：根据PlasmoDB数据库中的约氏疟原虫P.yoelii 17XNL PALM基因序列信息,设计引物与sgRNA。PCR扩增左、右同源臂,将同源臂和sgRNA与载体pYCm-golden-blue连接,构建用于基因敲除的CRISPR工具质粒pYCm-PALM KO。pYCm-PALM KO CRISPR质粒电转染至P.yoelii 17XNL裂殖体,尾静脉注射感染小鼠,24 h后采血查获疟原虫后,给予小鼠6 mg/mL乙胺嘧啶喂水进行药物压力筛选基因敲除疟原虫。此后每2天鼠尾采血涂片镜检疟原虫,喂药8 d时提取疟原虫基因组DNA进行PCR鉴定,最终经测序确定是否发生PALM基因敲除。将已证实存在PALM基因敲除疟原虫的鼠血采用有限稀释法接种小鼠,8 d后采血镜检疟原虫,PCR鉴定,筛选获取单克隆虫株。将获取的PALM基因敲除的单克隆虫株和P.yoelii 17XNL各接种至6只昆明小鼠体内,每只接种1×10⁵感染疟原虫的红细胞(iRBC)...     

疟原虫纯化新方法的研究

目的：拟应用去白细胞输血器,建立一种快速简便纯化疟原虫的新方法,以去除宿主白细胞DNA干扰。方法：建立Pb ANKA株鼠疟模型;39只小鼠分为A组（新鲜虫血组,n=18）、B组（冻存虫血组,-80℃保存,n=16）及C组（正常对照组,n=5）;应用去白细胞输血器对血样进行过滤纯化,观察比较过滤速度及血样处理（新鲜、冻存）对去除白细胞效果的影响;血细胞计数板和血涂片吉姆萨染色法计数各样本过滤前后白细胞、红细胞、原虫率并观察疟原虫形态和疟原虫密度。滤过后的血液提取DNA,PCR验证白细胞滤过效果。结果：经血细胞计数板计数,3组白细胞平均去除率比较,差异无统计学意义（P〉0.05）;C组红细胞的回收率高于A组,差异具有统计学意义（P〈0.05）;B组则仅见原虫。白细胞过滤后疟原虫形态及密度无明显改变。PCR鉴定PbGAPDH结果 A、B组均为阳性,而小鼠GAPDH均为阴性。结论：建立了白细胞输血器一步法纯化疟原虫的新方法。该方法简便、快速、廉价,是进行疟原虫分子生物学、免疫学等方面的研究不可或缺的实用技术。     

柏氏疟原虫红内期体外培养的初步研究

按烛缸法对柏氏疟原虫(Plasmodium berghei)红内期进行了体外培养的初步研究。先后5次,每次连续培养7天。除培养的第2天,其原虫率稍有增长外,随后便逐日下降;与此同时,培养的第4天,环状体有增多外,其后也逐日减少,而未成熟裂殖体及成熟裂殖体相对地逐日增加。培养结果提示有1～2个周期的裂体增殖。另将第7天的培养物无菌注入健康正常小白鼠腹腔内,7天后血检,原虫率明显上升(>5％),各红内期形态均可见到,还偶见到配子体,鼠间继续人工传代,原虫活力不减,实验鼠均于1周左右自然致死,反映原虫经体外培养7天后对宿主仍具有很强的毒力。     

标准化疗方案治疗失败肺结核患者原因分析

目的分析标准化疗方案治疗肺结核患者失败与耐药及其它相关因素的关系,探究标准化疗方案治疗失败的原因,为我国结核病控制以及耐药结核病控制提供参考。方法收集新发涂阳肺结核患者相关信息;纳入肺结核患者在治疗0、5月末收集痰标本进行痰涂片检查和分离培养,采用比例法进行药物敏感性测定,获得治愈和失败两组患者的耐药信息。结果男性患者的失败率低于女性患者(P0.01)、年龄40~60岁、待业人员的患者失败率高于其它年龄职业患者(P0.01),复治病例首次治疗持续时间≥8个月的失败率最高(26.50%)(P0.01),治疗中出现漏服药患者的失败率高于规律用药者(P0.01);治愈组登记时的单一耐药率、多耐药率、耐多药率均低于失败组(P0.01)。结论女性、40~60岁、待业、复治病例首次治疗持续时间≥8个月、治疗中出现漏服药等是影响治疗失败的相关危险性因素;标准化疗方案治疗失败主要是由于肺结核患者对抗结核药物耐药特别是耐多药所致。     

Use of buffy coat thick films in detecting malaria parasites in patients with negative conventional thick films

Objective

To determine the frequency of malaria parasite detection from the buffy coat blood films by using capillary tube in falciparum malaria patients with negative conventional thick films.

Methods

Thirty six uncomplicated falciparum malaria patients confirmed by conventional thick and thin films were included in the study. The patients were treated with artemisinin combination therapy at Hospital for Tropical Diseases, Bangkok, Thailand for 28 day. Fingerpricks for conventional blood films were conducted every 6 hours until negative parasitemia, then daily fingerpricks for parasite checks were conducted until the patients were discharged from hospital. Blood samples were also concurrently collected in 3 heparinized capillary tubes at the same time of fingerpricks for conventional blood films when the prior parasitemia was negative on thin films and parasitemia was lower than 50 parasites/200 white blood cells by thick film. The first negative conventional thick films were compared with buffy coat thick films for parasite identification.

Results

Out of 36 patients with thick films showing negative for asexual forms of parasites, buffy coat films could detect remaining 10 patients (27.8%) with asexual forms of Plasmodium falciparum.

Conclusions

The study shows that buffy coat thick films are useful and can detect malarial parasites in 27.8% of patients whose conventional thick films show negative parasitemia.     

胱抑素-C监测含铂方案化疗对肾功能影响的临床观察

目的: 探讨胱抑素-C (Cys-C)在监测含铂方案化疗对肾功能损伤中的作用价值。方法: 采集接受含铂药物方案化疗患者化疗前和化疗结束后第7天静脉血,检测血Cys-C和肌酐(Cr),并观察其与肌酐清除率(CCr)之间的关系。结果: 37例患者共接受74周期含铂方案化疗。血Cr和Cys-C之间存在直线相关关系(r=0.398,P < 0.01),Cys-C和CCr之间存在直线相关关系(r=0.412,P < 0.01),Cys-C与CCr的相关性不比Cr更好(r=0.412 vs r=0.567,P > 0.05)。患者化疗后血Cys-C值高于化疗前(P < 0.01),其中16例患者接受含顺铂方案化疗,共32个周期,化疗前后Cys-C值较化疗前增加(P < 0.01);21例患者接受含草酸铂或奈达铂方案化疗,共42个周期,化疗后血Cys-C值亦较化疗前增加(P < 0.01)。2组患者化疗后血Cr水平变化差异无统计学意义(P > 0.05)。接受顺铂方案化疗后的患者血Cys-C异常发生率显著高于接受其他铂类药物化疗的患者(P < 0.01),所有患者中化疗后发生Cr值异常仅1例。结论: 含铂方案化疗时,血Cys-C作为监测肾功能变化的指标,其敏感性较好,但临床应用尚存在一定问题,不能替代Cr。     

血液系统疾病合并嗜水气单胞菌血流感染4例报告

本文报道了昆明医科大学第二附属医院4例血液系统疾病合并嗜水气单胞菌血流感染患者的诊疗及转归,进一步明确血培养重要性以及加深临床对此病的认识。 选择2017—2021年昆明医科大学第二附属医院收治的血液系统疾病合并嗜水气单胞菌血流感染的4例患者,对患者临床表现、血培养采集及嗜水气单胞菌检出时间、实验室检查、治疗及预后等临床资料进行回顾性分析。本研究中4例病例均为男性血液系统疾病患者,处于化疗后骨髓抑制期粒细胞缺乏,出现发热后采集血培养并检出嗜水气单胞菌,4例患者血培养报阳时间4~11 h。药敏检测结果显示对二代、三代、四代头孢类抗生素、喹诺酮类抗生素、碳青霉烯类抗生素敏感性较高。4例患者早期均使用亚胺培南-西司他丁钠进行经验性抗感染治疗,1例患者经积极抗感染及升白细胞等治疗后痊愈。1例患者未完成化疗,患者要求出院,后续不详。2例患者迅速发展为坏死性筋膜炎,后患者死亡。研究表明,血液系统疾病合并嗜水气单胞菌血流感染罕见但死亡率高,对于反复发热考虑感染致病的患者需尽早进行血培养确认病原体并进行药敏试验,临床治疗时应结合患者情况及时调整治疗,除抗感染治疗外同时要提升患者免疫力,警惕发展为坏死性筋膜炎。