血清中淀粉样蛋白的酶联免疫吸附测定法

本文介绍一种酶联免疫吸附方法测定人血清中的淀粉样蛋白质(SAP)。材料和方法:血清样本(健康男性100例、女性50例)、鼠抗人SAP 血清、纯化SAP 抗体。酶免疫方法:用SAP 抗体包被ELISA 反应板同时标记辣根过氧化物酶。包被液和洗液用pH7.4的磷酸缓冲液;用此液稀释样本、标准及标记抗体时需每升中加入牛血清白蛋白10g。向96孔微量反应板孔中加入100μl 磷酸缓冲液及20∶ng/L 的SAP 抗体,25℃温育16～18小时后甩干,用洗液洗四次。加入100μl 的稀释抗原,37℃温育2小时,冲洗。然后加入100μl 的标记抗体37℃温育2小时,冲洗反应板孔,最后加入100μl 的次酚     

病毒酶联细胞免疫试验(VELCIA)检测轮状病毒抗原及其中和抗体

病毒酶联细胞免疫试验(VELCIA)不仅能检出和滴定适应株或野毒株轮状病毒,还能测定血清中的抗轮状病毒总抗体和中和抗体。具体方法如下:MA-104细胞用含10%胎牛血清的MEM培养液悬浮成10~6细胞/ml,加50μl/孔至聚苯乙烯96孔板上,37℃孵育48-72小时长成单层细胞。粪便标本用PBS制成20%悬液,离心后取上清与等量含30μl/ml胰酶的MEM混合,37℃活化90分钟后,50μl/孔接种在MEM洗过3次的微孔板单层细胞上,室温吸附60分钟,倾弃样本,用MEM洗板上细胞3次,置于100μl/孔MEM孵育18-20小时。猪轮状病毒OSU株接种用含30μl/ml胰酶的MEM作一系列10倍稀释,活化60分钟,接种于MEM洗过3次的单层细胞上,37℃孵育48小时。然后用预冷至-20℃,85%丙酮固定不超过24小时,倾弃丙酮,自然干燥,用前及每次温育间均用含0.05%吐温20的盐水洗3—5次。VELCIA检测轮状病毒抗原时,每孔加50μl1/200稀释的猪抗轮状病毒过氧化物酶结合物37℃温育2小时,随即加100μl/孔ABTS底物(2.2-叠氮-3-二乙基苯噻唑磺酸)作用1小时后,将80μl     

用标准品界定ELISA法测定HBsAg结果的复检范围

我室多年来一直使用上海荣盛公司的HBsAg诊断试剂盒(双抗体夹心ELISA法)。从2011年3月开始,因其试剂盒改良,原标本量及酶标记抗体的加入量由50μL增至100μL,方法由标本和酶标抗体一起加入包被孔后37℃温育30min(一步法)改为标本加入后先温育60 min,然后加酶标抗体再温育30 min(二步法),其余步骤及结果阳性判定值未     

盐析法分离贮存骨髓涂片DNA用于聚合酶链反应

作者采用盐析法从玻璃涂片提取DNA并将其用于聚合酶链反应(PCR)。 室温下贮存1～2年的未染色骨髓涂片2～3张,用新的刮胡须刀片将髓膜刮到1个无菌Eppendorf管中。DNA用过去描述的方法改良后进行提取:刮下的材料首先溶于1ml蒸馏水和500μl 1％Nonidet P-40溶液中10分钟。离心后核沉渣进行温育,加350μl核溶解缓冲液和150μl蛋白酶K溶液,37℃过夜。完全消化后,每管加入200μl和NaCl,     

修正计算系数速率法微量快速测定ALT

血清丙氨酸氨基转移酶（ALT）活性的测定是保证输血安全的重要手段之一。酮体粉快速测定法由于只能作为半定量方式而少为应用[1];而赖氏法操作繁琐,耗时较长;微量速率法测定ALT已有报道[2],但需每次制作标准曲线,不适合常规批量操作。本文参考生化分析仪原理,应用定值血清即刻修正计算系数,微量快速测定,经在血液检测中应用,效果甚佳。1材料与方法1．1实验仪器瑞士TECANMegflex－ID智能加样仪;SLT温控酶标仪（经质控板校正）;OLYMPUSAUS800全自动生化分析仪;美国96孔平底微孔板。1．2实验试剂ALT基质液（参考IFCC…     

自动加样仪及酶标仪快速、简便检测脂肪血

脂肪血输入病人体内,轻则引起荨麻疹等过敏反应,重则发生血管神经性水肿,常常来不及抢救而造成病人窒息死亡[1].脂肪血的判定由血站检验科、血库、成分血科共同作出,由于多采用目测法判断,主观性较大,常造成血液分类管理困难以及与献血者之间的矛盾.笔者利用自动加样仪及酶标仪在微孔板上进行检测,意在寻求一种统一的判断标准,以减少人为因素造成的差别又便于数据自动传输及电脑管理,最终实现脂肪血判断的标准化、自动化. 1 材料与方法 1.1 仪器 RSP100自动加样仪,TECAN酶标仪,ROTINA平板离心机,SLT读数软件,96孔可拆圆底微板. 1.2 方法用自动加样仪在96孔圆底微板上加入100μl血浆,在平板离心机上以2000r/min离心1min 30s消除血浆微粒的影响,然后在酶标仪上以Easy-agl软件进行测定.     

甘油三酯酶法测定加消光片手工操作法

测定管、标准管和空白管中分别加入10μl血清、标准液(2.26mmol/L)和生理盐水,各加酶工作液0.5ml,37℃水浴15分钟,然后各管加pH7.0Tris缓冲液1.5ml。在721型分光光度计500nm,空气调零,测得标准吸光值为0.5A消光片的实际吸     

丙酮酸在微板赖氏法测定ALT酶活力中的应用

丙酮酸在丙氨酸氨基转氨酶 ( ALT)的测定中 ,主要用于绘制标准曲线 (赖氏法 )。测定 ALT的方法有速率法和赖氏法等。赖氏法又分为试管法和微板法两种 ,试管法费工、费时 ,不利于计算机对原始数据的网络化管理 ,而速率法受温度影响较大 ,为此 ,笔者在微板赖氏法中 ,利用丙酮酸为标准液 ,进行 ALT检测 ,并与试管法与速率法比较 ,现介绍如下。材料与方法1　仪器　 TECAN GENESIS RSP1 5 0全自动加样系统 (奥地利产 ) ,TECAN SPECTRA温控酶标仪 (奥地利产 ) ,Heidolph温控震荡器 (德国产 ) ,96孔微孔平底板 (天津开元公司提供 )…     

肾病患者尿中二肽基-氨基肽酶Ⅳ的变化

二肽基-氨基肽酶IV(DAP-IV)能使X-脯氨酰-Y-肽分解,产生X-脯氨酸,对氨基端第二位的脯氨酸有高度特异性。作者以7-甘氨酰脯氨酸-4-甲基香豆素酰胺(甘氨酰-脯氨酸-MCA)为底物,用荧光法测定尿中DAP-IV的活性。取试管1支加入pH 8.7的0.15mol/L甘氨酸/氢氧化钠缓冲液40μl,2mmol/L甘氨酰-脯氨酸-MCA水溶液25μl及人尿35μl。另取试管1支以35μl蒸馏水代替人尿作为对照管。将各管置于37℃水浴中保温30分钟,加入1mol/L醋酸盐缓冲液1.0ml     

全自动酶免分析系统定量检测ALT的应用

手工赖氏试管法定量 AL T,首先要定期制定标准曲线 ,然后按标准曲线进行计算 ,手工计算时要减去空白管 ,费工费时。因此 ,我们利用全自动酶免分析系统 ,采用现有 Au S.L ab2 .0软件读板 ,建立了微板赖氏定量方法 ,以不同量的丙酮酸为标准 ,每次试验仪器均可自动建立标准曲线 ,然后仪器自动给出各样品的卡门单位 ,现报告如下。1　对象和方法1.1　对象　郑州市无偿献血者。1.2　试剂及厂家　 AL T赖氏法试剂盒 (上海生物制品研究所 ) ;96微孔平底板 (丹麦 Nunc公司 )。1.3　仪器及厂家　RSP2 0 0全自动加样器 (瑞士 Tecan集团 ) ;BEP (…     

探讨ELISA检测HBsAg中延时不同时间比色对结果的影响

<正>ELISA以其特异性好、灵敏度高、操作简便等优点,广泛应用于各个临床实验室。根据ELISA测定乙肝HBsAg的原理,其基本操作过程是:样本加酶标记物37℃水浴15min洗板加底物液37℃水浴30min加终止液酶标仪比色判定结果。针对加终止液酶标仪比色判定结果这一步操作,为探讨终止反应后延时不同时间比色的样本OD值变化对结果的影响,作者对13名HBsAg阳性的血清标本进行测定。现将结果报告如下。     

嗜碱性粒细胞脱颗粒试验改良法测定尘埃过敏原

料准准备:1.染色液:0.025%甲苯胺兰(30%)酒精溶液、加入冰醋酸(4μl/ml)、使pH7降至3.0～3.2。2.微孔反应板:在反应板的孔中、第一排各加蒸馏水0.1ml(对照);第二排各加室中过敏原尘埃的水溶液(1μg/ml)0.1ml;第三排各加室中过敏原尘埃的水溶液(0.1μg/ml)0.1ml。反应板置37℃恒温箱中烘干、反应板保存于室温可用一年。方法:取血0.5～1ml、置塑料试管中、肝素抗凝(50iu/ml血液)、以1000rpm离心10分钟,取白细胞层重新混悬于血浆中、使成80μl。在上述已准     

用亲和素-生物素-免疫酶法(NABA)检测溶菌酶

本法可用于测定正常人和急性髓样白血病患者血清中的溶菌酶,步骤如下:用抗溶菌酶抗体(15μg/ml)包被微孔板,置4℃过夜后洗涤。加样品(100μl),置37℃1小时。经洗涤后加生物素化抗溶菌酶抗体(100μl,1:500),同法温育并洗涤。加酶标亲和素(1mg/ml 原液经1:2000稀释,每孔加100μl),置室温10分钟。洗涤,加底物,置室温10分钟终止反应。若采用快速法,加样品、生物素化抗体、酶标亲和素及底物后的温育时间应分别缩短为20分钟、20分钟、5分钟和5分钟。同时以竞争性亲和素-生物素-免疫酶测定法作对比。竞争     

免疫比浊法测定血清Ig和C3含量

选用最适浓度抗Ig 与C_3血清与1～4μl 检样于聚苯乙烯反应板微孔中反应,37℃30min 后于酶联检测仪测492nm 吸光度,根据标准曲线即可换算得检样中Ig 与C_3含量.本文摸索了实验最适条件,并与常规单向免疫扩散法同时检测40名健康供血员,结果一致(P>0.05).     

双抗体夹心法微量ELISA测定人血小板因子4

测定血小板因子4(PF_4)有多种方法,但是都有一定的局限性。本文介绍一种敏感性强、特异性高、重复性好的方法,即双抗体夹心微量酶联免疫吸附试验(ELISA)。测定过程如下:(1)包被:聚苯乙烯微板的每个孔加150μl缓冲液稀释的抗人PF_4抗体,置37℃孵育20小时,用PBST(磷酸盐缓冲盐水-吐温20溶液)洗4次。(2)抗原孵育:加200μl/孔含1％牛血清白蛋白的PBS,37℃1小时,板用PBST洗1次,再加入50μl/孔含已知量抗原的抗原标准液及血浆标本,37℃1小时,板用PBST洗3次。(3)标记抗体孵育:加100μl/孔用PBST稀释的辣根过氧化物酶标记     

微板法血型自动检测几个影响因素的探讨

笔者采用微板法血型自动检测方法［1］,对自配红细胞的保存时间、加样顺序、血型板的洁净程度,作了较详细的探讨。并通过19223例的血型检测,正反定型相符达到99.99%,准确率达到100%。从而完善微板法血型自动检测,节约了耗材和开支。 1 材料与方法 1.1 仪器与试剂 AT-PLUS2全自动加样系统(HAMILTON公司瑞士),HT-Ⅲ酶标仪和T.S温控孵育振荡仪(Anthos 公司奥地利),ModelTJ-6平板式离心机(BECKMAN公司美国),96孔U型板(购自上海血液中心参比实验室)。抗-A、抗-B单克隆抗血清（购自长春生物制品研究所）,标准4%A、B红细胞（购自澳斯邦公司）自配试剂红细胞（A型和B型红细胞分别取自筛选后的3人份新鲜ACD抗凝血,洗涤混合后配成4%的红细胞）。96孔洗板机（TECAN,A-5082购自奥地利） 1.2 实验操作程序①利用自动加样仪加样,正定：25μl标准血清+25μl样品细胞（4%）,反定：25μl样品血浆+25μl试剂细胞（4%）;②振荡孵育28℃、400r/min、8min、3accel;③平板离心400r/min、1min;④振荡悬浮28℃、1000 r/min、2min、2 accel;⑤静置5～10min;⑥判读：扫描点数15、测定波长620nm。（借助于AUSFINE判读软件） 1.3 实验例数：19223例;实验组：微板法;对照组：纸片法。     

一种灵敏的测定全血内毒素的新方法

鲎的变形细胞溶解物能与内毒素发生反应,但其中含有一种G 因子能与(1→3)β—D—葡聚糖发生反应,所以传统的鲎试验对内毒素都不是特异的。作者用从鲎变形细胞溶解物中除去G 因子的方法,制备出一种特异的内毒素鲎色原试剂—Endospecy,并创立了一种用微量滴定板测定全血内毒素的新方法。方法:所有玻璃器皿都必须加热250℃两小时,试剂121℃高压消毒20～90min,去除内毒素。加标本用的吸样器吸器和试剂分配器空针都必须无内毒素和无β-葡聚糖。一次性96孔微量滴定板亦应无内毒素和β-葡聚糖。取无热原塑料空针(含肝素5单位/ml 血)静脉抽血,注入玻璃管内,放混合器上猛烈振荡,使其溶血。检测前放-80℃保存。取全血50μl,加0.25%Tritonx-100(0.66mol/LHNo_3)溶液250μl,充分振荡后,置37℃孵育5min。然后3500rpm 离心5min。取25μl 上清液加入微量滴定板孔内,加入0.5mol/L NaoH25μl 中和。每孔加入Endospecy(溶于2.2ml0.2mol/LPH8.0Tris-HCl     

胶体金法检测HBsAg的评价

笔者在2006年3月份农牧民合作医疗体检人群中和2007年10月份公安系统招干体检人群中,采用血清胶体金法、ELISA两种方法进行了HBSAg检测,遇到胶体金法检测HBSAg弱阳性漏检现象。现报告如下:1材料与方法1.1标本本地合作医疗农牧民体检血清460人份,公安系统招干体检血清130人份,共计590人份。均从肘静脉抽血2～3ml加入一次性真空负压管中,置于37℃水浴15～30min,将标本3000rpm离心15min后,分离血清。1.2试剂与仪器1.2.1试剂血清胶体金试纸条采用郑州博赛生物技术研究所生产,ELISA诊断试剂盒,(初检为国产试剂1,上海实业科华生物技术有限公司生产。复检为国产试剂2,北京万泰生物药业有限公司生产)均在有效期内。1.2.2仪器酶免工作站、上海雷勃Multiskan-MK3酶标仪与北京普朗DNX一9620电脑洗扳机。1.3方法590人份血清,用血清胶体金试纸、ELISA(科华试剂盒、万泰试剂盒)分别进行平行检测HBSAg,操作前将试剂在室温平衡30～60min,然后严格按说明书进行,加样方向从A行的第1列加至n行的12列。判定标准:胶体金法操作程序为:将试纸条MAKK标志线一端...     

双波长微孔板赖氏法测ALT含量

献血者丙氨酸氨基转移酶(ALT)的测定,目前多采用赖氏试管法,费工、费时.随着血站自动化加样系统的使用,国内一些血站采用单波长微孔板赖氏法测定ALT含量,但该法检测结果受脂血、板孔差异、板底划痕等因素干扰.     

抽提模板的温度和杂交温育方式对丙型肝炎病毒RNA检测的影响

逆转录聚合酶链反应 微孔板反向杂交法检测丙型肝炎病毒核酸 (HCV RNA)影响因素较多。本实验室通过对室温和低温条件下抽提HCV RNA及不同杂交温育方式检测扩增产物的试验 ,探讨其对检测结果的影响。1　材料1 1　试剂　RT PCR微孔板反向杂交试剂盒由华美生物工程公司提供 ,批号 0 0 1 1 0 6。1 2　主要仪器　PE 2 4 0 0PCR扩增仪 ;LGR1 6 W高速微量冷冻离心机 ;LGR1 6 W高速离心机 ;LabsystemsDragon酶标仪、洗板机 ;电热恒温分子杂交箱。2　方法2 1　不同温度下抽提HCV RNA2 1 1　试剂盒提供的方法 (简称旧法 )　取…