新的白血病相关基因LRP15真核表达载体构建及在K562细胞中的表达

 目的构建LRP15基因开放阅读框架(ORF)序列的真核表达载体,并观察其在K562细胞中的表达情况.方法采用RT-PCR方法自1例白血病患者中克隆LRP15cDNA片段,将目的基因LRP15克隆入pGEM-T载体中并进行酶切鉴定和DNA序列测定.将鉴定过的DNA片段插入真核质粒pcDNA3.1(+),构建真核表达载体pcDNA-LRP15.脂质体介导法将其转染K562细胞,72 h以RT-PCR方法检测转染细胞中LRP15基因的表达情况.结果酶切鉴定和序列分析证实,重组质粒含有人LRP15基因ORF序列;转染实验表明LR15基因能在K562细胞中表达.结论成功构建LRP15基因真核表达载体,并在K562细胞中获得表达,为进一步研究LRP15基因的功能奠定了基础.     

N-ras基因在K562细胞中的表达研究

目的探讨N-ras基因突变及表达水平与慢性粒细胞白血病发病的关系。方法以慢粒细胞株K562细胞为研究对象，采用RT-PCR和直接测序的方法对N-ras的表达水平及突变进行检测。结果RT-PCR结果示N-ras基因在K562细胞中表达升高，直接测序结果表明N-ras基因在K562细胞中不存在突变。结论N-ras基因在K562细胞中高表达，而其高表达机制与突变无关。     

逆转录病毒介导v-myc基因转染神经干细胞的实验研究

目的 体外通过逆转录病毒将v-myc基因转染从胎龄10～12周人工流产胚胎脑皮层分离的神经干细胞(NSCs)后，观察其生物学特性的改变。方法 分离、鉴定孕10-12周人工流产的人胚胎脑皮层来源的NSCs，并在体外培养增殖。使用构建了v-myc基因的逆转录病毒转染NSCs后，对其进行光镜及电镜观察、生长情况的测定、染色体分析以及裸鼠移植。结果 转染v-myc基因的NSCs仍然保持着未分化状态，能够自我更新以及具有多向分化潜能，并且生长速率明显加快，分裂增殖能力明显增强。然而这种细胞的染色体存在结构异常与数目异常，将其植入裸鼠皮下短期内能形成肿瘤。结论 转染v-myc基因的NSCs具有正常NSCs的基本特性，但同时也存在染色体异常与致瘤性，目前暂不适合于移植的研究及应用。     

携带人FIt3—Iigand基因逆转录病毒载体的构建及其在小鼠骨？…

Ｆｌｔ3ｌｉｇａｎｄ(ＦＬ)是近年来新发现的一种细胞因子,属于Ｉ型穿膜糖蛋白,具有膜结合型和分泌型两种不同的表达形式。ＦＬ与ＩＬ3、ＩＬ6、ＳＣＦ及ＧＭＣＳＦ等细胞因子协同刺激造血干/祖细胞增殖,因而在造血干/祖细胞的体外培养中获得了广泛应用。ＦＬ及ＧＣＳＦ协同作用能够动员造血干/祖细胞进入外周血,另外,ＦＬ还具有抗肿瘤的作用。人和小鼠ＦＬ基因在基因组中的结构十分相似,它们在核酸水平上有76%的相似性,在氨基酸水平上有72%的相似性。人ＦＬ可作用于小鼠细胞,产生与小鼠ＦＬ相同的生物学效应。为了研究ＦＬ在造血过程中的作…     

体外筛选抑制K562细胞生长的放线菌代谢物

目的：建立一种适合较大量微生物代谢物抑制K562细胞生长的体外筛选方法，筛选对K562细胞具有抑制作用，而对正常细胞Vero无明显抑制作用的土壤放线菌提取物。方法：放线菌培养液加入乙醇后，置于96孔板中。经过减压除去溶剂后，用MTT法检测各样品对K562及Vero细胞的抑制作用。结果与结论：从446种土壤放线菌提取物中筛选获得5种提取物对K562细胞具有明显的抑制作用，而对Vero细胞生长抑制作用较弱。     

D-Ala对转染DAAO基因的K562e细胞移植瘤的杀伤效应

以高致瘤性K562e细胞和表达DAAO基因的KDfGC细胞建立裸鼠移植瘤模型，D－丙氨酸（D－Ala)腹腔注射，持续3周，观察D－Ala对移植瘤的治疗作用以及肿瘤，裸鼠重要脏器的病理变化，结果显示，经D－Ala治疗，转基因肿瘤抑制率为53．8％，未转基因肿瘤抑制率为0．3％，治疗组KDfGC细胞瘤体出现围绕血管分布的坏死，心，肝，肾治疗组与对照组均无明显病理改变，说明在体内DAAO的K562e能被D－Ala有效杀伤，并对重要脏器无明显损伤。     

SHIP基因真核表达载体的构建、鉴定及对白血病细胞系K562的抑制作用

目的 构建真核表达质粒pCAC-IRESSHIP-GFP,并观察其在K562细胞中的表达. 方法 将SHIP基因的RT-PCR产物克隆入载体pCAG-IRES-GFP,经酶切、鉴定及测序分析,构建pCAG-IRESSHIP-GFP重组真核表达质粒.实验设置3个组:K562组(未转染)、K562/IRES组(转染宅载体pCAG-IRGA-GFP),K562/SHIP)组(转染重组质粒pCAC-IRES-SHIP-GFP).荧光显微镜和流式术榆测重组质粒的转染效率;Western blotting检测各组SHIP蛋白的表达及Akt磷酸化水平变化;MIT法和流式术分析SHIP基凶转染对细胞增殖的影响. 结果 重组质粒pCAG-IRESSHIP-GFP已成功载人SHIP的全长编码基凶,序列测定的结果与预期设计完全一致.荧光显微镜在K562/SHIP组町见绿色荧光,转染效率为4&2%±6.6%.Westem blotting显示K562/SHIP组有明显的SHIP蛋白表达,且p-Akt-308和p-Akt-473的水平(分别为0.182和0.381)较K562/IRES组(0.361和0.716)和K562组(0.365和0.725)明显下降(P＜0.01).流式术分析显示K562/SHIP组细胞生长减慢,G0/G1期细胞增多、G2/M期细胞减少,增殖指数降低. 结论 成功构建了3 585bp的SHIP基因真核表达质粒pCAG-IRES-SHIP-GFP,并在K562细胞中表达.外源性SHIP基因转染能使K562细胞增殖受抑,原因可能与Akt的磷酸化下调有关.     

人HGF基因重组逆转录病毒表达载体及包装细胞株的构建和鉴定

目的 :构建携带肝细胞生长因子 (HGF)的逆转录病毒载体 ,并建立高效、稳定生产HGF的包装细胞株。方法 :以pcDNA3.0 HGF质粒为模板进行PCR反应扩增出HGF基因全长序列 ,亚克隆至逆转录病毒载体pMSCVneo构建重组逆转录病毒质粒 ,以脂质体介导转染包装细胞PT6 7,经G4 18筛选 ,进而挑选抗性集落扩大培养后 ,用靶细胞NIH3T3测定病毒滴度 ,筛选出高效产毒细胞株。扩大培养后进行RT PCR鉴定HGFmRNA的表达。扩大培养NIH3T3细胞抗性集落 (NIH3T3/HGF) ,并用细胞培养上清进行人肝癌细胞系HepG2的扩散试验。结果 :PCR反应扩增出 2 2 0 0bp的HGF基因 ,构建了重组逆转录病毒表达载体pMSCV HGF ,测序鉴定正确。经脂质体介导转染包装细胞、G4 18筛选和NIH3T3测定病毒滴度 ,筛选出具有最高病毒滴度 (8.8× 10 7cfu /ml)的细胞集落 ,扩大培养后建立高效表达HGF的包装细胞株PT/HGF ,RT PCR证实HGF基因在PT/HGF中有转录。NIH3T3/HGF培养上清可使HepG2细胞扩散 ,形态改变。结论 :成功构建了携带HGF的逆转录病毒载体pMSCV HGF ,并建立了稳定、高效生产有活性的HGF的产毒细胞株PT/HGF。     

PB231诱导K562细胞凋亡的初步研究

 目的研究PB231诱导K 562细胞凋亡作用,探讨PB231的抗肿瘤机制.方法采用荧光显微镜观察细胞形态学变化,MTT法测定PB231对K 562细胞生长抑制作用,琼脂糖凝胶电泳检测细胞DNA裂解.结果K562细胞经PB31处理后,在倒置光显微镜下可见细胞变形和凋亡小体形成;荧光显微镜下可见染色质凝集.MTT法检测其IC50值为5×10-5M.琼脂糖凝胶电泳呈典型的"DNA Ladder".结论PB231可诱导K562细胞发生凋亡.这可能是其抑制K562细胞生长的作用机理之一.     

抗肝癌sFv-TNF-α基因逆转录病毒包装细胞系的建立

目的 :将分泌型抗肝癌单链双功能抗体基因 (sFv -TNF -α)克隆至逆转录病毒载体pLXSN ,包装并筛选具有高滴度感染性重组病毒产生细胞系。方法 :用平 -粘末端连接方法将sFv-TNF -α克隆至pLXSN ,磷酸钙共沉淀法转染PA31 7包装细胞并测定病毒滴度 ,用PCR及免疫组化方法分析鉴定重组逆转录病毒细胞系。结果 :成功构建了表达载体pLXSN -sFv-TNF -α ,筛选出一株cfu >1× 1 0 9·L- 1 的感染性重组病毒产生细胞系C2 2 。结论 :外源基因整合到转染细胞DNA中并表达 ,证实了重组病毒的活性及其转导靶细胞的可行性     

电离辐射致K562细胞旁效应的实验研究

目的 研究⁶⁰Co γ线不同剂量照射条件培养液(ICM)培养K₅₆₂细胞后引发的旁效应。方法 采用健康男性外周血自然杀伤(NK)细胞,观察不同剂量⁶⁰Co γ线照射的条件培养液培养后引发的K₅₆₂细胞对NK细胞敏感性的改变,同时用流式细胞仪检测K₅₆₂细胞的凋亡情况。结果 照射组NK细胞活性显著增加,即受照肿瘤细胞的培养基显著影响了未受照肿瘤细胞的存活能力,从而NK细胞对未照射细胞的活性显著增加;其中,从0.5 Gy起即出现显著升高, 1.0 Gy继续增加,2.0和5.0 Gy出现波动,在8.5 Gy达到最高。照射组K₅₆₂细胞的凋亡率比对照组显著增加(P<0.01),即受照肿瘤细胞的培养基显著影响了未受照肿瘤细胞的存活能力。在0.5 Gy处,即出现非常明显的效应。结论 对于K₅₆₂细胞,ICM对细胞显示出明显损伤作用,NK细胞活性显著增加,凋亡率升高。提示存在培养基转移介导的电离辐射旁效应。     

OD-PTD融合蛋白对K562细胞的作用

目的研究OD-PTD融合蛋白对K562细胞的作用。方法应用细胞计数的方法研究OD-PTD融合蛋白对K562细胞的生长曲线的影响;用MTT研究OD-PTD融合蛋白对K562细胞的细胞毒作用;用流式细胞仪技术研究OD-PTD融合蛋白对K562细胞周期的影响。结果OD-PTD融合蛋白能显著抑制细胞的生长(P<0.01);并且对K562细胞具有明显的细胞毒作用(P<0.01)。OD-PTD融合蛋白作用于K562细胞后,细胞周期变化明显,细胞从G0/G1期到S期发生明显阻滞(P<0.05)。结论OD-PTD融合蛋白对K562细胞有明显的抑制作用,为进一步探讨慢性粒细胞白血病新的治疗手段提供了实验依据。     

黄芪不同提取物对K562细胞向红系分化的诱导作用研究

目的探讨黄芪不同提取物对K562细胞向红系分化的影响。方法用超声醇提水提法从黄芪根中获取富含黄芪总苷(AST)的醇溶部分和富含黄芪多糖(APS)的水溶部分并分别作用于K562细胞,联苯胺染色法观察K562细胞向红系分化的情况,MTT法测定细胞活性。以丁酸钠(BA)处理的K562细胞作为阳性对照。结果以不同浓度(1、2、4、8mg/ml)APS作用于K562细胞后显示其有诱导后者向红系分化的作用,以4mg/ml为最适浓度,而AST诱导作用不明显。4mg/ml APS、AST及0.5mmol/L BA作用后K562细胞的联苯胺染色阳性率(BZ%)峰值分别为13.2%、2.9%及17.5%。以4mg/ml APS作用于K562细胞24、48、72h后,其BZ%显著低于同时点BA组(P<0.01),但72、96h的联苯胺染色阳性细胞总数明显高于BA组(P<0.01)。MTT测定结果显示,APS、AST对K562细胞的生长无明显抑制作用,而BA对细胞生长有明显抑制作用(P<0.01)。结论黄芪可诱导K562细胞向红系分化,其有效成分在富含多糖的水溶部分(APS),以4mg/ml浓度的诱导作用最强。黄芪提取物对K562细胞的生长无明显抑制作用。     

辐射后造血细胞表面IL-11受体表达的变化

目的 探讨体外照射后造血细胞表面IL-11受体(IL-11R)蛋白和基因表达水平的变化,为临床更合理有效地应用rhIL-11治疗急性放射病提供理论和实验依据。方法 采用流式细胞术及RT-PCR法检测了不同照射剂量和照射后不同时间K562细胞表面IL-11R蛋白和基因表达水平的变化。结果 随着照射剂量的升高,K562细胞表面IL-11Rα蛋白的表达量逐渐升高,其中5Gy和10Gy照射组照射后24h IL-11Rα蛋白表达水平较正常显著增高。结论 照射后24h IL-llRα蛋白及基因表达水平升高可能是机体自我保护的一种适应性反应,为早期应用IL-11提供了物质基础。     

羧酸富勒烯C3对K562和AHH-1细胞的辐射生物效应研究

目的 探讨羧酸富勒烯C₃(C₃)在辐射防护和辅助放疗方面的应用。方法 以不同浓度C₃与AHH-1、K562细胞共孵育,用CCK-8法、锥虫蓝试验检测C₃对细胞活力和存活率的影响,用Annexin-V/PI染色、流式细胞分析法研究照射后细胞凋亡和细胞周期的变化。结果 C₃对AHH-1细胞活力几乎无影响(存活率大于95%),但600mg/L的C₃使K562细胞存活率明显降低(82%)。100mg/LC₃用药照射组与单纯照射组相比,4Gy照射后AHH-1细胞的存活率显著升高(71.3%、90.3%),细胞凋亡率明显下降(26.3%、12.6%);而受照射24Gy的K562细胞存活率却呈现下降趋势(69.4%、66.1%),不同剂量照射后细胞凋亡率反而增加。细胞周期分析结果显示,C₃处理组AHH-1细胞12Gy辐射后G₂期阻滞(27.2%)与单纯照射组(40.8%)相比减轻;而K562受照细胞则反而加重。结论 C₃对AHH-1细胞具有较好的辐射防护作用,而对K562细胞则表现为抑制细胞增殖,促进辐射诱导的细胞凋亡并加重G₂期阻滞。