二烯丙基二硫化物诱导胃癌BGC823 细胞周期G2/M期阻滞的机制*

目的:以细胞周期作为抗癌药物新靶点的研究,可能是很有前途的。笔者的前期工作发现,二烯丙基二硫化物（diallyl disulfide,DADS）可抑制人胃癌BGC 823 细胞增殖,其增殖抑制与细胞周期G2/M期阻滞有关;DADS可能是通过抑制细胞分裂周期蛋白25C（Cell division cycle protein 25C,Cdc25C）、cyclinB 1 表达使部分BGC 823 细胞停滞在G2/M期,但G2/M期阻滞的机制还未完全阐明。本研究进一步探讨DADS诱导人胃癌BGC 823 细胞周期G2/M期阻滞的可能机制。方法:RT-PCR 检测Chk1 和Chk2 在mRNA 水平的改变;Western blot检测DADS处理BGC 823 细胞前后细胞周期相关蛋白ATM-RAD3 相关基因（ATM-RAD3-related gene,ATR ）、细胞周期检查点蛋白激酶1（checkpoint kinase1,Chk1）、细胞周期检查点蛋白激酶2（checkpoint kinase2,Chk2）表达和ATR 、Chk1、Chk2 的磷酸化程度;免疫共沉淀检测Chk1、Chk2 与Cdc25C 结合情况。结果:RT-PCR 检测显示,Chk1 和Chk2 的mRNA 水平在处理组与未处理组之间无显著性差异（P>0.05）。 Western blot检测显示,总Chk1 和Chk2 蛋白表达在细胞处理前后均无明显改变,但15mg/LDADS刺激BGC 823 细胞2h 后,处理组细胞Chk1 磷酸化程度明显增加,并呈时间依赖性（P<0.05）,而Chk2 磷酸化程度在处理组与未处理组之间无显著性差异（P>0.05）。 15mg/L DADS 作用15～120min,ATR 磷酸化程度明显增加,呈时间依赖性（P<0.05）,而ATR 表达无改变。免疫共沉淀分析表明,DADS 能促进BGC 823 细胞Chk1 与Cdc25C 结合,而对Chk2 与Cdc25C 结合无影响。结论:DAD诱导人胃癌BGC 823 细胞G2/M期阻滞与Chk1 的活化有关,DADS可能是通过激活ATR 、Chk1,调节Cdc25C 的表达引起人胃癌BGC 823 细胞G2/M期阻滞。      

三氧化二砷对胃癌BGC-823细胞增殖及细胞周期的影响

[目的]探讨三氧化二砷（AS2O3）对胃癌BGC-823细胞增殖的抑制作用及对细胞周期的影响。[方法]应用MTT方法检测三氧化二砷对胃癌BGC-823细胞增殖的抑制作用，流式细胞仪进行细胞周期解析及凋亡检测．[结果]三氧化二砷对胃癌BGC823细胞具有杀伤作用，且呈时间-浓度依赖性抑制肿瘤细胞的增殖．72h抑制细胞50％增殖的药物浓度约为3．3μmol／L，与对照组比差异显著（P=0．0048）；5μmol／LAs2O3作用24h，细胞形态学可见典型的凋亡细胞及M期阻滞；流式细胞仪进行细胞周期解析结果提示，G2/M期细胞由正常对照的25％增加到46．3％，出现了明显的G2/M期阻滞，亚二倍体凋亡细胞由4％增加到18％。[结论]三氧化二砷抑制胃癌细胞的增殖．诱导细胞周期阻滞及凋亡。     

p38通路在二烯丙基二硫诱导人胃癌MGC803细胞G2/M期阻滞中的作用

背景与目的:研究表明p38通路参与了细胞G2/M期阻滞过程的调控,但对其调控机制研究很少.本研究旨在探讨p38通路在二烯丙基二硫(diallyldisulfide,DADS)诱导人胃癌MGC803细胞G2/M期阻滞中的作用及其机制.方法:采用MTT法检测MGC803细胞的生长活性;流式细胞仪检测药物对细胞周期分布的影响;Western blot法检测药物对P38蛋白、磷酸化P38蛋白、Cdc25C蛋白的表达.结果:MTT法检测结果显示,P38特异性抑制剂SB203580可拮抗DADS对MGC803细胞的抑制增殖作用.流式细胞仪分析表明,30 mg/L的DADS处理MGC803细胞24 h后,G2/M期的比率为39.4%,高于对照组的9.3%(P＜0.05);但用SB203580抑制P38的活性后,DADS诱导的G2/M期比率从39.4%降到21.2%(P＜0.05).Western blot结果表明,DADS处理MGC803细胞后,p38通路快速激活,磷酸化P38的表达与对照组相比,在20 min内升高3.52倍,而P38总蛋白量没有发生明显改变;DADS作用24 h后,Cdc25C磷酸酶表达降低了62%,而用SB203580抑制剂后,DADS对Cdc25C的抑制作用可以部分逆转(P＜0.05).结论:DADS可能通过激活p38通路使部分MGC803细胞停滞在G2/M期,p38通路调节Cdc25C磷酸酶的表达在DADS诱导MGC803细胞G2/M期阻滞中起着重要作用.     

大蒜素对人胃癌细胞株SGC-7901和BGC-823生长的影响

目的：研究大蒜素对人胃癌细胞株SGC-7901、BGC-823增殖抑制作用及对细胞周期的影响。方法：传代培养人胃癌细胞，MTT法测定细胞增殖抑制率并测定药物半数抑制率（IC50）；流式细胞仪检测细胞周期的改变。结果：大蒜素对SGC-7901和BGC-823两种细胞的生长均有明显的抑制作用，且呈浓度依赖性，72h IC50分别为20和30μg／mL；以72h IC50浓度大蒜素分别作用于两种胃癌细胞株24、48h后，流式细胞检测与对照组比G0／G1期细胞减少，G2／M期细胞明显增加，P〈0．01。提示两种胃癌细胞株经大蒜素处理后．细胞周期阻滞于G2／M期。结论：大蒜素可使人胃癌细胞株SGC-7901和BGC-823细胞的增殖明显受到抑制；细胞周期被阻滞在G2／M期。     

大蒜素对人胃癌细胞BGC823 cyclin D1和p27Kip1表达的影响

背景与目的：在研究大蒜素抑制人胃癌细胞BGC823恶性增殖,将其阻滞于G1期并诱导BGC823细胞凋亡的分子机制及其靶基因过程中,我们发现cvclin D1和p27^Kip1。蛋白在G1期阻滞中起重要作用。本实验从mRNA和蛋白水平探讨大蒜素对人胃癌细胞BGC823 cvclin D1和p27^Kip1表达水平的影响。方法：用25μg／ml大蒜素处理BGC823细胞,并分别提取对照组和大蒜素处理组的总RNA和总蛋白,然后采用RT-PCR和Western blot法检测大蒜素处理前后cvclin D1和p27^Kip1 mRNA和蛋白的变化。结果：经25μg／ml大蒜素处理BGC823细胞24h,cyclin D1蛋白表达下调,p27^Kip1蛋白表达上调,处理48h,上述变化更明显。而mRNA水平未见明显改变。结论：大蒜素可影响cyclin D1和p27^Kip1蛋白的表达,而不影响mRNA的转录。     

三氧化二砷对胃癌BGC-823细胞增殖及细胞周期的影响

[目的]探讨三氧化二砷（AS2O3）对胃癌BGC-823细胞增殖的抑制作用及对细胞周期的影响。[方法]应用MTT方法检测三氧化二砷对胃癌BGC-823细胞增殖的抑制作用，流式细胞仪进行细胞周期解析及凋亡检测．[结果]三氧化二砷对胃癌BGC823细胞具有杀伤作用，且呈时间-浓度依赖性抑制肿瘤细胞的增殖．72h抑制细胞50％增殖的药物浓度约为3．3μmol／L，与对照组比差异显著（P=0．0048）；5μmol／LAs2O3作用24h，细胞形态学可见典型的凋亡细胞及M期阻滞；流式细胞仪进行细胞周期解析结果提示，G2/M期细胞由正常对照的25％增加到46．3％，出现了明显的G2/M期阻滞，亚二倍体凋亡细胞由4％增加到18％。[结论]三氧化二砷抑制胃癌细胞的增殖．诱导细胞周期阻滞及凋亡。     

大蒜素对人胃癌细胞株SGC-7901和BGC-823生长的影响

目的:研究大蒜素对人胃癌细胞株 SGC 7901、BGC 823增殖抑制作用及对细胞周期 的影响。方法:传代培养人胃癌细胞,MTT法测 定细胞增殖抑制率并测定药物半数抑制率 (IC50);流式细胞仪检测细胞周期的改变。结果: 大蒜素对SGC 7901和BGC 823两种细胞的生长 均有明显的抑制作用,且呈浓度依赖性,72hIC50 分别为20和30μg/mL;以72hIC50浓度大蒜素 分别作用于两种胃癌细胞株24、48h后,流式细 胞检测与对照组比G0/G1期细胞减少,G2/M期 细胞明显增加,P<0.01。提示两种胃癌细胞株 经大蒜素处理后,细胞周期阻滞于G2/M期。结 论:大蒜素可使人胃癌细胞株SGC 7901和BGC 823细胞的增殖明显受到抑制;细胞周期被阻滞 在G2/M期。     

siRNA干扰Chk1抑制人胃癌BGC823细胞增殖的实验研究

背景与目的：细胞周期检测点激酶1（checkpoint kinase1,Chk1）与肿瘤的关系及其在肿瘤发生、发展及治疗中的作用是目前研究的热点。为探索Chk1在人类肿瘤细胞中对生长增殖活性和细胞周期的调控作用,本研究旨在观察siRNA干扰Chk1基因对人胃癌BGC823细胞生长及周期的影响。方法：采用RNAi技术抑制BGC823细胞中Chk1表达,采用Western blot检测转染前后Chk1蛋白表达情况,实验分为未转染组、脂质体组和Chk1siRNA转染组三组。然后采用MTT法和流式细胞术分析Chk1基因沉默对人胃癌BGC823细胞生长及周期的影响。结果：Western blot检测结果显示,Chk1siRNA转染24h后,BGC823细胞中Chk1蛋白相对灰度值为0.11&#177;0.08,明显弱于未转染对照组的0.66&#177;0.21和脂质体转染组的0.70&#177;0.25（P〈0.05）,而未转染对照组和脂质体转染组之间比较,差异无统计学意义（P〉0.05）。转染Chk1siRNA的BGC823细胞其Chk1蛋白表达量下降了83.1%。MTT法检测结果显示,Chk1蛋白表达缺失可导致BGC823细胞增殖活性下降,其增殖抑制率为48.1%（P〈0.05）。FCM法检测结果显示,Chk1基因沉默后细胞周期在G0/G1期发生停滞,未转染组24和48h后细胞在G0/G1期为48.3%和50.2%,转染Chk1siRNA组细胞在转染24和48h后G0/G1期增加至63.9%和66.1%,增殖指数（PI）由51.7%（24h）和49.8%（48h）减少至36.2%（24h）和34.4%（48h）。结论：Chk1siRNA转染可明显抑制人胃癌细胞增殖,且其抑制增殖作用与诱导G0/G1期阻滞有关。     

DHA 联合葫芦素B对人胃癌BGC -823细胞增殖及凋亡的影响

目的：研究二十二碳六烯酸（docosahexaenoicacid，DHA）联合葫芦素 B（cucurbitacin B）体外对人胃癌BGC -823细胞增殖及凋亡的影响。方法：利用 NADH 酶染色、吉姆萨染色显微镜下观察人胃癌 BGC -823细胞经 DHA 联合葫芦素 B 作用后细胞形态学上的变化。采用 MTT 法、流式细胞仪检测细胞增殖、周期及凋亡的情况。结果：根据 MTT 法 DHA 联合葫芦素 B 作用于胃癌细胞比分别利用 DHA、葫芦素 B 直接作用细胞增殖抑制更为明显，更有效降低细胞的存活率，且在相同时间随着药物浓度的提高，作用效果也随之提高。NADH 酶染色法、吉姆萨染色法在显微镜下明显可见细胞凋亡现象。流式细胞仪检测肿瘤细胞，药物联合干预 G0/ G1期细胞明显增多，G2/ M 期和 S 期细胞明显减少。结论：DHA 联合葫芦素 B 可抑制人胃癌 BGC -823细胞增殖、诱导细胞凋亡，其联合具有协同作用。     

细胞周期素D1反义寡核苷酸对胃癌细胞株BGC—823的作用

目的：通过基因反义封闭技术体外抑制细胞周期素D1(cyclin D1)的表达，并对胃癌细胞增殖的影响。方法：以胃腺癌BGC-823细胞株为研究对象，采用硫代修饰的cyclin D1反义寡脱氧核苷酸(ASODN)处理BGC-823细胞后，观察cyclin D1 ASODN对BGC-823细胞基因表达及体外增殖活性的影响。结果：MTT法测细胞增殖活性见不同浓度ASODN均能抑制BGC-823细胞增殖，抑制作用在48小时最强。RT-PCR检测结果cyclin D1 mRNA减少。免疫组化S-P法结果cyclin D1蛋白表达明显降低。结论：使用人工合成的cyclin D1 ASODN可以特异性的抑制胃腺癌BGC-823细胞株cyclin D1的表达，从而调控细胞周期，抑制细胞增殖。     

奥曲肽对人胃癌BGC-823细胞增殖和凋亡影响的研究

目的：研究生长抑素类似物奥曲肽（octreotide,OCT）对胃癌BGC-823细胞增殖、凋亡、细胞周期的影响及其可能的作用机制。方法：不同浓度的OCT作用于体外培养的人胃癌BGC-823细胞,以5～FU作为阳性对照,应用M1Tr法分析细胞增殖的抑制作用,流式细胞仪测定细胞周期分布和凋亡率,AO—EB染色观察细胞形态变化。结果：OCT对BGC-823细胞的生长、增殖产生抑制作用,该抑制作用具有量效、时效关系和饱和性;OCT作用后细胞呈典型的凋亡形态学改变,流式细胞仪检测的细胞凋亡率和AO—EB染色测得细胞凋亡率与对照组相比较差异有显著性（P〈0．05）;BGC-823细胞经OCT作用后,G1期细胞数明显增加,S细胞数明显减少,细胞被阻滞于G1／S期。结论：10^-5-10^-3g/L浓度的OCT能够抑制胃癌BGC-823细胞增殖,机制可能与其诱导肿瘤细胞的凋亡和出现G1／S期阻滞有关。     

西妥昔单抗增强放疗对人胃癌细胞株MGC803及BGC823的作用及其机制

目的 观察西妥昔单抗（C225）联合放疗对人胃癌细胞株MGC803及BGC823增殖的影响,并探讨其机制。方法 （1）采用MTT法观察C225联合放疗对细胞生长增殖的影响,评价两者联合效应;（2）采用FCM检测C225联合放疗对细胞周期分布及细胞凋亡的影响;（3）通过Western blot法检测C225联合放疗对EGFR细胞信号蛋白及其下游信号蛋白AKT、MAPK磷酸化的影响。结果 （1）当C225联合三种不同剂量放疗时,均可显著抑制细胞的增殖,两者具有协同作用。（2）单用C225可使细胞阻滞于G0/G1期,并减少S期细胞比例。在C225作用后,G0/G1期及S期MGC803细胞比例分别为67.3％及24.8％,BGC823细胞则分别为71.9％及18.8％。单用放疗可使细胞阻滞于G2/M期。在放疗作用于MGC803细胞及BGC823细胞后,G2/M期比例分别为18.2％及19.5％。当C225与放疗联合作用时,G2/M期MGC803细胞及BGC823细胞比例进一步升高,分别为25.7％及26.4％,而S期细胞比例进一步下降,分别为18.6％及13.5％。（3）在C225处理后MGC803细胞及BGC823细胞的凋亡率分别为4.9％及9.9％,放疗处理后MGC803细胞及BGC823细胞的凋亡率分别为11.7％及19.8％,与对照组相比差异均具有统计学意义。当C225与放疗联合作用时,MGC803细胞及BGC823细胞的凋亡率分别为20.1％及47.3％,与单用放疗组相比差异均具有统计学意义。（4）C225与放疗联合应用时,可使细胞EGFR信号蛋白表达下降,并能使其下游信号蛋白AKT、MAPK磷酸化活性降低。结论 （1）西妥昔单抗可增强放疗对MGC803和BGC823细胞株的生长抑制作用;（2）其增敏作用的机制可能与抑制EGFR信号转导通路、诱导细胞周期阻滞和细胞凋亡增加等有关。     

熊果酸诱导人胃癌BGC823细胞凋亡及其作用机制初探

背景与目的：熊果酸（ursolic acid,UA）广泛存在于夏枯草、白花蛇舌草等清热解毒药中,可抑制多种肿瘤细胞增殖并诱导其凋亡,具有广泛生物学活性。本研究将UA作用于人胃癌BGC823细胞,观察其对细胞凋亡的影响,并探讨其可能的作用机制。方法：MTT法检测UA对BGC823细胞增殖的影响;流式细胞术检测细胞周期与凋亡的变化;Realtime-PCR检测细胞bax、bcl-2mRNA表达的变化。结果：UA呈时间-剂量依赖性抑制BGC823细胞增殖,分别作用24、48、72h后半数抑制浓度依次为36.88、34.72、32.18μmol/L;UA能诱导BGC823细胞凋亡,并阻滞细胞于G2/M期;此外,其还可上调BGC823细胞bax及下调bc1-2mRNA表达,且作用随剂量的增加而加强。结论：UA呈时间-剂量依赖性抑制BGC823细胞增殖,并诱导其凋亡,阻滞细胞于G2/M期;其凋亡机制可能与上调bax及下调bcl-2基因的表达有关。     

幽门螺杆菌L型感染对胃癌BGC-823细胞增殖的影响

目的：研究幽门螺杆菌L型（helicobacter pyloriL—form,Hp—L型）感染对胃癌BGC-823细胞增殖的影响,并探讨其作用机制。方法：将胃癌BGC-823细胞与Hp—L型以不同比例（1：20、1：100、1：500）共培养,以不加Hp—L型为对照组,在不同时段进行以下实验：倒置显微镜观察细胞形态学变化;四甲基噻唑氮蓝（MTT）法检测细胞生长增殖率;流式细胞仪（FCM）检测细胞凋亡率;免疫组化（SP法）检测癌基因（skp2）、抑癌基因（p53）和核增殖指数（Ki-67）的表达情况。结果：Hp—L型作用BGC-823细胞后,倒置显微镜观察到细胞分裂增多,增殖旺盛,瘤巨细胞增多,出现明显的生长加速现象;MTT法测定细胞生长曲线显示,Hp—L型对胃癌BGC-823细胞增殖有促进作用;FCM检测可见,lip—L型影响胃癌BGC-823细胞周期的分布,使G0／G1期比例降低,S期比例升高;免疫组化可见细胞中Skp2、p53和Ki-67蛋白表达阳性率逐渐增加;以上作用均呈细菌浓度和作用时间依赖性。结论：Hp—L型可促进胃癌BGC-823细胞增殖,其机制与上调skp2、p53和Ki-67蛋白的表达有关。     

Bcl-2反义寡核苷酸诱导胃癌细胞凋亡的研究

目的　探讨反义寡核苷酸（ＡＳＯＤＮ） 对ｂｃｌ２ 基因的表达调控及诱导胃癌细胞凋亡的作用。方法　应用ＭＴＴ方法比较两条人工合成的ＡＳＯＤＮ 直接作用及其以脂质体（ＤＯＴＡＰ） 为载体对胃癌细胞的抑制效果。应用流式细胞术和ＲＴＰＣＲ 方法检测ＡＳＯＤＮ 对ｂｃｌ２ 蛋白和ｍＲＮＡ 表达量的调控。应用相差显微镜、电子显微镜、流式细胞术等方法,观察ｂｃｌ２ ＡＳＯＤＮ 诱导ＢＧＣ８２３ 胃癌细胞凋亡的效果。结果　ＭＴＴ实验显示两条ＡＳＯＤＮ 抑制胃癌细胞增殖的作用呈浓度和时间依赖性,且靶位点于ｍＲＮＡ蛋白编码区（ＡＳＯＤＮ２） 和以ＤＯＴＡＰ 为载体的ＡＳＯＤＮ 对胃癌细胞的增殖抑制效果为佳。ＡＳＯＤＮ作用于胃癌细胞,降低ｂｃｌ２ 蛋白和ｍＲＮＡ 表达。ｂｃｌ２ ＡＳＯＤＮ处理胃癌细胞,观察到肿瘤细胞缩小、凋亡小体出现、染色质浓缩、凋亡峰等凋亡特征性改变。结论　ｂｃｌ２ ＡＳＯＤＮ可降低ｂｃｌ２ ｍＲＮＡ和蛋白表达,诱导胃癌细胞凋亡     

过表达KLF4通过Wnt/β-catenin信号通路抑制胃癌细胞EMT和细胞周期的实验研究

目的:探讨过表达KLF4通过Wnt/β-catenin信号通路抑制胃癌细胞上皮-间质转化和细胞周期的作用机制。方法:将课题组前期已成功转染过表达KLF4的BGC-823细胞分为KLF4过表达载体组(BGC823-OE组)、空病毒载体组(BGC823-NC组)和未经处理的BGC-823细胞组（BGC823-Ctrl组）。Western blot和qRT-PCR检测KLF4、EMT和Wnt信号通路相关蛋白和mRNA在三组细胞中的表达水平。CCK-8实验、划痕实验、Transwell迁移实验、平板克隆实验和流式细胞术观察各组细胞的增殖能力、迁移能力、克隆形成能力和细胞周期变化情况。结果:Western blot和qRT-PCR实验结果显示BGC823-OE组KLF4蛋白和mRNA表达水平明显升高。上皮-间质转化的上皮标志物E-cadherin蛋白和mRNA表达水平升高,间质标志物N-cadherin蛋白和mRNA表达水平降低。Wnt信号通路下游靶基因β-catenin和Cyclin D1的蛋白和mRNA表达水平降低。CCK-8增殖实验结果显示BGC823-OE组的增殖能力下降。划痕实验和Transwell迁移实验结果显示BGC823-OE组的迁移能力下降。平板克隆结果显示BGC823-OE组的克隆能力下降。流式细胞术结果显示BGC823-OE组G0/G1期比例增高,S期比例降低。结论:过表达KLF4可能通过Wnt/β-catenin信号通路抑制胃癌细胞EMT及阻滞胃癌细胞的细胞周期。