构建轻链次级库提高人抗TNF—α抗体的亲和力

目的：使用构建轻链次级库的方法,对已经获得的人源抗TNF－α单抗（mAb)的Fab进行轻链置换,并筛选具有更高亲和力的人源抗TNF－αmAb的Fab。方法首先,采用RT－PCR扩增正常人全套抗 轻链基因,并与已经获得的人源抗TNF－αmAb的重链基因配对,构建人源抗TNF－α噬菌体抗体的轻链次级库。然后筛选与TNF－α具有更高亲和力的克隆。结果,经过3轮的生物淘筛（biopanning),获得了较原来的人源抗TNF－αmAbFab具有更高亲和力的人源抗体Fab。结论轻链次级库筛选法,能有效地提高抗体的亲和力,为解决噬菌体抗体库法制备的人源抗体亲和力较低这一难题,提供了一种有效的方法。     

人源抗人类免疫缺陷病毒1型基因工程抗体的初步研究

目的 构建噬菌体抗体库,筛选抗HIV-1抗体Fab,并对其进行鉴定.方法 采集无症状、HIV-1抗体滴度较高的HIV-1感染者全血,分离淋巴细胞并提取总RNA,经RT-PCR扩增人轻链基因和重链Fd基因.运用噬菌体展示技术,构建噬菌体抗体库,经过3轮"吸附-洗脱-富集"筛选,将获得的克隆进行诱导表达,表达产物经ELISA检测,筛选阳性抗HIV-1 Fab克隆;对获得的克隆进行抗体基因序列测定并分析序列同源性和互补决定区(CDRs);对获得的阳性克隆与轻链克隆CL8进行链置换并检测链置换前后抗体亲和力的变化;对获得的克隆进行诱导表达及纯化,同时进行中和试验.结果 构建了库容为8×106的噬菌体抗体库;经3轮筛选,获得11株抗HIV-1 Fab克隆,测序和序列分析显示,获得了 10条轻链和8条重链,它们和已经申请专利的部分HIV-1 gp120抗体的基因序列有较高的同源性(轻链同源性为60%～90%;重链同源性为71%～85%);CDRs分析显示,11株抗体CDRHs均比较长(12～20aa);链置换后的抗体亲和力并没有明显的改进;Fab诱导表达量均大于10 mg/L,利用重组HIV-1假病毒系统进行中和试验,结果显示,3株Fab具有一定的中和作用.结论 成功获得抗HIV-1抗体Fab,为进一步对其进行研究和应用奠定基础.     

天然人源IgG Fab噬菌体抗体库的构建及多样性分析

目的:构建天然人源IgGFab噬菌体抗体库并分析来源于健康人外周血B淋巴细胞的抗体基因可变区的多样性及优势选择。方法:以DNA重组技术从300名健康志愿者的外周血淋巴细胞中扩增出全套人抗体轻链及重链Fd基因,分别插入噬菌体载体pFabICN相应位置,构建天然人源免疫球蛋白G基因文库;进一步从抗体库中随机挑选克隆,获得重轻链基因进行核苷酸序列测定并利用IgBLAST数据库分析抗体基因可变区的同源家族。结果:从4×108库容的天然人源IgGFab噬菌体抗体库中随机挑选克隆,对其中32个轻链及重链Fd基因插入正确的克隆进行核苷酸序列测定和氨基酸序列的推算,获得29条彼此完全不同的Fd重链基因及轻链基因。以IgBLAST数据库比对分析显示29条重链基因的V区分别属于VH3(72.4%),VH1(10.3%),VH4(6.9%),VH5(6.9%)和VH7(3.4%)基因家族。29条轻链基因分别属于Vκ1(44.8%),Vκ2(15.4%),Vκ3(11.5%),Vκ4(23.1%)基因家族和Vλ1(11.5%)基因家族。结论:以300份健康人外周血淋巴细胞的抗体基因构建的天然人源IgGFab噬菌体抗体库基因多样性良好,重链VH3基因家族存在优势表达。     

构建预设CDR3基因噬菌体抗体库筛选抗人整合素ανβ3 mAb的人源化Fab

目的:构建预设CDR3基因的噬菌体抗体库,通过抗原表位导向选择方法筛选抗人整合素ανβ3单克隆抗体(mAb)人源化Fab。方法:将鼠mAbLCDR3重组到人轻链可变区文库中并与人/鼠嵌合重链Fd基因配对构建杂合噬菌体抗体库,用固相人整合素ανβ3抗原筛选人源化轻链基因。再用所获人轻链基因与移植有鼠mAbHCDR3的人重链Fd基因配对构建人源噬菌体抗体库,筛选人源化Fab。结果:分别构建了库容为2.1×106和2×107的杂合噬菌体抗体库和人源噬菌体抗体库,筛选到3株人源Fab克隆。经间接ELISA及竞争抑制ELISA证实,能特异结合整合素ανβ3抗原,其中人源D5株Fab克隆的基因序列表明,人轻链可变区基因属VKIII亚群,人重链可变区基因属VH1亚群。结论:利用噬菌体抗体库技术,成功地进行了鼠抗人整合素ανβ3mAbE10人源化的改造,为进一步临床应用奠定了基础。     

抗呼吸道合胞病毒免疫噬菌体抗体库的构建及初步鉴定

目的: 构建小儿呼吸道合胞病毒感染患者人源性噬菌体抗体库, 搭建人源性抗体制备的技术平台, 为小儿呼吸道合胞病毒感染发病机制的研究、诊断、治疗和预防提供新的有效途径.方法: 从52例呼吸道合胞病毒感染患儿外周血淋巴细胞中提取总RNA, 并逆转录为cDNA.用PCR扩增轻链和重链Fd段(即重链的可变区和第一恒定区)基因, 并将扩增的轻链和重链基因片段克隆于pComb3x噬粒载体, 电转化XL1-Blue大肠杆菌, 经辅助噬菌体M13K07超感染后构建成Fab段噬菌体抗体库.对此抗体库双酶切进行鉴定, 并用呼吸道合胞病毒颗粒作抗原进行初步筛选.结果: 经过重轻链基因的重组, 成功构建一免疫噬菌体抗体基因库, 共有2.6×106个不同的克隆菌, 其中70%的克隆均含有轻链和重链Fd 基因.因此, 所构建的噬菌体抗体库的库容量为1.8×106, 经初步筛选, 抗体库得到了不同程度的富集.结论: 利用基因重组技术和噬菌体展示技术, 成功构建小儿呼吸道合胞病毒感染患者人源性免疫噬菌体抗体库, 为进一步的研究奠定了基础.     

以鼠源重链Fd片段为模板导向筛选人源性抗γ-精浆蛋白抗体轻链

目的:以鼠源抗γ-sm抗体重链Fd片段为模板,筛选人源性抗人γ-精浆蛋白抗体轻链。方法:利用RT-PCR从前列腺癌患者外周血淋巴细胞扩增出全套的人抗体轻链基因,克隆入含鼠源性抗γ-sm抗体重链Fd片段的噬粒载体pComb3X/mFd中,电转化大肠杆菌XL1-Blue后建立人-鼠杂合的Fab抗体库。通过稀释滴定、限制性酶切和随机测序,对所建杂合库的库容、重组率和多样性分别进行鉴定,以M13K07辅助噬菌体超感染,利用亲和纯化的γ-sm为抗原,对挽救展示的噬菌体抗体库进行3轮淘筛和克隆鉴定。最后对筛选出的杂合抗体进行初步的功能检测。结果:构建成功1.2×107CFU、重组率为90%、多样性好的杂合人-鼠噬菌体抗体库。利用纯化的γ-sm3轮亲和淘筛后,5个克隆成功诱导表达特异性的pIII融合抗体。ELISA进一步检测表明,5个克隆均呈特异性阳性反应,其中2个克隆亲和力较高,测序显示其所含轻链基因序列完全相同,可变区来源于IGKV4-101胚系基因家族。结论:利用鼠源Fd片段为模板,导向筛选杂合噬菌体库,成功筛选到人源性抗人γ-精浆蛋白抗体轻链。     

抗肝癌细胞噬菌体单链抗体库的构建及筛选

构建抗人肝癌细胞单链抗体库 ,从中筛选与肝癌细胞特异结合的高亲和力单链抗体。从HepG2细胞免疫的BALB/c小鼠脾脏提取总RNA ,RT PCR扩增小鼠抗体重、轻链可变区基因 ,用 (Gly4Ser) 3 连接肽基因 ,经重叠延伸反应 ,在体外将VH 和VL 连接成单链抗体 (scFv)基因 ,并克隆入噬菌粒载体pCANTAB5E中 ,构建噬菌体单链抗体库。以HepG2细胞为抗原对抗体库进行淘选 ,ELISA法鉴定各单克隆与肝癌细胞的结合活性 ,并对阳性克隆进行表达。成功构建了库容为 1 1× 10 6抗肝癌细胞的噬菌体单链抗体库 ,经筛选得到了与HepG2细胞具有较强结合能力的单链抗体 ,实现了scFv在大肠杆菌中的可溶性表达。序列测定结果表明 ,VH 和VL 基因符合小鼠抗体可变区特征 ,scFv基因拼接正确     

抗IL-13Rα2单克隆抗体轻链和重链可变区基因的克隆及鉴定

目的:在成功制备小鼠抗人IL-13Rα2高亲和力单克隆抗体(mAb)的基础上,通过分子克隆方法获得该抗体可变区基因序列。方法:从1株小鼠抗人IL-13Rα2 mAb杂交瘤细胞LX147-7中提取总RNA,以此为模板反转录获得cDNA,用针对小鼠mAb重链和轻链可变区基因序列的特异性引物分别进行PCR反应。将PCR产物连入克隆载体,经筛选阳性克隆,PCR和酶切鉴定正确后送测序,测序结果进行生物信息学分析。结果:成功克隆了抗人IL-13Rα2 mAb LX147-7重链和轻链的可变区基因。结论:获得了抗人IL-13Rα2 mAb LX147-7重链和轻链的可变区基因序列,为构建相关基因工程抗体打下了良好基础。     

Raji 细胞系特异性Fab噬菌体抗体库的构建及筛选

目的构建针对B细胞淋巴瘤Raji细胞系噬菌体抗体库并从中筛选出特异性的抗体。方法以Raji细胞免疫BALB/c小鼠,RT-PCR法从脾淋巴细胞中扩增抗体轻链к和重链Fd基因。经SacI/XbaI和XhoI/SpeI双酶切,依次克隆入噬菌体载体pComb3H-SS中,并电转化大肠杆菌XL1-Blue,以辅助噬菌体VCSM13进行超感染,构建B细胞淋巴瘤Raji细胞系特异性Fab噬菌体抗体库。以Raji细胞为抗原进行筛选,获得抗Raji细胞的抗体,通过ELISA法进行抗原结合活性的测定,并对所得阳性克隆进行基因测序分析。结果构建了容量为2.18×107的抗人B细胞淋巴瘤Raji细胞系的Fab噬菌体抗体库,并筛选获得了与Raji细胞系特异性识别结合的8株阳性克隆。对其中两个阳性克隆进行基因序列分析,结果显示其重链可变区、轻链可变区分别与免疫球蛋白基因库中已注册的鼠源性免疫球蛋白重链可变区和轻链可变区序列具有高度同源性。结论成功地构建Fab噬菌体抗体库并筛选出针对Raji细胞系膜抗原的抗体,为进一步研究B细胞淋巴瘤的免疫治疗提供了实验基础。     

人噬菌体抗体库的构建及人源性bFGF抗体的筛选

目的选用含高效价碱性成纤维细胞生长因子(bFGF)抗体的自身免疫病患者外周血淋巴细胞为材料,构建人噬菌体抗体库,并从中筛选抗bFGF抗体克隆。方法收集自身免疫病患者外周血,提取淋巴细胞总RNA后逆转录得到cDNA第一链,经PCR扩增重链Fd段和轻链基因,分别构建到噬菌粒载体pComb3中,将重组噬菌粒载体电转化大肠杆菌XL1Blue,以辅助噬菌体VCSM13超感染,构建人噬菌体抗体库。经过3轮固相筛选,获得能结合bFGF的抗体克隆,并用ELISA进行进一步鉴定及筛选,获得具有高亲和力的抗bFGF噬菌体抗体克隆。结果构建的人源噬菌体抗体库库容为2.5×107,经3轮筛选获得具有bFGF特异性的Fab噬菌体抗体克隆。结论构建了人噬菌体Fab抗体库,并能够从中筛选出与bFGF特异结合的抗体克隆,为bFGF抗体药物研究奠定基础。     

人源抗丙型肝炎病毒噬菌体抗体库的构建、筛选及表达

用常规RT PCR法 ,直接从 5名丙型肝炎患者外周血混合淋巴细胞中扩增抗体重链Fd基因和κ轻链基因 ,构建噬菌体抗体Fab库。对抗体库进行 5轮吸附 洗脱 扩增的亲和选择后 ,以ELISA法鉴定抗HCV噬菌体抗体。 5轮亲和选择使特异性噬菌体抗体得到高度富集 ,抗HCV噬菌体抗体阳性克隆达 96 %。对一阳性克隆在大肠杆菌中表达 ,经ELISA及Westernblot分析鉴定 ,证实成功表达出人源可溶性Fab。对抗体基因VH和VκDNA序列进行测定 ,证实所获基因为抗体可变区基因。抗HCV噬菌体抗体库的构建和人源抗HCV单克隆抗体Fab段的制备 ,为HCV感染的诊断、治疗和发病机制的研究提供有效的分子工具。     

抗角蛋白Fab抗体在大肠杆菌中的表达与复性研究

目的 :用大肠杆菌分别表达抗角蛋白抗体的轻链和Fd片段 ,体外复性得到Fab抗体。方法 :从已构建的质粒p3MH/Fab中 ,亚克隆抗角蛋白抗体的轻链和Fd片段基因 ,并分别插入载体pET32a中 ,构建重组质粒。以重组质粒分别转化大肠杆菌BL2 1(DE3) ,在IPTG诱导下进行表达。SDS PAGE分析发现 ,在相对分子量 (Mr)为 2 5 0 0 0处有外源蛋白表达。轻链和Fd片段变性后等量混合于折叠液中 ,复性后形成Mr 约为4 5 0 0 0的蛋白。结果 :成功地表达抗角蛋白抗体的轻链和Fd片段 ,ELISA和Westernblot证实 ,复性产物具有与角蛋白结合的能力。结论 :获得了具有活性的抗角蛋白的Fab抗体 ,为其应用研究打下了基础 ,也表明包涵体表达基因工程抗体技术是可行的。     

用导向选择链更替技术建立抗肝癌抗原HAb18G的人源性Fab基因库

目的 :在嵌合HAb18 Fab抗体的基础上 ,利用载体pComb3X ,采用导向选择链更替技术建立全人源性Fab基因库。方法 :用RT PCR自肝癌患者外周血单个核细胞 (PBMC)中 ,扩增全套人抗体Fd基因片段和L链基因。首先 ,将Fd基因克隆入已含嵌合L链基因的展示载体pComb3X/CL中 ,建立人 -鼠杂合的Fab基因库 ,以原核表达的非融合HAb18G的胞外区片段为抗原 ,筛选杂合的Fab基因 ,以得到人Fd基因。然后应用筛选出的Fd基因与人L链基因库配对 ,建立全为人Fab的基因库 ,并筛选全人Fab基因。将IPTG诱导的表达菌裂解 ,取其上清对pⅢ Fab融合蛋白的功能进行分析 ,并对其编码基因进行测序。结果 :建立了库容为 2× 10 7的杂合Fab基因库 ,经 6轮筛选后得到 7株杂合Fab基因。利用筛选的人Fd基因建立了库容为 0 .8× 10 7的全人Fab基因库 ,经 4轮筛选得到 2株亲和力较高、特异性强的人Fab基因。测序结果显示 ,2株Fab基因具有相同的Fd基因序列 ,与亲本抗体同属IgG2亚类 ;L链基因为κ型 ,可变区均属于Vκ3家族。结论 :利用导向选择链更替技术 ,筛选出特异性较强、完全人源化的抗肝癌抗原HAb18G的Fab抗体 ,为进一步的工作打下了基础。     

人源性抗角蛋白抗体Fab段在巴氏毕赤酵母菌中的表达及表达条件的优化

目的:用巴氏毕赤酵母表达抗角蛋白抗体Fab段并优化表达条件。方法:将抗角蛋白人Fab原核表达载体p3MH/Fab中的κ链和Fd段基因,分别亚克隆到酵母菌表达载体pPIC9K和pPICZαA中,构建成重组质粒pPIC9K/L和pPICZαA/Fd并测序鉴定。将重组质粒pPIC9K/L和pPICZαA/Fd分步整合到酵母菌GS115的染色体上,经G418和Zeocin筛选得到高拷贝的转化子。对Mut表型鉴定后,优化pH及甲醇浓度等表达条件。结果:优化表达条件后,成功地表达抗角蛋白Fab段抗体。Westernblot分析证实,表达产物具有良好的角蛋白结合活性和特异性。结论:人源性抗角蛋白Fab段抗体在巴氏毕赤酵母菌中获得成功表达,为其进一步的应用研究打下了基础。     

人源性噬菌体抗体库的构建及抗amylin抗体的初步筛选

目的:构建人源性噬菌体抗体库,从中筛选胰淀素(amylin)单克隆抗体(mAb),测定其特异性及抗原结合活性。方法:从正常健康人的外周血淋巴细胞中提取总RNA,用RT-PCR方法扩增人免疫球蛋白Fd段和轻链基因,构建噬菌体抗体库。酶切和PCR鉴定后,阳性克隆进行DNA测序分析。用人amylin抗原对抗体库进行筛选富集,将得到的阳性克隆进行Phage-ELISA鉴定,结果进行统计学分析。结果:最终构建的抗体库库容约为0.8×108,酶切鉴定显示有插入片段,抗体库重组率为70%。阳性克隆进行DNA测序证实所获基因为人免疫球蛋白可变区基因。以amylin抗原进行3轮筛选,抗体库得到特异性富集。阳性克隆进行Phage-ELISA检测证实有良好的抗胰淀素抗原的特异性。结论:成功构建了一个人源性噬菌体抗体库,为从中获得人源抗amylin的mAb奠定了实验基础。     

人源抗人免疫缺陷病毒1型噬菌体抗体库的构建及筛选

目的构建人免疫缺陷病毒１型（ＨＩＶ－１）特异性噬菌体抗体库，制备人源抗ＨＩＶ－１ｇｐ１２０单克隆抗体。方法以半巢式聚合酶链反应（ＰＣＲ）从ＨＩＶ－１感染者外周血单个核淋巴细胞中扩增抗体重链Ｆｄ和轻链（ｋ）基因，与噬菌体载体ｐＣｏｍｂ３连接，构建噬菌体抗体Ｆａｂ组合文库。对抗体库进行３轮吸附－洗脱－扩增的亲和选择后，以ＥＬＩＳＡ法筛选抗ＨＩＶ－１ｇｐ１２０噬菌体抗体，并进行ＤＮＡ序列分析和Ｆａｂ的可溶性表达。结果半巢式ＰＣＲ有效地扩增出Ｆｄ和ｋ基因，以此构建成容量为１９５×１０７的噬菌体抗体库。３轮亲和选择使特异性抗体得到高度富集，抗ＨＩＶ－１ｇｐ１２０噬菌体抗体阳性克隆占３２％。对一阳性克隆抗体基因ＣＨ１和ＣＬ部分ＤＮＡ序列进行了测定，并在大肠杆菌表达出可溶性Ｆａｂ。结论抗ＨＩＶ－１特异性噬菌体抗体库的构建和人源抗ＨＩＶ－１ｇｐ１２０单克隆抗体的制备为今后筛选抗ＨＩＶ中和抗体奠定了基础，具有重要的应用价值。     

人源性抗HER2胞外段Fab噬菌体抗体库的构建及筛选

目的:构建全人源抗HER2胞外段(HER2 ECD)噬菌体Fab抗体库,从中筛选出特异性的抗体,并对其进行鉴定。方法:体外致敏并用EB病毒(EBV)转化HER2高表达乳腺癌患者的外周血单核细胞(PBMC),用PCR分别扩增重链Fd和轻链κ/λ基因。经SacI/XbaI和XhoI/SpeI双酶切,依次克隆入噬菌体载体pComb3中,并电转化大肠杆菌XL1-Blue,以辅助噬菌体VCSM13进行超感染,构建抗HER2 ECD人源化Fab噬菌体抗体库。以纯化HER2 ECD蛋白为抗原进行3轮固相淘选,富集抗HER2 ECD的抗体,并随机挑选克隆进行ELISA,获得的阳性克隆进一步以Western blot鉴定其抗原结合活性,对其中活性最高的克隆进行DNA测序。结果:构建了容量为2.5×107的抗HER2 ECD的Fab噬菌体抗体库,并筛选获得了4株与HE2 ECD特异性结合的阳性克隆,Western blot分析显示其与HER2 ECD能较好的结合。选取结合活性最高的阳性克隆进行DNA序列分析,结果显示其重链可变区、轻链可变区分别与人胚系免疫球蛋白基因有高度的同源性。结论:成功构建了全人源抗HER2 ECD噬菌体抗体库,并筛选出抗HER2 ECD特异性较强的噬菌体克隆,为获得新的有临床应用价值的HER2 ECD抗体提供了实验基础。     

从半合成噬菌体抗体库中筛选抗角蛋白人抗体

目的：从半合成噬菌体抗体库中筛选人源性抗角蛋白抗体并进行鉴定。方法：以表皮角蛋白为抗原,通过吸附－洗脱－扩增过程从半合成噬菌体抗体库中筛选特异性抗角蛋白抗体,对其抗原结合活性的序列进行分析鉴定。结果;经过４轮筛选,获得２０个能与角蛋白结合的阳性克隆,其中可产生特异性抗角蛋白抗体的克隆１８个。经ＤＮＡ指纹分析,判断所获克隆分别包含４个不同的Ｆａｂ段基因。     

鼠源抗haPrP23-231噬菌体抗体库的构建和初步鉴定

目的构建和鉴定鼠源抗haPrP23-231噬菌体抗体库。方法利用纯化的朊蛋白抗原免疫BALB/c小鼠,取脾,提取细胞总RNA,逆转录cDNA,以其为模板进行免疫球蛋白Fab区基因的特异性PCR扩增,将轻链和重链Fd段基因分别构建到pComb3质粒,构建噬菌体抗体库。结果经过四轮"吸附-洗脱-富集"的过程后获得了12株阳性克隆。挑取5株进行序列分析,并将结果与GenBank中已知序列库中的IgG序列进行比较,得到了两株不同的抗体,并进行了初步鉴定。结论本研究为朊病毒病的研究奠定了基础。