血清中乙型肝炎病毒全基因组及X基因的克隆与鉴定

目的:建立从血清样品直接扩增乙型肝炎病毒(HBV)全长DNA的方法,构建HBV全基因组克隆.方法:用长链PCR从血清样品一次性扩增HBV全长DNA,测序鉴定后插入质粒puc19构建含HBV全基因组的重组质粒,再从重组质粒扩增X基因并进行序列分析.结果:经DNA序列测定和酶切分析,获得HBV全基因组克隆,从克隆的HBV全基因组扩增到X基因.结论:从血清中可直接扩增到HBV全基因组DNA,为整体水平研究HBV基因组的变异与其致病及宿主抗感染免疫之间的关系奠定了实验基础.     

利用重叠延伸PCR快速构建中国株乙型肝炎病毒的感染性克隆

目的：体外扩增中国株乙型肝炎病毒（hepatitis B virus,HBV）的基因组全长序列,快速构建中国株HBV感染性克隆,建立中国株HBV体外复制细胞模型。方法：设计保守引物,扩增HBV全长基因组序列。对扩增到的HBV基因组进行DNA测序及计算机辅助分析,确定病毒的基因型。通过重叠延伸PCR（splicing by overlap extension PCR,SOE-PCR）技术,构建1.3倍基因组长度的HBV感染性克隆质粒pHBV1.3。将pHBV1.3质粒转染人肝癌细胞系HepG2,采用Western Blot、酶联免疫吸附试验及Real-PCR检测病毒复制及表达情况。检测该感染性克隆对临床抗病毒药物阿德福韦的敏感性。结果：成功扩增到1株C基因型HBV全长基因组,其GenBank登陆号为KF495606。构建了中国株HBV感染性克隆pHBV1.3（C）质粒,该质粒能在肝癌细胞株中进行有效的复制、转录和表达。阿德福韦能在体外抑制该HBV感染性克隆的复制,抑制程度依赖于药物浓度。结论：利用SOE-PCR可快速构建HBV感染性克隆,所构建的感染性克隆能介导高水平病毒复制,可用于HBV复制机制和抗病毒等方面的研究。     

登革2型病毒NGC株基因组亚克隆的构建及其鉴定

目的 构建登革2型病毒NGC株基因组全序列的亚cDNA克隆，为进一步构建全长感染性cDNA克隆奠定基础。方法根据登革2型病毒NGC株基因组全序列中的酶切位点设计2对引物，从病毒感染的乳鼠脑中提取RNA，采用长链RT—PCR技术扩增出覆盖病毒基因组全长的2个cDNA片段，并克隆至pCR—XL—TOPO载体后测序。结果经酶切鉴定和序列测定表明，获得的cDNA克隆为登革2型病毒NGC株特异的。结论已成功构建出登革2型病毒NGC株基因组的2个cDNA亚克隆。     

乙肝病毒抗原基因真核表达载体的构建及表达

目的:构建乙肝病毒(Hepatitis B virus,HBV)相关抗原基因真核表达载体,检测各抗原基因在体外真核细胞中的表达情况.方法:以含有1.3倍的HBV全基因组序列的质粒PcDNA3.1-HBV为模板,PCR扩增HBV的各抗原基因片段,通过连接至中间克隆载体Peasy-T1-Simple,酶切及测序鉴定正确后,...     

HBV全基因组逆转录病毒载体的构建及鉴定

目的 构建HBV全基因组逆转录病毒载体,并进行酶切鉴定和测序.方法 用合适的引物,通过PCR方法 扩增pBlueScript sk(-)-HBV载体上的HBV全基因组,分别用Hind Ⅲ和Sd Ⅰ进行PCR产物和pLEGFP-N1载体的双酶切,用连接酶将HBV DNA和载体进行连接,转化连接产物后,进行质粒提取、酶切和测序鉴定.结果 PCR产物凝胶电泳可见3.2 kb条带.pLEGFP-N1-HBV重组质粒酶切结果 电泳后,可看见6.9 kb和3.2 kb的条带,测序结果 表明重组质粒含有HBV全基因组.结论 成功构建了HBV全基因组逆转录病毒载体,为下一步形成稳定的细胞模型奠定基础.     

人自然杀伤细胞抑制性受体P58.2基因克隆与鉴定

目的：P58．2基因克隆与鉴定。方法：采用RT—PCR技术，从正常人外周血单个核细胞中扩增自然杀伤细胞抑制性受体P58．2基因全长cDNA，经酶切后构建重组克隆载体，双酶切和测序鉴定。结果：RT—PCR获得了预期的扩增产物P58．2全长cDNA，成功构建了pSPORT1-P58．2重组克隆载体，酶切、酶谱分析与预期结果相符。DNA测序结果与GenBank登记的人P58．2cDNA全长碱基序列一致。结论：pSPORT1-P58．2重组克隆载体构建成功；P58．2基因序列与文献报道一致，为下一步构建表达载体和基因转染等工作打下良好的基础。     

一种新的乙型肝炎病毒全基因组克隆技术的建立

目的建立一种乙型肝炎病毒(HBV)全基因组扩增及克隆的新方法。方法设计含SalⅠ、NotⅠ酶切位点的引物,用一片段PCR法扩增HBV全基因组,经双酶切后将PCR产物克隆入pBlueScript-(SK-)载体,进行HBV全基因组序列测定。结果用此方法成功获得35例HBV全基因组DNA序列。同时以重组质粒为模板进行敏感性和保真性测定,其敏感性为102个初始模板,核苷酸的人为突变率为1.6bp/kb。结论此方法可用于大规模HBV全基因组扩增和序列分析,为HBV的基础和临床研究提供了一种新方法。     

人DNA聚合酶β全长cDNA的克隆、鉴定及真核表达载体的构建

目的 克隆人类DNA聚合酶（pol-β)基因全长cDNA，构建该基因的真核高铲表达载体。方法 抽提人胚肺纤维细胞HLF总RNA进行RT－PCR扩增，用pGEM-T载体经T／A克隆，DNA测序确定后，用双酶切将pol-β全长cDNA定向克隆到绿色荧光蛋白表达载体EGFP-Cl，转染大肠杆菌DH5α,筛选阳性克隆，双酶切鉴定重组质粒。结果 经RT－PCR获得1.03kb的产物，经DNA顺序，确定所扩增片段为人类pol-β基因全长cDNA，进而成功筛选出真核表达载体pEGFP-Cl-β。结论 成功构建人pol-β基因全长cDNA真核表达载体，为进一步建立该基因的高表达细胞株提供基础。     

乙型肝炎病毒全长基因的扩增

目的 为从全基因水平研究乙型肝炎病毒变异与致病性的关系，建立从血清及质粒标本经聚合酶链反应（PCR）扩增HBV全长基因的新方法，并初步进行克隆分析。方法 设计了含Sal I,Sap I酶切位点的引物，扩增3200 kb HBV全长DNA，经酶切及连接后克隆入载体。结果 用新建立的方法直接从少量血清中获得了全长HBV基因以及HBV全基因克隆。结论 该法可用于对HBV毒株的基因结构和功能的研究。     

殊异韦荣菌乳酸脱氢酶基因的克隆及鉴定

目的：对殊异韦荣菌(V.dispar)乳酸脱氢酶(LDH)基因及其前后基因进行克隆和鉴定,为龋病的预防和治疗奠定理论基础。方法：提取殊异韦荣菌基因组DNA,利用PCR方法扩增LDH及其前后同源区序列片段,并克隆入pMD18-T载体中,转化大肠杆菌JM109,酶切及PCR鉴定后,进行测序。结果：PCR扩增产物特异,全长2...     

耐拉米夫定乙型肝炎病毒变异株全基因组克隆及鉴定

目的:扩增并克隆耐拉米夫定乙型肝炎病毒(HBV)变异株全基因组DNA,为构建含双体HBV YMDDDNA质粒和HBV YMDD变异株细胞模型及研究药物筛选奠定基础。方法:从一名耐拉米夫定的慢性乙型肝炎病人血清中提取HBV病毒DNA,用错配PCR结合限制性片段长度多态性(RFLP)进行变异分析,然后采用PCR方法在HBV负链开环缺口处及基因组中单一酶切点(SpeⅠ)处,设计两对引物从两个方向分别扩增1.15 kb和2.05 kb的单链及双链DNA区,利用基因重组技术,将两片连接后克隆至质粒pcDNA3.1-中,再进行DNA序列测定。结果:错配PCR结合RFLP分析证实该病毒存在YVDD变异,通过两段法克隆出HBV全基因组,经序列分析所得为HBV YMDD变异株全基因组。结论:成功克隆出HBV YMDD变异株全基因组。     

乙型肝炎病毒C基因启动子变异株克隆的构建及应用

目的：构建乙型肝炎病毒（HBV）C基因启动子（BCP）变异株克隆。方法：采用PCR产物克隆法。结果：构建成功pBCM质粒，经克隆鉴定及错配PCR－RFLP证实为目的克隆。结论：质粒pBCM可作为错配PCR－RFLP检测HBV BCP基因变异株检测的阳性对照。     

首例中国株乙型肝炎病毒D基因型全序列测定及分析

目的　测定并分析１例中国慢性无症状携带者感染的乙型肝炎病毒（ＨＢＶ）Ｄ基因型的全基因序列。方法　用聚合 酶链式反应（ＰＣＲ）扩增ＨＢＶ全基因,将ＰＣＲ产物克隆后对其进行核酸序列分析并与已发表的ＨＢＶ毒株全序列进行 同源性比较;对 ＧｅｎＢａｎｋ中已发表的３０株ＨＢＶ Ｄ基因型毒株的全序列进行系统进化树分析。结果　该病毒全基因长 ３１８２ｂｐ,为ａｙｗ亚型,Ｄ基因型;此毒株全基因ＧｅｎＢａｎｋ　ＡｃｃｅｓｓｉｏｎＮｏ为ＡＦ２８０８１７;与ＧｅｎＢａｎｋ中已发表的ＨＢＶＤ 基因型全序列同源性为９８．３％～９４．5％,与已发表的 Ａ、Ｂ、Ｃ、Ｅ、Ｆ和Ｇ基因型全序列同源性均小于８９．５％。结论　首例中 国株 ＨＢＶ Ｄ 基因型全序列与源于瑞典的四株 ＨＢＶ Ｄ 基因型全基因的进化距离最近。     

汉滩病毒西安分离株84FLi M片段的克隆

目的:克隆汉滩病毒84FLi株M片段的cDNA. 方法:提取病毒总RNA,反转录为cDNA模板,用高保真的Taq酶扩增出G1和G2两个糖蛋白编码的基因片段:84M2.0(1～2058)和84M1.6(1964～3616). 将这两个片段分别与T载体-pMD18-T连接,转化感受态大肠杆菌后获得两个分别为G1和G2编码的克隆pMD84M2.0和pMD84M1.6. 再利用酶切连接的方法获得M片段全序列的cDNA克隆. 结果:获得两个分别为G1和G2糖蛋白序列编码的克隆,进而酶切组装为含有M片段全序列的cDNA克隆. 结论:获得了84FLi株M片段全序列的cDNA克隆.     

SARS冠状病毒PUMC2株全基因组cDNA分段克隆

目的 分段克隆SARS冠状病毒PUMC2株的全基因组cDNA。方法 以SARS冠状病毒PUMC2株基因组RNA为模板,用RT-PCR扩增cDNA片段,PCR产物经纯化后,连接人pGEM-T载体中,进行序列测定。结果 获得了SARS冠状病毒PUMC2株基因组全长cDNA的分段克隆。结论 SARS冠状病毒PUMC2株基因组全长cDNA分段克隆的获得,为SARS冠状病毒基因功能的研究和全长有感染性cDNA的克隆奠定了基础。     

新基因TMBP-1的全长cDNA克隆

目的：克隆胸腺细胞发育相关新基因。方法：本研究建立了抑制性差减杂交技术（SSH）、构建了胸腺基质细胞系cDNA差减杂交文库。应用cDNA末端快速扩增方法（RACE）进一步克隆新基因的cDNA全长序列。结果：筛选两个不同胸腺基质细胞系的差异表达基因,获得了新基因cDNA片段C91,应用RACE成功克隆新基因TMBP－1cDNA全长序列。它拥有一个969bp的开放读码框架,编码323个氨基酸。同源序列 比较发现,它编码一个未知功能的膜结合蛋白。Northem杂交分析显示,mRNA转录本长度为1．5kb;在两种胸腺基质细胞系中均有表达。新基因的cDNA全长序列。已被GenBank所接受。结论：抑制性差减杂交技术是克隆新基因片的有效方法;成功克隆新基因TMBP－1的cDNA全长序列。     

HBV前S区的基因克隆及序列测定

获取ＨＢＶ前Ｓ区基因,并进行序列测定,为今后研究其机理及应用创造条件。方法：用ＰＣＲ方法从含ＨＢＶ基因组的模板中扩增ＰｒｅＳ基因,重组入Ｂｌｕｅ－ｓｃｒｉｐｔ载体,用自动测序仪,采用荧光素标记的引物,测定基因的序列,结果：成功地扩增到ＰｒｅＳＡＱ ＷＧ ＴＡ ＡＤ     

HBV X-HCV C融合基因重组腺病毒的构建及鉴定与表达

目的:应用重叠区扩增基因拼接法(gene SOEing)获得HBV X-HCV C融合基因,构建HBV X-HCV C融合基因重组腺病毒。方法:应用gene SOEing法扩增HBV X-HCV C融合基因并将其克隆至穿梭质粒pAdTrack-CMV,获得重组腺病毒穿梭质粒pAdTrack-CMV-XC,经PmeⅠ酶切线性化后电转化BJ/AdEasy菌,构建重组腺病毒质粒pAd-XC;鉴定正确的pAd-XC经Pac I酶切线性化后脂质体法转染293细胞进行包装,扩增,利用绿色荧光蛋白(Green fluorescent protein,GFP)监测病毒滴度和感染效率,Western-blot法检测目的蛋白的表达。结果:测序结果显示,pAdTrack-CMV-XC构建成功;PCR及Pac I酶切鉴定结果表明pAd-XC构建成功;经Pac I酶切线性化的pAd-XC转染293细胞后24 h即可观察到GFP的表达;回收的病毒可重复感染293细胞,Western-blot法检测到目的蛋白的表达,证实有感染能力且可表达目的蛋白的病毒颗粒包装成功。结论:HBV X-HCV C融合基因重组腺病毒构建成功,为进一步研究HBV X蛋白和HCV C蛋白的生物学功能奠定了基础。