积雪草苷通过抑制NF-κB核转移影响糖尿病大鼠血管平滑肌细胞增殖

目的：观察积雪草苷是否通过抑制核因子-κB（NF-κB）核转移而影响糖尿病大鼠血管平滑肌细胞（VSMC）增殖。方法：通过连续喂养高脂饮食8w后一次性腹腔注射链脲佐菌素40mg.kg^-1建立2型糖尿病大鼠模型,取模型成功大鼠胸主动脉中膜血管平滑肌细胞进行培养,倒置显微镜下观察细胞形态,SMA免疫组化染色鉴定细胞后给予40、80、160、320μg·ml^-1积雪草苷干预,计数法描绘血管平滑肌细胞生长曲线,共聚焦显微镜下观察积雪草苷对NF-κB核转移影响,CCK-8法测定积雪草苷IC50。结果：与正常组对比,糖尿病组VSMC生长速度快;同模型组比较,积雪草苷40μg.ml-1以上剂量组能明显抑制糖尿病VSMC中NF-κB从胞浆转移到胞核。积雪草苷抑制糖尿病血管平滑肌细胞增殖IC50为209.26μg·ml^-1。结论：积雪草苷抑制糖尿病VSMC增殖可能与NF-κB核转移有关。     

小檗碱对糖尿病大鼠肠系膜血管形态改变的作用

目的:观察小檗碱对糖尿病大鼠肠系膜血管病变的干预作用。方法:24只SD大鼠随机分为对照组、模型组和小檗碱组,每组8只。模型组和小檗碱组腹腔注射链脲佐菌素(STZ,55mg/kg)制备糖尿病大鼠模型,对照组腹腔注射等量生理盐水。大鼠成模两周后,小檗碱组灌胃给予小檗碱(200mg/kg),对照组和模型组灌胃等量双蒸水,三组均每日一次,连续2周,比较各组体重及血糖变化。之后处死各组大鼠,取其肠系膜、各级血管及其周围组织制备石蜡切片,HE染色,显微镜观察各组大鼠肠系膜各级血管管径及血管和周围组织的病理学变化。结果:与对照组比较,模型组大鼠实验28天后体重减轻(P<0.01),血糖升高(P<0.01)。二、三级动静脉管径较对照组明显增大(P<0.05或P<0.01);血管弹性膜分层不清,内膜白细胞黏附增多;血管周围脂肪组织中脂肪细胞皱缩,大量炎性细胞浸润,神经节肿胀。小檗碱组较模型组体重、血糖无明显差异(P>0.05),但三级动脉管径和二级静脉管径较模型组明显收缩(P<0.05或P<0.01);而且小檗碱组较模型组血管弹性膜分层清晰,内膜白细胞黏附减少;脂肪细胞形态、炎性细胞浸润及神经节形态均有一定程度的改善。结论:小檗碱对糖尿病大鼠肠系膜小血管和微血管及周围组织的病理变化有一定改善作用。     

蛋白酶体抑制剂PSI对大鼠早期糖尿病肾病发病的作用

目的研究泛素蛋白酶体途径(UPP)对大鼠早期糖尿病肾病(DN)发病的可能作用机制及蛋白酶体抑制剂(PSI)对DN的治疗作用。方法用链脲佐菌素(STZ)诱导糖尿病模型后随机分为正常对照组(NC组)、糖尿病对照组(DC组)和PSI治疗组(DP组)。检查体质童、肾重、肾重指数、24 h尿微量白蛋白(24 h U-mAlb)、尿蛋白/尿肌酐比值(Up/Ucr)、肾纤维化情况、纤维连接蛋白(FN)mRNA表达及NF-κB和IκBα蛋白表达。结果在6、8周时,与NC组比较,DC组的体质童明显降低(P<0.05),肾重、肾肥大指数(肾重/体质童)、24 h尿量、Up/Ucr、24 h U-mAlb、空腹血糖、FN mRNA均显著性增加(P<0.05,P<0.01)。与DC组相比,DP组体质童明显增加(P<0.05);肾重、Up/Ucr和24 h U-mAlb、FN mRNA均显著性降低(P<0.05);肾重/体质童、24 h尿量、空腹血糖均有所降低,差异无统计学意义(P>0.05)。Western blot结果显示,与NC组比较,DC组胞浆NF-κB P65蛋白表达显著降低(P<0.05),胞核NF-κB P65蛋白表达增高(P<0.05),而DP组经治疗后与DC组呈现相反改变;与NC组比较,DC组IκBα蛋白表达明显降低(P<0.05),而PSI干预的DP组表达明显高于DC组(P<0.05)。光镜下,6周时,各模型组肾小管轻度扩展,间质无明显增生;8周时,DC组肾小球增大,毛细血管充血,肾小管肿胀,未见明显纤维化改变,DP组以上改变较DC组轻。结论 UPP通过对NF-κB信号通路的泛素化调节从而参与早期DN发生;蛋白酶体抑制剂PSI能改善早期DN,理论上可部分治疗DN。     

小檗碱对糖尿病肾病大鼠C反应蛋白的影响

目的:观察小檗碱对糖尿病肾病大鼠C反应蛋白的影响。方法:将48只雄性SD大鼠随机分为空白对照组、模型组、小檗碱75、150及300mg.kg-1组、罗格列酮组六组,每组8只。除正常对照组外,其余各组大鼠腹腔注射链脲佐菌素(STZ,55mg.kg-1),成功造模后小檗碱各组及罗格列酮组分别灌胃给予75、150、300mg.kg-1小檗碱以及4mg.kg-1罗格列酮,连续6w后检测大鼠血糖、体重,HE染色检测肾脏病理改变,ELISA法检测C反应蛋白活性。结果:与正常对照组相比,糖尿病组血糖与C反应蛋白活性明显升高(P<0.05),与模型组比较,小檗碱各组血糖与C反应蛋白活性明显降低(P<0.05),有统计学意义。结论:小檗碱可降低糖尿病大鼠血糖和C反应蛋白,减轻糖尿病肾病。     

瘦素促进低氧状态下大鼠气道平滑肌细胞增殖及HIF-1α、NF-κB表达

目的研究瘦素对低氧状态下大鼠气道平滑肌细胞(ASMC)增殖及缺氧诱导因子1α(HIF-1α)、核因子-κB(NF-κB)表达的影响。方法分常氧、低氧2种状态体外培养大鼠ASMC,按随机数字表法将低氧组细胞分为低氧组、50μg/L瘦素联合低氧组(L50组)、100μg/L瘦素联合低氧组(L100组)、200μg/L瘦素联合低氧组(L200组)、200μg/L瘦素联合低氧和瘦素受体抗体组(ob-R抗体组)。各组均孵育24 h,CCK-8法检测细胞增殖率,反转录PCR检测HIF-1α、NF-κB的mRNA的表达,Western blot法检测HIF-1α、NF-κB的蛋白表达。结果与常氧组相比,各低氧组细胞增殖活性明显增强;与低氧组相比,L50、L100、L200组细胞增殖活性增强,并与浓度呈正相关(r=0.992);与L50、L100、L200组相比,ob-R抗体组细胞增殖明显降低。与常氧组相比,各低氧组HIF-1α、NF-κB的mRNA及蛋白表达增加;与低氧组相比,L50、L100、L200组HIF-1α、NF-κB的mRNA及蛋白表达增加,并与浓度呈正相关;与L50、L100、L200组相比,ob-R抗体组HIF-1α、NF-κB的mRNA及蛋白表达降低。结论瘦素能促进低氧状态下ASMC增殖,并且能够促进HIF-1α、NF-κB的表达。     

小檗碱对淋巴细胞与血管内皮细胞粘附及粘附分子的影响

目的：通过研究小檗碱对淋巴细胞与血管内皮细胞粘附及粘附分子的影响,探讨小檗碱免疫抑制作用机制。方法：以小檗碱处理人淋巴细胞或人脐静脉内皮细胞（ＨＵＶＥＣ）后,用蛋白染料染色法研究对淋巴细胞与内皮细胞粘附的作用,用细胞ＥＬＩＳＡ,免疫细胞化学染色法研究对细胞表面粘附分子表达的影响。结果：小檗碱能抑制静息的及ＩＬ－１,ＴＮＦ激活的内皮细胞与淋巴细胞间的粘附,其主要分子机制为下调内皮细胞表面粘附分子ＩＣ     

核转录因子-κB在糖尿病大鼠正中隆起室管膜细胞的表达

目的:观察核转录因子κB(NF-κB)在糖尿病大鼠不同时期正中隆起室管膜细胞的表达差异.方法:免疫组织化学观察NF-κB在2、4、8、11周的糖尿病大鼠及正常大鼠正中隆起处细胞内的表达情况.结果:NF-κB在2周组阳性表达水平最高,与正常对照组、4周、8周、11周比较差异有统计学意义;4周、8周组表达水平下降,但与11周、正常对照组比较差异有统计学意义;11周与正常组织之间无差异.结论:糖尿病时正中隆起处NF-κB阳性表达不同时期有差异,提示正中隆起作为敏感部位在糖尿病早期时,该处的NF-κB就被激活,参与了神经内分泌及神经免疫调节.     

盐酸青藤碱对实验性自身免疫性脑脊髓炎大鼠脑内核转录因子-κB活性的作用

目的研究青藤碱的免疫抑制作用是否与核因子-κB的活性有关。方法以实验性自身免疫性脑脊髓炎大鼠为免疫异常模型，观察青藤碱对其临床表现和病理特点的改变，检测了脑组织中核转录因子-κB的活性及血浆中皮质醇、泌乳素水平的改变。结果青藤碱可降低EAE大鼠临床评分，改善病理变化，抑制脑组织中核转录因子-κB活性，增加血浆中皮质醇水平，降低血浆泌乳素水平。结论青藤碱的免疫抑制作用与抑制脑组织核因子-κB活性有关，其对核因子-κB活性的抑制作用可能与增加皮质醇分泌、抑制泌乳素分泌有关。     

磷脂酰肌醇3激酶对TNF-α诱导的大鼠气道平滑肌细胞增殖、凋亡和转化生长因子β1表达的影响

目的 探讨磷脂酰肌醇3激酶（PI3-K）对TNF-α诱导的大鼠气道平滑肌细胞（ASMC）增殖、凋亡和转化生长因子β1（TGF-β1）表达的影响.方法 以肿瘤坏死因子-α（TNF-α）及PI3-K特异性抑制剂wortmannin作为工具药,分别将TNF-α、TNF-α＋wortmannin接种ASMC,置37℃,5%CO2培养箱中培养.逆转录聚合酶链式反应（RT-PCR）检测PI3-Kp85α、TGF-β1 mRNA表达,免疫细胞化学染色法检测PI3-Kp85α、PCNA、Bcl-2蛋白表达及定位,Sandwich ELISA检测NF-κB活性,四甲基偶氮唑蓝（MTT）微量比色法测定ASMC增殖,AnnexinV/PI双标记流式细胞仪分析法检测细胞凋亡,ELISA测定TGF-β1蛋白质含量.结果 （1）培养的ASMC PI3-K p85α的阳性定位在胞浆.TNF-α组ASMC PI3-Kp85α mRNA及蛋白表达水平均显著高于对照组及TNF-α＋wortmannin组（P＜0.01）;（2）TNF-α组ASMCNF-κB活性与对照组相比显著增高（P＜0.01）,TNF-α＋wortmannin组NF-κB活性与TNF-α组相比显著降低（P＜0.01）;（3）TNF-α组ASMC的增殖反应与对照组及TNF-α＋wortmannin组相比显著增加（P＜0.01）;TNF-α组细胞凋亡率与对照组相比差异无统计学意义（P＞0.05）,TNF-α＋wortmannin组细胞凋亡率显著高于TNF-α组及对照组（P＜0.01）.（4）TNF-α组ASMC的PCNA、Bcl-2蛋白表达量均显著高于对照组及TNF-α＋wortmannin组（P＜0.01）;（5）TNF-α组ASMC的TGF-β1的mRNA表达水平、培养液上清TGF-β1的蛋白质含量均显著高于对照组及TNF-α＋wortmannin组（P＜0.01）.结论 PI3-K可能参与调控TNF-α诱导的大鼠气道平滑肌细胞的增殖、凋亡及TGF-β1的表达和分泌,NF-κB作为PI3-K的下游信号参与此过程.     

糖尿病大鼠肾小管骨调素表达上调

目的观察骨调素(OPN)在糖尿病(DM)大鼠肾小管的表达,探讨其与血管紧张素Ⅱ(AngⅡ)、核转录因子-κB(NF-κB)及肾损害之间的关系。方法雄性SD大鼠70只,注射链尿佐菌素(STZ)诱导DM,随机分为5组,每组分别设鼠龄匹配的对照组。免疫组化检测肾小管OPN、AngⅡ、NF-κB及纤连蛋白(FN)的表达;Western blot检测肾皮质OPN和I-κB蛋白水平;生化测定血糖、血肌酐及24h尿蛋白量;光镜观察肾组织形态。结果DM大鼠肾小管AngⅡ和NF-κB表达从第3天、OPN从第7天、FN从第2周开始随病程发展而增多;肾皮质I-κB从第3天开始减少;4周时,OPN与AngⅡ、NF-κB、FN及蛋白尿呈显著正相关。结论DM大鼠肾小管OPN表达增加可能受AngⅡ和NF-κB调控,并参与肾小管间质病变的发病机制。     

大黄素对人血管平滑肌细胞增殖的影响

目的 观察大黄素对人血管平滑肌细胞周期时相和cyclin D1表达的影响,探讨大黄素抑制平滑肌细胞增殖的作用机制。方法 取对数增长期的平滑肌细胞同步于G0期,药物组:加入含37.5mg·L-1大黄素10％胎牛血清的培养液,对照组:仅加入10％胎牛血清的培养液;作用12、24、36、48 h后分别用流式细胞仪和Westemblot法进行细胞周期时相和cyclin D1表达的测定。结果 与对照组比较,药物组在各相同时间点C0/G1期细胞百分比升高,S期细胞百分比下降,且随着时间的延长差值增大,cyclin D1表达高峰延迟,表达量下调,细胞周期受阻于G0/G1期。结论 大黄素在抑制平滑肌细胞增殖的过程中通过下调,cyclin D1表达,从而阻滞细胞周期进程。     

RNA interference targeting ORC1 gene suppresses the proliferation of vascular smooth muscle cells in rats

Background

The proliferation of vascular smooth muscle cells (VSMCs) plays an important role in the pathogenesis of vascular diseases such as atherosclerosis and postangioplasty restenosis. The largest subunit of the origin recognition complex (ORC), ORC1, plays a critical role during the initiation of DNA replication in eukaryotes. However, the involvement of ORC1 in the initiation of DNA replication in VSMCs has not been studied yet.

Objective

The aim of this study was to silence ORC1 gene selectively by using RNA interference and analyze the effects of ORC1 gene on the proliferation and apoptosis of rat VSMCs.

Methods

Freshly isolated rat VSMCs were transfected with siRNA targeting ORC1 gene capsulated in liposome. ORC1 protein expression was determined by Western blotting and ORC1 mRNA level by RT-PCR. DNA synthesis was analyzed by ³H thymidine (³H-TdR) incorporation and cell proliferative activity and cell cycle distribution by flow cytometry. Two apoptosis-related proteins, Bax and Bcl-2, were examined immunohistochemically.

Results

Down-regulation of ORC1 mRNA and protein expression was observed in rat VSMCs at 24 h after transfection with the three pairs of siRNA targeting ORC1 gene and this reduction persisted at least 7 days post-transfection. Down-regulation of ORC1 mRNA (60%) and protein (80%) expression was observed at 72 h post-transfection in the cells transfected with B-ORC1 siRNA. A significant decrease in ³H thymidine incorporation was observed in rat VSMCs with ORC1 gene silencing after serum challenge, but not in the non-silenced control. A significant increase in the proliferation index and a significant decrease in the percentage of cells at G₀/G₁ phase after serum challenge were observed in the non-silenced control, but not in ORC1 gene silenced cells. A significant increase in the ratio of Bcl-2/Bax was observed after serum challenge in the non-silenced control, but only a slight increase was found in the ORC1 gene silenced cells. ORC1 gene silencing disappeared 7 days after transfection. Continuous serum challenge stimulated VSMCs to synchronously reenter the cell cycle as evidenced by increases in [³H] thymidine incorporation, the proliferation index, and the ratio of Bcl-2/Bax, as non-silenced cells were induced to resume cell cycle progression by the addition of 15% fetal bovine serum to the culture medium.

Conclusion

ORC1 gene silencing causes rat VSMCs to enter a reversible G₀ quiescent, growth arrested state; thus, ORC1 gene may be an important new target for suppressing VSMCs proliferation.     

尼古丁对大鼠血管平滑肌细胞增殖和凋亡的影响

目的 探讨尼古丁对大鼠胸主动脉血管平滑肌细胞(VSMCs)增殖和凋亡的影响.方法用终浓度为100 μmol/L的尼古丁作用于体外培养的大鼠VSMCs 24h,不加尼古丁的细胞作为对照组,应用荧光显微镜和扫描电子显微镜观察各组细胞凋亡的形态,BrdU-ELISA和流式细胞术检测各组细胞增殖和凋亡率,进而确定尼古丁对VSM...     

干扰素诱导蛋白p204表达变化对大鼠血管平滑肌细胞增殖及p21表达的影响

目的: 观察干扰素诱导蛋白p204对鼠血管平滑肌细胞(VSMCs)增殖及p21表达的影响,探讨p204在VSMCs增殖调控中的作用及可能机制。方法: 应用干扰素 α(IFN-α)处理和p204基因( Ifi204 )的小干扰RNA(siRNA)瞬时干预体外培养的VSMCs,用MTT法测定细胞活力反映细胞增殖,流式细胞仪分析细胞周期,用半定量RT-PCR 法和Western blotting 分别检测p204和p21的mRNA和蛋白表达。结果: IFN-α可诱导鼠VSMCs p204 mRNA和蛋白表达上调,降低VSMCs细胞活力和细胞周期G₁/S转换,伴p21 mRNA和蛋白表达上调。转染 Ifi204 siRNA可抑制p204和p21表达,提高VSMCs细胞活力和促进细胞周期G₁/S转换。结论: p204表达可抑制鼠VSMCs的增殖,该效应可能与激活p21表达有关。     

黄芪多糖对高糖所致血管平滑肌细胞增殖变化的影响

目的: 旨在观察体外高糖环境对大鼠主动脉血管平滑肌细胞(VSMCs)所致的增殖变化以及黄芪对其的影响。方法: 原代培养VSMC,分为正常对照组、25 mmol/L高糖剌激组、高糖剌激加低、中、高浓度黄芪多糖组(终浓度分别为100、200 和400 mg/L)。MTT方法分析细胞增殖率,RT-PCR检测分析MKP-1 mRNA转录及用ELISA法检测炎症因子MCP-1水平。结果: 与对照组相比高糖可以诱导VSMCs增殖(P<0.05),而中、高浓度黄芪多糖可以显著抑制该作用(P<0.05);高糖环境明显下调MKP-1 mRNA表达(P<0.05),但低浓度黄芪多糖可使MKP-1 mRNA上调,恢复到正常水平,在中、高浓度黄芪多糖时可使MKP-1 mRNA上调,显著高于对照组;高糖刺激组可促使VSMCs MCP-1分泌明显升高,低浓度黄芪即可降低高糖诱导MCP-1的水平(P<0.05),在高浓度组最明显。结论: 黄芪多糖防治糖尿病心血管并发症的作用可能与上调MKP-1 mRNA表达、抑制VSMCs增殖和MCP-1分泌相关。     

TSC-36/FRP inhibits vascular smooth muscle cell proliferation and migration

OBJECTIVE: In-stent restenosis is a vascular proliferation/migration disorder characterized by hyperplasia of vascular smooth muscle cells (VSMCs). Because mounting evidence suggests that the therapeutic potential of anti-proliferation and anti-migration therapy, we investigated possible inhibitory effects of the matricellular protein TGF-beta-stimulated clone 36 (TSC-36) on vascular smooth muscle cell proliferation and migration in vitro and in vivo. METHODS: Human umbilical artery smooth muscle cells (SMCs) were treated with inducting agents daidzein or estradiol. TSC-36 expression was detected by nested competitive PCR and in situ hybridization. TSC-36 was expressed in Origami (DE3) cells. The recombinant protein was used to immunize rabbits to produce polyclonal antibodies. VSMCs were treated with various concentrations of recombinant TSC-36 (rTSC-36) protein and daidzein. The MTT assay was used to analyze for cell proliferation. A transwell system was used to detect cell migration. Flow cytometry was used to detect cell phase. A rat carotid artery balloon injury model was duplicated. The rats were treated with daidzein or solvent control. Animals were sacrificed 5 weeks later, and injured arteries were taken for pathology and histology. RESULTS: TSC-36 mRNA and protein expression was induced in SMCs. Cell proliferation and migration were inhibited by rTSC-36. rTSC-36 caused accumulation of SMCs in G2 phase. The inducting agent daidzein decreased neo-intima proliferation. TSC-36 mRNA and protein expression was induced and expressed in the neo-intima. CONCLUSION: TSC-36 can be induced in VSMCs and inhibits VSMCs proliferation in vitro and in vivo.     

罗格列酮对胰岛素诱导的兔血管平滑肌细胞增殖的影响

目的：观察罗格列酮对胰岛素诱导的兔胸主动脉血管平滑肌细胞增殖的影响。方法:以组织块法原代培养兔胸主动脉血管平滑肌。采用细胞计数法测定细胞增殖，［3H］-TdR掺入法反映细胞DNA累积合成量。用RT-PCR方法测定蛋白激酶C mRNA含量。结果:罗格列酮对正常生长的细胞数目和掺入量无明显影响，与胰岛素组相比，1、5和10 μmol/L罗格列酮减少细胞数目分别为39.8%、46.9%和57.9%（P<0.01）；减少［3H］-TdR掺入量分别为29.6%、43.4%和53.8%（P<0.01）；对胰岛素诱导的a-PKC的表达上调无明显影响。结论:罗格列酮呈剂量依赖性抑制胰岛素诱导的平滑肌细胞的增殖。。     

分泌型hCREG蛋白抑制人血管平滑肌细胞增殖的量效关系研究

目的：探讨hCREG表达与人血管平滑肌细胞增殖的量效关系。方法： 构建强力霉素（Dox）调控表达的pRevTRE-hCREG重组载体；分别经G418及潮霉素筛选表达pRevTet-On、pRevTRE-hCREG的人血管平滑肌细胞株-HITASY细胞克隆；RT-PCR鉴定转染细胞克隆中抗性基因和插入基因的表达；Western blotting和免疫共沉淀检测不同浓度的强力霉素诱导后，HITASY细胞内及培养上清中hCREG的表达；流式细胞仪检测不同浓度的强力霉素诱导后，hCREG表达与细胞增殖的关系。结果：成功构建了强力霉素可调控表达的pRevTRE-hCREG重组载体；筛选出稳定表达双抗性基因的HITASY-hCREG细胞克隆；RT-PCR检测证实细胞克隆中G418及插入基因表达均为阳性；Western blotting及免疫共沉淀检测发现随强力霉素诱导剂量的增加(0、0.01、0.1、1 mg/L)，HITASY-hCREG细胞及培养上清中hCREG表达均呈剂量依赖性增加；流式细胞周期分析提示，hCREG表达增加后，HITASY-hCREG细胞的G1期细胞明显增加。结论： hCREG蛋白通过剂量依赖方式抑制人血管平滑肌细胞的增殖。