结核分支杆菌耐药分子机制及快速检测的研究

目的：研究结核分支杆菌异烟肼、利福平耐药的分子机制，探索快速检测结核分支杆菌异烟肼、利福平耐药性的分子生物学方法。方法：应用聚合酶链反应－单链构象多态性（PCR－SSCP）检测结核分支杆菌异烟肼、利福平耐药株与katG基因、rpoB基因突变。结果：46例株结核分支杆菌临床分离株均未发现katG基因序列的缺失，17株检测到katG基因突变，耐药株中katG基因的突变率为57％；87株结核分支杆菌利福平耐药临床分离株的PCR－SSCP结果显示，所有39株利福平敏感菌无突变检出，48株利福平耐药菌中，36株高度利福平耐药菌和7株低度利福平耐药菌检测到rpoB基因突变；另5株低度利福平耐药菌未检测到rpoB基因突变，利福平耐药株中rpoB基因的突变检出率为89．6％。结论：证实katG和rpoB基因突变分别是结核分支杆菌异烟肼和利福平耐药的主要分子机制。应用聚合酶链反应－单链构象多态性（PCR－SSCP）可快速检测结核分支杆菌异烟肼、利福平耐药性，使应用传统耐药测定方法需时1－2个月缩短到2天内即可完成，使非生长依赖性分子生物学手段应用于快速检测结核分支杆菌耐药性成为可能。     

应用巢氏PCR-RFLP直接检测结核病临床标本中结核分支杆菌链霉素耐药基因型

目的：了解结核分支杆菌链霉素耐药基因突变情况,建立快速检测耐药突变株的方法。方法：通过ＰＣＲ－ＳＳＣＰ、ＰＣＲ－ＲＦＬＰ和巢氏ＰＣＲ－ＲＦＬＰ分析４０株结核分支杆菌临床分离株和１５例临床标本的ｒｐｓＬ基因突变的部位和性质。结果：１０株药物敏感株的ｒｐｓＬ双链泳动正常、并可被ＭｂｏⅡ消化;３０株耐ＳＭ分离株中,２５株双链泳动异常,２４株不被消化;１５例临床标本中,常规ＰＣＲ扩增７例ｒｐｓＬ阳性,巢氏ＰＣＲ１５例均阳性,４例ｒｐｓＬ双链泳动异常、并不被ＭｂｏⅡ消化。结论：通过常规ＰＣＲ－ＳＳＣＰ和ＰＣＲ－ＲＦＬＰ可快速检测结核分支杆菌耐ＳＭ分离株４３位密码子点突变,而通过巢氏ＰＣＲ－ＲＦＬＰ可直接检测大多数临床标本中结核分支杆菌ＳＭ耐药基因型。     

结核病临床标本中结核分支杆菌利福平耐药基因型的快速测定

目的：建立快速测定结核临床标本中结核分支杆菌RFP耐药性的方法，探讨其应用价值。方法：应用PCR－SSCP银染色法和EB染色法对58株结核分支杆菌临床分离株和17例临床标本的rpoB基因进行分析。结果：PCR－SSCP分析结核分支杆菌rpoB基因的敏感性为1～10PgDNA；通过SSCP图谱分析可特异检测结核分支杆菌的rpoB基因突变。32株RFP耐药株中30株（93．8％）发生rpoB基因突变，呈现四种类型的异常SSCP图谱；26株RFP敏感株中1株（3，8％）有rpoB突变。2例涂片阳性培养阳性结核性疾标本有rpoB基因突变，与常规药敏试验相符；5例涂片阳性培养阴性和10例涂阴培阴的结核性标本均未发现rpoB基因突变。结论：大部分结核分支杆菌RFP耐药性产生是由于其rpoB基因突变所致，采用PCR－SSCP方法可快速测定结核病临床标本中结核分支杆菌RFP耐药基因型。     

结核分支杆菌异烟肼耐药的分子机制及其快速鉴定

目的：探讨快速检测结核分支杆菌异烟肼耐药的分子药敏方法。方法：用聚合酶链反应-单链构象多态性(PCR-SSCP)检测了20株异烟肼(INH)敏感的结核杆菌临床分离株，20株INH耐药株的katG基因，随后用SSCP方法鉴定扩增产物有无突变，以结核分支杆菌H37RV作对照。结果：所有INH敏感株均观察到katG基因扩增产物，20株INH耐药株中19株观察到katG基因扩增产物。以H37RV标准株为对照，20株敏感株SSCP带谱与对照相同；19株INH耐药株中8株与对照相同，11株有不同程度的差异，INH耐药katG基因突变或缺失的阳性率为60％。结论：多数结核分支杆菌耐INH是由于其katG基因突变所致，用PCR-SSCP筛选突变株可达到快速检测结核分支杆菌INH耐药的目的。     

青岛地区结核分支杆菌吡嗪酰胺耐药基因pncA的检测

目的 了解青岛地区结核分支杆菌耐吡嗪酰胺（PZA）分离株pncA基因突变的情况,探讨其与耐PZA之间的关系。方法 应用BACTEC-460培养系统对76例结核分支杆菌临床分离株进行结核分支杆菌常规培养和药敏检测,聚合酶链反应-单链构象多态性（PCR-SSCP）技术检测pncA基因的突变。结果 76株结核分支杆菌临床分离株均经PCR扩增出结核分支杆菌复合群保守序列IS6110基因片段,69株扩增出pncA基因的特异序列。后者包括：SSCP泳动异常者18株,其中耐药株13株,敏感株5株;SSCP泳动正常者51株,其中耐药株14株,敏感株37株。结论 青岛地区结核分支杆菌临床分离株耐PZA主要分子机制之一为pncA基因的突变;PCR—SSCP技术能快速准确地检测结核分支杆菌耐PZA基因pncA的突变,可弥补常规药敏试验的不足。     

应用PCR—SSCP方法鉴定深圳市龟分支杆菌暴发感染的研究

目的：鉴定深圳市龟分支杆菌脓肿亚种的基因。方法：通过聚合酶链反应（Polymerase Chain Reactiom)-单链构象多态性（Single-Stranded Conformation Polymorphism,SSCP)方法分析深圳龟分支杆菌分离株的16S rRNA,根据其电泳图谱与标准株的相似性进行鉴定。结果：35株龟分支杆菌分离株与龟分支杆菌脓肿亚种标准株的SSCP图谱对比,6株显示出与龟分支杆菌脓肿亚种标准株相似的图谱,29株显示出不同的图谱。结论：应用PCR－SSCP方法可将深圳市龟分支杆菌脓肿亚种分为两种基因型。     

四川地区结核分枝杆菌喹诺酮耐药基因突变研究

目的 研究结核分枝杆菌耐喹诺酮类药物的分子机制,探索四川地区耐喹诺酮结核分枝杆菌临床分离株的耐药基因突变特征。方法 采用绝对浓度法检测结核分枝杆菌临床分离株的最小抑菌浓度(MIC),再通过聚合酶链反应-单链构象多态性(PCR-SSCP)和直接测序检测结核分枝杆菌耐喹诺酮类药物临床分离株gyrA耐药决定区(QRDR)突变,并和标准株H37Rv比较。结果 68株临床分离株中,14株喹诺酮药物敏感株和8株低耐药株未发现gyrA耐药决定区基因突变,25株高耐药株、11株低耐药株和10株药物敏感株检测到gyrA基因突变,高耐药株突变率为100％,低耐药株突变率为58％,敏感株突变率为42％,总的突变率为68％。根据SSCP条带,gyrA突变可分成4种类型,测序发现分别为Ser95Thr、Asp94Gly、Ala90Val、Ala83Val突变。结论 结核分枝杆菌耐喹诺酮与gyrA基因突变密切相关,gyrA基因突变是耐喹诺酮结核分枝杆菌耐药性的主要分子机制。     

PCR—SSCP快速检测脊柱结核耐药基因

目的 了解临床脊柱结核耐药情况 ,探讨耐药基因PCR-SSCP对临床的应用价值.方法 43例脊柱结核患者结核肉芽组织应用BacT/ ALERT 3D结核分支杆菌快速培养系统培养,所得临床分离株行药敏试验,对耐药基因katG、r p s L行PCR-SSCP.结果 43例结核肉芽组织标本培养后19例阳性,其中6株存在不同程度耐药 ,总耐药率为31%.耐异烟肼株 katG突变率为 10% ,耐链霉素株 rpsL突变率为21% , 耐药基因检测平均用时为14h.结论 PCR-SSCP可快速检测脊柱结核耐药基因,与常规药敏试验结合可更能准确地反应脊柱结核患者的耐药情况.     

结核分支杆菌rpoB基因突变和耐利福平的相关性研究

研究结核分支杆菌ｒｐｏＢ基因突变及其与利福平（ＲＦＰ）耐药性的关系,建立快速检测耐药基因型的分子药敏试验方法。用ＰＣＲ—ＳＳＣＰ分析结核分支杆菌ｒｐｏＢ基因。结果显示ＰＣＲ扩增ｒｐｏＢ基因为属特异性。８１株结核分支杆菌的ＰＣＲ－ＳＳＣＰ图谱与Ｈ３７Ｒｖ为对照,３５株敏感菌仅有一株位置有区别;４６株耐药菌有４２株有明显区别;检测阳性率为９１．３％;特异性９７．１％。证明ｒｐｏＢ基因突变是结核分支杆菌耐利福平的主要机理,ＰＣＲ—ＳＳＣＰ可简便快速地检出ｒｐｏＢ基因的突变,有助于结核分支杆菌耐药性的快速检测和研究。     

PCR-SSCP快速检测耐多药结核分枝杆菌

目的:了解本地区结核病耐药基因突变情况,探讨PCR-SSCP作为新的分子药敏试验方法在临床的应用价值。方法:通过提取耐INH、RFP、SM的肺结核患者痰中结核分枝杆菌DNA,进行PCR-SSCP分析,检测结核分枝杆菌rpoB、katG、rpsL基因是否存在突变,并与传统L-J药敏实验对照。结果:30株耐多药株中,耐RPF、INH、SM基因突变阳性率为90%(27/30)、63%(19/30)、53%(16/30)。3个基因联合突变共8株(26.7%),2个基因联合突变共18株(60%),即26株(86.7%)。单基因突变共2株,2株无基因突变。结论:通过PCR-SSCP方法可检测出绝大部分耐多药结核病的耐药基因,rpoB、katG、rpsL基因突变与本地区结核杆菌对RFP、INH、SM耐药性有关。与传统L-J药敏实验对比,PCR-SSCP是一种敏感、快速的指导临床用药的先进检测方法。     

银染单链构象多态性分析——一种快速检测基因点突变的新方法

银染单链构象多态性分析──一种快速检测基因点突变的新方法Ｓｉｌｖｅｒｓｔａｉｎｓｉｎｇｌｅｓｔｒａｎｄｃｏｎｆｏｒｍａｔｉｏｎｐｏｌｙｍｏｒｐｈｉｓｍ──Ａｒａｐｉｄａｎｄｓｉｍｐｌｅｍｅｔｈｏｄｔｏｄｅｔｅｃｔｇｅｎｅｐｏｉｎｔｍｕｔａｔｉｏｎｓ王...     

耐多药肺结核患者结核分支杆菌耐药基因检测及治疗观察

目的：检测肺结核患者痰标本的耐药基因，并观察其抗结核疗效。方法：用PCR－SSCP方法对43例初治和26例复治耐多药临床肺结核患者痰标本进行耐药基因检测，并观察化疗结果。结果：43例初治痰标本检测，4例rpoB基因突变，无KatG,rpsL基因突变；26例复治痰标本rpoB，KatG,rpsL检出分别为26／26（100％），13／26（50％），12／26（46％）；复发肺结核患者3个月及6个月痰阴转率为76．9％，76．9％，X线好转率为76．9％和84．6％，结论：PCR－SSCP法对耐多药临床肺结核患者痰标本进行rpoB，KatG,rpsL检测，可为临床肺结结核患者耐药情况辅助诊断，指导治疗。     

通用引物PCR-SSCP技术分析16SrRNA基因特征快速鉴定细菌

目的探讨通用引物聚合酶链反应一单链构象多态性(PCR-SSCP)技术在细菌检测中的应用。方法选取9种常见的细菌，采用通用引物对细菌的16SrRNA基因进行PCR扩增，产物进行单链构象多态性分析，并以标准菌株为对照。结果一对引物扩增产物SSCF，图谱各细菌之间难以区别；两对引物扩增产物SSCP图谱条带数日、相对迁移率及条带之间的间距存在明显，可相互区别；3种细菌的标准菌株和临床菌株的SSCP图谱完全一致。结论采用针对16SrRNA的通用引物PCR-SSCP技术以标准菌株为对照可方便快捷地检测细菌。     

通用引物PCR-SSCP技术分析16Sr RNA基因特征快速鉴定细菌

目的探讨通用引物聚合酶链反应-单链构象多态性(PCR-SSCP)技术在细菌检测中的应用.方法选取9种常见的细菌,采用通用引物对细菌的16SrRNA基因进行PCR扩增,产物进行单链构象多态性分析,并以标准菌株为对照.结果一对引物扩增产物SSCP图谱各细菌之间难以区别;两对引物扩增产物SSCP图谱条带数目、相对迁移率及条带之间的间距存在明显,可相互区别;3种细菌的标准菌株和临床菌株的SSCP图谱完全一致.结论采用针对16SrRNA的通用引物PCR-SSCP技术以标准菌株为对照可方便快捷地检测细菌.     

结核分枝杆菌耐异烟肼基因突变的快速检测

目的：探讨编码过氧化氢-过氧化物酶的katG基因突变与结核分枝杆菌异烟肼(INH)耐药性的相关关系。方法：根据结核分枝杆菌genebank中katG序列，自行设计特异性寡聚核苷酸引物，采用聚合酶链反应-单链构象多态性(polymerase chain reaction-single strand conformation polymorphism，PCR-SSCP)分析和直接测序法(direct sequencing，DS)分析结核分枝杆菌中katG基因突变情况．以H37，Rv标准株为对照。结果：所有23株敏感菌均未有SSCP结果异常；35株耐药菌中，有2株(5．7％)katG基因扩增阴性，且发生在高度耐药菌中．进一步分析发现，SSCP法突变检出23株(65．7％)，测序法突变检出24株(68．6％)，符合率为95．8％(23／24)．结论：参照测序法对耐药菌突变序列的分析结果，PCR-SSCP敏感、特异，可快速检测结核分枝杆菌katG耐药基因突变，有利于耐药结核分枝杆菌耐药性的快速检测。     

PCR法从痰液中快速检测结核分枝杆菌

目的：建立一种从痰液中检测结核分枝杆菌简便,快速且灵敏的方法。方法;用碱液化,水洗和Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ－１００热裂解法从痰液中制备结核分枝杆菌ＤＮＡ,进行ＰＣＲ反应,并将该方法同其它几种方法进行比较。结果：该方法同抗酸性染色镜检法有显差异,同酚／氯仿法具有的灵敏度,结论：用该方法从痰液中检测结核分枝杆菌具有灵敏,简便和快速等特点。     

PCR-SSCP法检测乙型肝炎病毒前C区基因变异

为探索一种快速，简便检测乙型肝炎病毒（HBV）前C区基因变异的方法，用聚合酶链反应（PCR）技术扩增94例乙肝患者血清HBV前C区基因片段，阳性扩增产物用单链构象多态性（SSCP）法进行检测，对具有不同特征性电泳图谱的PCR产物再以直接测序法加以核定，以辨别不同图谱与野生株，变异株或野生株，变异株混合感染之间的关系。结果显示：有86例患者HBV前C区PCR扩增阳性，SSCP法检测发现有3种常见的特征性电泳图谱，测序后证实，它们分别代表了野生株，变异株（nt1896位G→A）及野生株，变异株混合感染的SSCP图谱；在某些变异株图谱中，尚可见其它位点也存在变异，其中以nt1899位G→A突变最为常见，提示：以PCR-SSCP技术检测HBV前C区变异具有敏感性高，特异性强，简单，快捷，价廉等优点，而且特别适用于大样本的筛检，因此有应用价值，值得推荐。     

PCR-SSCP法检测结核分枝杆菌耐药性

目的：探讨耐多药结核分枝杆菌耐药基因突变与耐药性的关系以及聚合酶链反应-单链构象多态性分析(poly merase chain reaction-single strand cinfomlation polymorphism，PCR-SSCP)方法的临床应用价值。方法：用PCR-SSCP方法检测58株结核分枝杆菌临床分离株katG，rpoB，rpsL基因突变并与常规药敏试验检测结果进行对比。结果：经常规药敏试验检测，58株结核分枝杆菌临床分离株中共有41株耐药，其中，耐异烟肼(INH)为35株，高耐药株27株；耐利福平(RFP)为31株，高耐药株24株；耐链霉素(SM)有31株，高耐药株26株。同时耐3种药物的有21株(51．2％)，耐2种药物的14株(34．1％)，单耐药株6株(14．6％)．PCR-SSCP方法对58株临床分离株katG，rpoB，rpsL基因突变的检测率为40％(23／58)，45％(26／58)，38％(22／58)，其中检出3个基因同时突变的有13株(32％)，2种基因突变的12株(29％)，1种基因突变的有10株(23．8％)．常规药敏试验与PCR-SSCP法检出结核分枝杆菌同时耐3种药物的符合率为61．9％(13／21)，检出耐2种药物的符合率为85．70k，(12／14)，检出耐1种药物的符合率为50％(3／6)．高耐药株中突变率为80．5％(62／77)，低耐药株中突变率为60％(12／20)．结论：PCR-SS-CP方法对耐2种以上药物的结核杆菌检出率较高，且耐药基因突变率随着耐药浓度增高而增高。将PCR-SSCP法与药敏试验联合应用可互相弥补，已成为临床指导用药的好方法。     

快速检测结核分枝杆菌γpoB基因突变的研究

目的 :应用PCR SSCP技术直接快速检测痰标本中结核分枝杆菌γpoB基因突变 ,评价此方法用于结核分枝杆菌利福平 (RFP)耐药性的意义。方法 :以结核分枝杆菌H37Rv为对照、5 0例耐RFP(单耐和多耐 )结核分枝杆菌临床分离株、12例RFP敏感菌株、35例耐RFP肺结核患者痰标本 ,采用PCR SSCP检测痰标本和菌株中结核杆菌γpoB基因突变。结果 :5 0例耐RFP菌株中有 45例PCR SSCP条带与结核分枝杆菌H37Rv条带有明显差别 ,与药敏试验结果做对比 ,PCR SSCP检测敏感性为 90 % ,特异性为 10 0 % ;12例敏感菌株与H37Rv条带一致 ,35份肺结核病人痰标本 ,2 1份痰PCR扩增阳性 ,15份SSCP图谱与H37Rv图谱有差别 ,而用PCR SSCP 2 8份图谱与H37Rv有差别 ,阳性率为 80 %。结论 :PCR SSCP检测结核分枝杆菌γpoB基因突变快速、简便、易行 ,有望用于结核分枝杆菌RFP耐药性的快速测定 ,并将成为直接检测临床标本中结核分枝杆菌耐RFP快速方法     

PCR—SSCP应用于HLA—DRB基因分型重现性的影响因素

本文探讨了ＰＣＲ－ＳＳＣＰ方法应用于ＨＬＡ－ＤＲＢ基因分型重现性的主要影响因素。结果表明，ＰＣＲ－ＳＳＣＰ应用于ＨＬＡ－ＤＲＢ基因分型中受到的影响因素较多，如电泳温度、样品预处理，聚胶时间、ＴＢＥ缓冲液贮存时间及银染色过程等。