诱导大鼠骨髓间充质干细胞分化为肝样细胞的实验研究

目的：探讨肝细胞生长因子（HGF）和粒细胞集落刺激因子（G-CSF）诱导骨髓间充质干细胞（BM-MSCs）分化为肝样细胞的可行性。方法：经骨髓分离BM-MSCs并鉴定,将细胞按以下分组进行成肝诱导：G0组（阴性对照）、G1组（20ng·mL^-1 HGF）、G2组（20ng·mL^-1 HGF＋5ng·mL^-1 G-CSF）、G3组（20ng·mL^-1 HGF＋10ng·mL^-1 G-CSF）、G4组（20ng·mL^-1 HGF＋20ng·mL^-1 G-CSF）,PAS染色检测肝细胞合成糖原功能,利用RT-PCR检测分化肝细胞的甲胎蛋白（AFP）和白蛋白（ALB）表达。结果：G1～G4组BM-MSCs被诱导后呈现肝样细胞形态改变,以G3、G4明显,G0组细胞无类似变化。G1～G4组诱导第7、14天的细胞PAS染色阳性,G0组呈阴性染色;同一时间点,G1与G2、G3与G4比较,差异无统计学意义（P〉0.05）;而G3、G4与G2比较,G3、G4组阳性染色率较高（P〈0.05）。G1～G4组中,诱导AFP于第7天均表达AFP,第14天表达降低,第21天无表达（均P〈0.05）。ALB在第14天出现表达,第21天表达增多,呈上升趋势（P〈0.05）。G2与G1、G4与G3之同比较,AFP、ALB灰度比值差异无统计学意义（P〉0.05）;但G4、G3与G2比较,同一时间点间G4、G3表达水平较高（P〈0.05）。结论：应用HGF和G-CSF能诱导BM-MSCs向肝样细胞分化。但G-CSF需要达到合适浓度才能与HGF发挥协同作用。     

兔干细胞的体外培养和碱性成纤维细胞生长因子对其代谢的影响

目的探索体外培养的骨髓间充质干细胞（BMSCs）和脂肪干细胞（ASCs）变化，以及碱性成纤维细胞生长因子（bF—GF）对其代谢的影响。方法分别用DMEM、DMEM／F12（2：1）、a—MEM培养兔BMSCs和ASCs。将体外培养的第3代兔BMSCs和ASCs各分为2组后培养到第3代。A组：软骨诱导培养基（CM）＋ASCs，B组：CM＋ASCs＋bFGF5ng／ml，C组：BMSCs＋CM，D组：BMSCs＋CM＋bFGF5ng／ml。倒置显微镜观察细胞形态学变化，测定^35SO4^2-摄入量及羟脯氨酸浓度。结果a—MEM培养基比DMEM、DMEM／F12（2：1）制备的BMSCs和ASCs所需时间缩短。单层培养的BMSCs和ASCs增殖较快，贴壁较牢且生成细胞集落，但经CM诱导后，细胞增殖较慢，贴壁不牢，且细胞没有集落生成。诱导后的BMSCs和ASCs的形状趋向于类圆形，B组和D的细胞数量比A组和C组的细胞多，B组、D组分别比A组、C组表达羟脯氨酸增加、^35SO4^2-摄入量增加，而D组羟脯氨酸表达和^35SO4^2-摄入量与B组无显著性差异。结论添加了bFGF的CM诱导液诱导的兔干细胞生长较好，代谢增加。     

不同培养基培养人脐血间充质干细胞的差异

背景：脐血间充质干细胞为干细胞领域的研究热点,但目前传代及扩增此类细胞尚无简单、有效、完美培养方法.目的：采用不同的培养基分离培养融合状态的间充质干细胞,以筛选一种较好的体外培养人脐血间充质干细胞的方法.方法：无菌条件下取正常足月剖宫产新生儿的脐血,随机分为5组：低糖DMEM（Dulbecco改良的Eagle培养基）组、高糖DMEM组、α-DMEM组、低糖DMEM＋干细胞因子组、低糖DMEM＋骨髓间充质干细胞培养上清组.用淋巴细胞分离液分离脐血的单个核细胞.将脐血单个核细胞接种于含体积分数为10%胎牛血清的上述培养基中,放置于37℃、体积分数为5%的CO2培养箱内培养,倒置显微镜观察细胞数量和形态的变化并用流式细胞技术分析细胞的表面抗原.结果与结论：①各组间充质干细胞培养48 h后贴壁细胞数和细胞存活率的比较：低糖DMEM＋干细胞因子组、低糖DMEM＋骨髓间充质干细胞培养上清组的贴壁细胞数明显多于低糖DMEM组、高糖DMEM组、α-DMEM组（P〈0.05）,细胞存活率亦明显高于低糖DMEM组、高糖DMEM组、α-DMEM组（P〈0.05）.②各组间充质干细胞在不同培养时间下生长状态的比较：培养第3,6,9,12,15,18,21天低糖 DMEM＋干细胞因子组、低糖 DMEM＋骨髓间充质干细胞培养上清组细胞增殖的速度均快于低糖DMEM组、高糖DMEM组、α-DMEM组（P 〈0.05）.低糖DMEM＋干细胞因子组与低糖DMEM ＋骨髓间充质干细胞培养上清组比较差异无显著性意义.结果可见人脐血间充质干细胞与骨髓间充质干细胞培养上清或干细胞因子共孵育,对脐血间充质干细胞体外分离培养及扩增有支持作用.     

影响脐血多能非造血成体干细胞分离的相关因素研究

为了研究低血清条件下从脐血中分离多能非造血成体干细胞的相关影响因素,探索优化培养条件,通过不同培养液、接种密度、首次换液时间对脐血多能非造血成体干细胞生长的影响的比较,并以选定的条件对其培养扩增,进行免疫表型及诱导分化能力检测。结果表明在低血清条件下,DMEM/F12培养液更适合于脐血多能非造血成体干细胞生长;1×106/cm2是原代培养的适宜接种密度,原代第72小时首次换液为最佳换液时问。利用所选条件培养的细胞可在体外持续扩增,并具有良好的分化潜能。结论建立了人脐血多能非造血成体干细胞的体外优化培养条件,为其在组织工程方面的应用作出了新的探索。     

大鼠胎血与骨髓非造血成体干细胞体外分化能力的比较

为了比较大鼠胎血和骨髓中非造血成体干细胞（non—hematopoietic adult stem cells，NASC）体外培养过程中的生长特性及体外诱导两者向神经元样细胞分化的异同，在无菌条件下采集孕大鼠的胎血和成年大鼠的骨髓，用Ficoll—hypague分离液分离出单个核细胞（MNC）后，种植于含10％胎牛血清的DMEM／LG培养液内。收获的NASC传代培养，用流式细胞仪检测细胞的免疫表型。β-巯基乙醇（β-ME）、二甲亚砜（DMSO）和叔丁基对羟基茴香醚（BHA）诱导NASC向神经元分化．用免疫细胞化学染色检测其特异性标志巢蛋白（nesfin）、神经元特异性烯醇化酶（NSE）、胶原纤维酸性蛋白（GFAP）的表达。结果发现：传代培养后的两种NASC的形态相似，皆呈均一的梭形；流式细胞仪检测结果示两种NASC的免疫表型无明显差异，表达CD44、CD54，不表达CD11b、CIM5；定向诱导的两种NASC具典型神经元形态，免疫细胞化学染色显示nesfin和NSE为阳性，但GFAP为阴性。结论：大鼠胎血和骨髓非造血成体干细胞的细胞形态、生物学特性无明显差别；两者都可被诱导分化为神经元样细胞；血胎应是NASC的又一来源。     

骨髓间充质干细胞转化为肝样细胞的体外实验研究

目的评价骨髓间充质干细胞（BMSCs）向肝样细胞诱导的可行性。方法2008年1月-2009年1月,以肝细胞生长因子（HGF）20ng/mL,成纤维细胞生长因子4（FGF-4）10ng/mL为诱导剂,从细胞形态变化,并通过RT-PCR、免疫组化方法分别对诱导第7、14、21及28天的细胞进行白蛋白（ALB）、甲胎蛋白（AFP）、细胞角蛋白18（CK18）等检测。人L-02肝细胞及未诱导的BMSCs分别为阳性和阴性对照。结果BMSCs诱导7d出现类圆形或多角形细胞,并出现铺路石样结构;诱导14d细胞呈现典型的铺路石状;诱导21d,同前;诱导28d,细胞排列紊乱,局部细胞的形态不规则、细胞边界不清。BMSCs诱导第7、14、21天ALB、CK18、AFP等mRNA表达阳性;未诱导BMSCs均为阴性;肝细胞ALB、CK18、AFP等mRNA表达均阳性。免疫细胞化学检测结果同RT-PCR。结论以HGF及FGF-4为主的诱导体系可有效诱导BMSCs向肝样细胞转化,BMSCs可以作为一种新的肝细胞来源。     

脐带血单个核细胞体外培养分化为肝细胞的实验观察

目的探讨脐带血单个核细胞在体外定向分化为肝细胞的条件及能力,为建立脐血干细胞移植治疗慢性肝衰竭提供实验依据。方法采集脐带血分离单个核细胞后,在实验组加入成纤维细胞生长因子(FGF)及促肝细胞生长因子(HGF)、或FGF加胎肝上清液培养,对照组只加FGF培养,观察细胞生长分化状况,免疫组化检测两组人甲胎蛋白(AFP)和白蛋白(Alb)。结果实验组可见类圆形及多边形细胞,呈类肝细胞形态,对照组大多为梭形细胞,未见多边形细胞;实验组细胞AFP、Alb免疫组化染色为阳性,对照组未见AFP,Alb阳性细胞。HGF的诱导分化效果优于胎肝上清液。结论脐带血单个细胞在HGF或胎肝上清液的诱导下可以定向分化为能分泌Alb及AFP的类肝细胞。     

血管紧张素Ⅱ对脐血CD34+细胞体外分化为巨核细胞的影响

为了探讨血管紧张素Ⅱ对脐血CD34^＋细胞诱导分化为巨核细胞的影响，采用免疫磁珠法（MACS）分选8例健康产妇足月顺产胎儿脐血中的CD34^＋细胞，在舍血小板生成素（TPO50ng／ml）、白介素-3（IL-310ng／ml）、干细胞刺激因子（SCF50ng／l）的无血清培养液中添加浓度分别为50、100、1000μg／ml的血管紧张素Ⅱ作为实验组；同时以未添加血管紧张素Ⅱ的基础培养液作为对照组，培养14天后观察结果。细胞计数仪计数单个核细胞数（MNC）；流式细胞仪计数培养体系中的CD41^＋细胞数、血小板数，及分析细胞周期；利用CD41单克隆抗体免疫荧光染色观察培养体系中的细胞情况。结果表明：与对照组比较，实验组单个核细胞数无明显改变（P〉0．05）；而CD41^＋细胞和血小板数量有明显的增加（P〈0.05）；细胞周期分析显示，实验组的4倍体细胞增加，并存在明显的凋亡（P〈0．05）；荧光显微镜下观察对照组和实验组均可见大小不一的CD41^＋细胞。结论：血管紧张素Ⅱ可以促进脐血中CD34^＋细胞诱导分化为巨核细胞，并能促进巨核细胞产生血小板。     

成体组织来源的Sca-1+CD117-Lin-多潜能干细胞生物学特性分析

背景：关于成体干细胞可塑性机制的解释，目前多数学者接受的观点是多种组织器官内存在的成体干细胞其实并非均一的细胞群体，其中包含着更为原始的多潜能干细胞，但对于多潜能干细胞的起源、鉴别及其生物学特性仍缺乏了解。目的：探讨从成体组织中能否分离出一群具有独特表型的更为原始的多潜能干细胞。设计、时间及地点：细胞学体外观察，于2007—03／2008-01在北京协和医学院基础学院组织工程中心完成。材料：清洁级12．5～14．5dBALB／C孕鼠10只。方法：无菌条件下打开BALB／C孕鼠子宫获取胚胎体壁组织，胰蛋白酶消化后贴壁法制成细胞悬液，接种后免疫磁珠分选Sca-1^＋CD117-Lin-细胞群，当细胞达70％-80％融合时消化传代，取第5代细胞用于实验。主要观察指标：倒置相差显微镜和扫描电子显微镜观察该类细胞的显微和超微形态，通过生长曲线和细胞周期观察其基本生长特性，采用流式细胞技术分析该群细胞免疫表型，以RT-PCR法检测胚胎干细胞相关抗原的表达情况，通过Von Kossa染色、油红O染色、甲苯胺蓝染色及免疫细胞荧光染色观察其向三胚层细胞分化的潜能。结果：Sca-1^＋CD117-Lin-细胞贴壁生长，呈纺锤或短梭形，可在体外快速稳定扩增50代以上：传代后3～7d为对数生长期，此后即进入平台期生长，倍增时间约为32h，90．43％细胞处于G0／G1期，G2/M＋S期的细胞比例为9．57％：细胞表型稳定，高表达Sca-1，不表达CD117，CD14，CD19，CD31，CD34，CD45和Flk-1，中度表达CD44；胚胎干细胞相关抗原Sox2，Oct-4及Nanog均呈阳性表达；诱导分化实验表明该细胞可以向中胚层来源的成骨细胞、脂肪细胞、软骨细胞、外胚层来源的神经胶质细胞以及内胚层来源的肝细胞分化。结论：从成体组织内可以分离出Sca-1^＋CD117-Lin-细胞群，其表达胚胎干细胞相关抗原，能够向三胚层分化，是一群更为原始的多潜能成体干细胞。     

不同细胞因子组合对人脐血单个核细胞体外扩增及CD49d和CXCR4表达的影响

为了探讨不同的细胞因子组合对脐血单个核细胞体外的扩增作用及扩增后CD49d和CXCR4的变化，将新鲜脐血标本分离的单个核细胞接种于含有不同细胞因子组合的无血清无基质培养体系中培养7天，在0天，7天检测有核细胞数，CD34^＋细胞数及CD34^＋CXCR4^＋，CD34^＋CD49d^＋的细胞数和集落形成单位（CFU）数．根据不同细胞因子组合实验分组为：对照组；SF组（SCF＋FL）；SFT组（SCF＋FL＋TPO）和SFT6组（SCF＋FL＋TP0＋IL-6）。结果表明，和对照组相比，SF组合仅能低水平支持脐血造血细胞扩增，加入TPO后即SCF／FL／TPO组合能有效的扩增脐血细胞，但SFT和SFT6两组之间差异却无明显发生（P〉0．05）；SF，SFT和SFT63组的细胞因子组合均可提高脐血CD34^＋细胞CD49d，CXCR4的表达，但3组之间差异无显著性（P〉0．05）。结论：SF组合可协同扩增人造血细胞，但协同作用较弱；TPO在脐血造血干／祖细胞体外扩增中起重要调节作用，而IL-6作用不显著；SCF／FL／TPO 3种因子组合不仅可促进脐血造血祖细胞的扩增，而且可上调脐血造血细胞CD49d，CXCR4表达。     

Collagen nanofibres are a biomimetic substrate for the serum-free osteogenic differentiation of human adipose stem cells

Electrospinning has recently gained widespread attention as a process capable of producing nanoscale fibres that mimic native extracellular matrix. In this study, we compared the osteogenic differentiation behaviour of human adipose stem cells (ASCs) on a 3D nanofibre matrix of type I rat tail collagen (RTC) and a 2D RTC collagen-coated substrate, using a novel serum-free osteogenic medium. The serum-free medium significantly enhanced the numbers of proliferating cells in culture, compared to ASCs in traditional basal medium containing 10% animal serum, highlighting a potential clinical role for in vitro stem cell expansion. Osteogenic differentiation behaviour was assessed at days 7, 14 and 21 using quantitative real-time RT-PCR analysis of the osteogenic genes collagen I (Coll I), alkaline phosphatase (ALP), osteopontin (OP), osteonectin (ON), osteocalcin (OC) and core-binding factor-alpha (cbfa1). All genes were upregulated (>one-fold) in ASCs cultured on nanofibre scaffolds over 2D collagen coatings by day 21. Synthesis of mineralized extracellular matrix on the scaffolds was assessed on day 21 with Alizarin red staining. These studies demonstrate that 3D nanoscale morphology plays a critical role in regulating cell fate processes and in vitro osteogenic differentiation of ASCs under serum-free conditions.     

人骨髓间充质干细胞表达多种造血细胞因子

为了研究培养的人骨髓间充质干细胞在造血中的生物作用，采用RT—PCR方法在mRNA水平上分析体外培养的人骨髓间充质干细胞(BM—MSC)造血因子的表达，以及氢化考的松对BM—MSC表达造血细胞因子的影响。结果显示，体外传代培养的正常人、白血病和淋巴瘤等血液病人BM—MSC均能表达SCF，Flt3-ligand TPO,LIF,IL—6和IL—11等重要的造血细胞因子，但不表达G—CSF，GM—CSF和IL-3。不同代数的BM—MSC细胞，造血细胞因子的表达相同。BM—MSC经氢化考的松作用7—21天后，可谤手G—GSFmRNA表达，但不诱导GM—GSF的表达，细胞在形态学上也未发生明显改变。结论：体外培养的正常人和本组血液病病人BM—MSC具有促造血功能。     

脐血CD34+细胞及红系祖细胞扩增的实验研究

脐血是造血祖细胞的丰富来源之一,选择合适的培养条件,体外诱导其定向扩增为红系祖细胞,输入体内产生成熟红细胞。本实验旨在探讨脐血单个核细胞(MNC)体外红系定向扩增的理想因子组合(Flt3配基FL联合TPO、SCF、EPO及FL、SCF、TPO)对CD34 细胞扩增的影响。将单个核细胞接种至stemspan无血清培养液中,共分3组:A组为对照组,B组为TPO SCF FL EPO IGF1组,C组为TPO SCF FL组,C组在第6天及以后换液加入EPO和IGF1。于培养0、6、10、14天进行细胞计数,细胞集落测定,流式细胞术测定细胞的CD34、CD34CD71、CD71GPA细胞的比例。结果表明:经10天培养后,B组总细胞数扩增6.89倍,而C组3.06倍;B组CD34 细胞增加4.83,而C组2.47倍;B组集落形成细胞数增加4.3倍,而C组增加2.5倍;B组红系祖细胞BFUE和CFUE数增加5.4倍,而C组3.1倍;B组CD34 CD71 细胞数增加8.72倍,而C组3.37倍;B组CD71 GPA 细胞数增加53.4倍,而C组30.29倍。结论:脐血MNC在无血清培养液中加入FL SCF TPO实现了CD34 细胞及集落形成细胞的扩增。脐血MNC在无血清培养液中加入FL SCF TPO EPO IGF1短期液体培养获得红系祖细胞的扩增,在第0天比6天加入EPO获得更多红祖细胞(P<0.05)。由于TPO SCF FL EPO IGF1组的集落形成细胞数、CFUE和BFUE数于第10天最多,故培养后收获时     

人脐血造血干/祖细胞体外定向诱导分化过程中端粒酶的表达

探讨脐血造血干/祖细胞体外诱导分化过程中端粒酶的表达,为造血干细胞产品的临床应用提供一个监测细胞增殖潜能和安全性的指标。用源自人脐血的CD34~+细胞及不同细胞因子组合(SCF+IL-3+IL-6+G-CSF,SCF+IL-3+IL-6+EPO)在体外进行诱导分化;用TRAP聚丙烯酰胺凝胶电泳法、TRAP-ELISA法检测CD34~+细胞及诱导分化细胞的端粒酶活性;用Western印迹法在蛋白水平检测端粒酶催化亚基hTERT的表达,用RT-PCR在细胞转录水平检测端粒酶催化亚基hTERT mRNA的表达。结果显示,在体外诱导分化14-21天为细胞生长峰值,细胞总数可增加(1006.4±103.2)倍,随着培养时间的延长,细胞数量不再增加。CD34~+细胞低度表达端粒酶活性和hTERT基因,在细胞诱导分化过程中端粒酶活性及hTERT表达逐渐升高,细胞诱导14天后端粒酶活性及hTERT表达下降,28天端粒酶活性及hTERT基因检测不出。结论:利用CD34~+细胞在体外定向诱导分化出的大量细胞,不具有无限增殖的特性,可安全地应用于临床,且利用端粒酶的检测可为临床应用诱导分化细胞的时机提供依据。     

我国造血干细胞基础研究的新进展兼论干细胞可塑性

1995年以来我国造血干细胞工程与相关的生物学领域的研究发展迅速。有关造血干 祖细胞基因表达的研究 ,上海国家人类基因组研究中心陈竺、陈赛娟等为正常和急性白血病人骨髓造血干祖细胞cDNA文库的基因表达建立了一套先进的工作体系。他们在许多白血病细胞系的干 祖细胞中发现了 30 0个新的相关基因。中山大学医学院李树浓、黄绍良等从人的桑葚期胚胎干细胞成功地诱导出造血细胞等。北京输血研究所裴雪涛等从成人和胎儿的骨髓分离出成年源干细胞 ,又进一步诱导分化为骨、软骨、脂肪和神经原细胞等。他们成功地构建了胎儿和成人间充质干细胞cDNA扣除文库 ,获得了胎儿和成人间充质干细胞的差异表达基因及在胎儿特异表达基因。中国医学科学院天津血液学研究所、国家血液学重点实验室赵春华等证实从胚胎胰腺、骨髓和肝脏中都可以分离出人间充质干细胞 ,又证明G CSF可以使输注的间充质干细胞在体内促造血重建。北京基础医学研究所毛宁等的实验不支持间充质干细胞可以“横向分化”。最近他们发现小鼠胚胎干细胞的体外分化重现了胚胎早期造血发生的生物学程序以及Smad5基因调控在胚胎造血发生中的必要性和多样性 ,又表明其上游配体TGF beta家族分子在胚胎发生中的作用和特点。本文针对干细胞可塑性研究作了评     

兔骨髓间充质干细胞的生物学特征及其对不同生长因子的反应

为了研究兔骨髓间充质干细胞（rBM—MSC）的生物学特征及其对不同生长因子的反应，使用贴壁培养法从兔骨髓单个核细胞中获得间充质干细胞（MSC），在光学显微镜和电子显微镜下观察其基本生长行为和生物学特征；使用流式细胞仪检测rBM—MSC的免疫学表型；RT—PCR法检测其胶原表达；诱导rBM—MSC多向分化并使用特异性染色和RT—PCR予以鉴定；最后使用MTT法检测IL—1、3、8和HGF对rBM—MSC生长增殖的影响。结果显示：贴壁生长的rBM—MSC具有典型的成纤维样细胞形态，可传15代以上，第5代rBM—MSC高表达基质受体CD44（32％），低表达造血细胞标记CD45（4．7％）；RT—PCR显示高表达Ⅰ型胶原，弱表达Ⅱ型胶原，不表达X型胶原；在不同的诱导条件下．rBM—MSC可被诱导分化为成骨细胞、软骨细胞、脂肪细胞和神经元样细胞。rBM—MSC对IL-3最为敏感．10ng／ml的低浓度IL-3可显著促进细胞增殖达32％以上（P〈0．01），而高浓度IL-3能显著抑制其生长。结论：分离培养了rBM—MSC，其生物学特征与人和猕猴等BM—MSC相似的生物学特性，低浓度IL-3可有效促进其增殖。     

红景天苷对骨髓间充质干细胞增殖的影响

本研究旨在探索红景天苷对骨髓MSC增殖及干细胞因子（SCF）分泌的影响.应用密度梯度离心和贴壁培养法,体外分离并扩增MSC,应用流式细胞术和成脂及成骨诱导法进行MSC鉴定,并观察红景天苷对MSC增殖、细胞周期及分泌SCF的影响.结果表明,红景天苷可影响MSC的增殖,以1.5 mg/ml浓度刺激MSC增殖作用最强,在24、48、72 h内存在一定的时间依赖性,并且红景天苷明显增加S、G1/M期细胞比例,尤以1.5 mg/ml作用明显.应用1.5 mg/ml红景天苷与MSC共培养48 h,其培养上清中SCF含量明显上调（P＜0.01）,其mRNA表达也明显增加（P＜0.01）.结论：在一定剂量浓度下红景天苷对MSC有明显增殖促进作用,并可提高MSC的CSF基因表达和分泌.