1480例疑似性病患者病原体荧光定量PCR检测分析

荧光定量PCR法(FQ-PCR)具有快速、简便、特异性和敏感性高等特点,近几年已经广泛应用于性病病原体的检测.我院2003年9月至2004年5月采用荧光定量PCR法检测1 480例疑似性病(STD)病原体,取得较好的效果,现报告分析如下.     

荧光定量PCR技术在结核分枝杆菌检测中的应用

目的探讨荧光定量PCR（FQ-PCR）技术在结核分枝杆菌检测中的应用价值。方法采用荧光定量PCR、抗酸染色和改良罗氏培养三种方法同时检测156例结核患者标本,对检测结果进行比较。结果荧光定量PCR、抗酸染色法、改良罗氏培养法检测结核分枝杆菌的阳性率分别为50%、25.64%、33.33%,以荧光定量PCR检测的阳性率最高。结论荧光定量PCR方法检测结核分枝杆菌具有灵敏度高、简便、快速的特点,可作为结核病诊断的常规方法,在临床上有重要应用价值。     

实时荧光定量PCR法检测淋病奈瑟菌感染的效果

①目的 应用实时荧光定量聚合酶链反应(FQ-PCR)技术准确定量检测临床标本中淋病奈瑟菌基因，同时与金标准—细菌培养法比较其灵敏度和特异度，为临床淋病的诊疗提供依据。②方法 采集l73例病人临床标本，以PE5700全自动PCR扩增分析仪和淋病奈瑟菌实时荧光定量PCR检测试剂盒进行核酸检测。同时，用含PolyViteX的巧克力板对淋病奈瑟菌进行分离，用ATB Expression自动细菌鉴定仪及配套的APINH进行鉴定。③结果 173份临床标本中，荧光定量PCR法示47例淋病奈瑟菌阳性，阳性率为27．2％；细菌培养法示41例淋病奈瑟菌阳性，阳性率为23．7％。与细菌培养法相比，荧光定量PCR法的灵敏度为100％，特异度为95．5％，两者的符合率为96．5％。④结论 荧光定量PCR技术具有简便、快捷、灵敏度高、特异度高、定量准确等优点，在临床检测淋病奈瑟菌中具有良好的应用前景。     

应用荧光定量PCR测定肝移植受者HBV-DNA

血清中乙肝病毒脱氧核糖核酸(HBV-DNA)的存在一直被认为是病毒复制的标志，且与传染性有关。以前主要应用聚合酶链反应(PCR)技术检测，但由于PCR只能定性，对病毒基因无法定量，且检测过程中染色剂溴乙锭具有较强的致癌作用且污染环境。随着分子诊断学的发展，新技术不断被开发，荧光定量PCR检测具有定量、高灵敏度、高速循环及高重复性等优点。本文采用荧光定量法和酶联免疫方法对7例肝移植患者进行术前、术后的血清HBV-DNA和乙肝标志物的检测，共95例次，以评价荧光定量PCR测定HBV-DNA在肝移植术中的……     

荧光定量PCR法在结核杆菌检测中的价值

目的探讨荧光定量PCR法检测技术在结核病诊断中的价值。方法采用荧光定量PCR法和抗酸染色法同时检测231例结核患者体液标本(121例痰标本、67例胸腹水及43例尿液标本),对检测结果进行比较。结果荧光定量PCR法的检测灵敏度为102Copy/ml,是抗酸染色法方法检测灵敏度100倍,且对除结核杆菌外的其他呼吸道病原体检测结果均为阴性。本研究痰标本、胸腹水标本及尿液标本的荧光定量PCR法阳性率均要高于抗酸染色法阳性率,比较差异均有显著性(﹤0.01)。结论荧光定量PCR方法检测结核杆菌具有特异性强、灵敏度高、简便、快速的特点,明显优于抗酸染色法,可作为结核病诊断的常规方法。     

结核分枝杆菌荧光定量PCR检测方法的建立与应用

目的建立结核分枝杆菌的荧光定量PCR检测方法，探讨荧光PCR检测痰标本中结核分枝杆菌的应用价值。方法根据结核分枝杆菌基因保守序列设计引物和探针，并构建标准品。对102例培养涂阳的结核痰液标本和45例非结核感染者的痰标本，应用荧光定量PCR法、痰涂片抗酸染色法检测结核分枝杆菌。结果荧光定量PCR、抗酸染色法检测结核分枝杆菌的特异性分别为100％、30％。结论荧光定量PCR是一种快速、敏感性高、特异性强的结核分枝杆菌辅助诊断方法，具有重要的应用价值。     

2.2.15细胞上清HBVDNA定量检测方法的比较

目的拟筛选和比较2．2．15细胞上清中HBVDNA定量检测的方法。方法分别采用3种方法抽提HBVDNA，抽提物分别采用Taqman荧光定量、SYBR荧光定量PCR技术检测其滴度。结果直接应用上清分别采取热变性，碱裂解法抽提HBVDNA均为阴性，而应用PEG沉淀后检测结果证实细胞上清中有高拷贝的分泌性HBVDNA，Taq man荧光定量方法的敏感性高于SYBR实时定量PCR，在高拷贝时，两种方法的检测结果一致。结论PEG沉淀法是2．2．15细胞上清HBVDNA提取的有效方法，Taq man荧光定量方法敏感性高，是HBVDNA定量检查的首选方法。SYBR法简便，经济，也可用于上清HBVDNA的检测。     

实时荧光定量PCR在生殖泌尿道疾病诊断中的应用

目的:探讨荧光定量PCR在生殖泌尿道疾病诊断中的应用。方法:采用FQ-PCR法对4160例泌尿生殖道感染疑似患者同时进行UU、CT、HSVⅡ型、NG和HPV检测。结果:5种性病病原体的感染率比较差异有统计学意义(P<0.01);另外男女的UU感染率比较差异有统计学意义(P<0.05),而CT感染率比较差异无统计学意义(P>0.05)。结论:荧光定量PCR技术检测常见性病病原体,具有简便、快捷、准确、特异性高等优点,对临床诊断治疗及流行病学调查有重要意义。     

广东地区SARS标本检测方法的对比研究

目的比较和评价严重急性呼吸综合征的检测方法。方法采用巢式RT-PCR和实时荧光定量PCR检测病人咽痰标本，采用ELISA方法检测血清IgG抗体，同时采用细胞培养技术对咽痰标本进行病毒分离，并对检测结果进行统计学分析。结果两种RT-PCR检测结果完全一致；巢式RT-PCR与荧光定量PCR检测比较，两种检测方法之间的吻合度较强，检测结果基本一致；比较PCR方法和ELISA方法检测病毒基因和IgG抗体，结果发现PCR方法与ELISA方法之间的吻合度很弱，两种方法对于临床诊断具有互补性；采用细胞培养(Vero-E6细胞株)方法，分离了13株SARS-CoV毒株。结论采用巢式RT-PCR和实时荧光定量PCR、ELISA IgG抗体检测和细胞培养技术对于SARS临床诊断、研究、预防和控制具有重要意义，目前的诊断技术已稳定可靠；但确诊周期过长，同时须防止标本污染和实验室污染。     

荧光定量PCR与免疫荧光法定量定性检测牛血清中呼肠孤病毒

目的采用TaqMan荧光探针定量PCR技术与免疫荧光技术定量定性检测牛血清中呼肠孤病毒。方法以携带有Reovirus保守系列的重组质粒作为标准品,优化定量PCR体系,建立标准曲线,用Vero细胞培养不同病毒评价方法的特异性;用FITC标记的抗Reovirus病毒蛋白单克隆抗体对感染不同滴度Reovirus的Vero细胞培养物进行直接免疫荧光检测,用Vero细胞培养不同病毒评价方法的特异性。结果 Taq Man Real-time PCR方法检测灵敏度可达1.0×102拷贝/l,线性范围为109～103;免疫荧光法对Reovirus检测具有很高的特异性。结论以TaqMan荧光探针检测Reovirus荧光定量PCR方法,灵敏度高、特异性强,辅以免疫荧光定性检测方法,可以作为牛血清感染Reovirus的定量和定性检测。     

荧光定量PCR检测不孕妇女生殖道沙眼衣原体和解脲支原体

目的调查深圳地区不孕妇女的生殖道沙眼衣原体（CT）和解脲支原体（UU）感染；比较荧光定量PCR法与UU培养或金标法检测CT的敏感性。方法219例不孕妇女患者取宫颈分泌物，用荧光定量PER法检测219例分泌物标本UU的DNA，同时对196例标本进行CT的DNA检测。另选68例正常体检女性作为对照组；同时采用支原体培养药敏试剂盒进行UU培养以及金标法检测CT，并对结果进行统计、分析。结果荧光定量PCR检出UU阳性率39．7％（87／219），CT阳性率44．9％（88／196），分别高于对照组（P〈0.05）。同时，培养法检出UU阳性率为29．7％，金标法检测CT阳性率为27％，与PER相比，P〈0.05。结论输卵管不孕妇女生殖道UU和CT检出率较高，荧光定量PCR具有敏感性高和特异性强的特点，对不孕患者CT和UU的诊疗具有实际意义。     

荧光定量PCR检测乙型肝炎患者血清中HBV DNA的临床意义

目的检测乙型肝炎患者血清中乙型肝炎病毒(HBV)DNA的含量,了解其与免疫学指标的关系。方法采用荧光定量PCR技术和ELISA法,分别检测287例乙型肝炎患者血清中HBVDNA含量和免疫学指标。结果287例乙型肝炎患者血清中检出HBVDNA199例,阳性率为69.34%(199/287);144例HBsAg、HBeAg、抗HBc三项阳性的血清,其血清中HBVDNA也全部阳性;而HBsAg、抗HBe、抗HBc三项阳性和HBsAg、抗HBc二项阳性的标本,HBVDNA的检出率分别38.9%(42/108)和37.1%(13/35)。结论乙型肝炎患者血清中HBVDNA的拷贝数与HBeAg密切相关,但系统转换不能说明HBV停止复制,而只是复制水平的降低而已。     

荧光定量PCR检测石蜡组织中结核杆菌的临床应用

目的探讨荧光定量聚合酶链反应（FQ—PCR）检测石蜡包埋组织结核分枝杆菌DNA（TB—DNA）在结核病诊断中的应用价值。方法33例石蜡包埋组织标本采用FQ—PCR技术检测TB—DNA,同时进行组织病理学检查,分别计算FQ—PCR和病理学检查的灵敏度和准确度。结果29例临床诊断为结核病的组织标本中,FQ—PCR检测阳性26例,病理学拟诊为结核阳性20例,4例临床诊断非结核病的标本中,FQ—PCR检测和病理学检查都为阴性,两者的灵敏度和准确度分别为89．66％、90．91％和68．97％、72．73％。结论FQ—PCR技术检测石蜡包埋组织的TB—DNA用于结核病的诊断具有较高的灵敏度和准确度,与病理学检查相结合可以大大提高结核病的检出率。     

实时荧光定量PCR检测乙型肝炎病毒DNA的临床应用价值

目的: 探讨实时荧光定量PCR(F Q-PCR)检测乙型肝炎病毒DNA的临床应用价值。方法: 采用FQ-PCR方法检测196例患者血清中HBV-DNA。结果: 112例HBeAg(+)/HBeAb(-)标本中FQ-PCR均阳性,HBV-DNA拷贝数1.08×107/ml;68例HBeAg(-)/HBeAb(+)标本中,平均拷贝数6.12×105/ml,其阳性率为66.2%;16例HBeAg(-)/HBeAb(-)标本中,平均拷贝数为2.72×104/ml。结论: 实时FQ-PCR可以实现准确定量,是了解HBV在体内复制和判断疗效的有利手段。     

孕妇血浆胎儿DNA定量分析在产前性别诊断中的应用

目的 探索一种早期、快速、非创伤性的围生期胎儿性别的诊断方法。方法 应用即时定量TagMan探针DNA扩增技术，检测6l例妊娠8～39周的正常孕妇游离在血浆内的无细胞胎儿DNA的SRY基因，并有针对性的对部分孕妇检测妊娠过程中及产后母体血浆中代表母体与胎儿DNA总和的β-珠蛋白基因和代表胎儿DNA的SRY基因的变化关系。结果 妊娠第8周可在母体外周血浆中检测出胎儿游离DNA，其数量随妊娠时间增加而增高；30例孕妇血浆中游离DNA检则SRY基因阳性，经证实均为男性胎儿，31例SRY基因阴性，经证实均为女性胎儿，符合率为100％，分娩6个月后，SRY基因基本从母体血浆中消失。结论即时定量TagMan探针DNA扩增技术，检测游离在孕妇血浆内的无细胞胎儿DNA，能早期鉴别胎儿性别，为早期诊断某些选择性遗传性疾病开拓了一条新的途径。     

血红蛋白和肝素对FQ-PCR检测HBV DNA结果的影响

目的探讨血红蛋白和肝素对荧光定量聚合酶链反应（FQ-PCR）定量检测乙型肝炎病毒核酸（HBVDNA）的影响。方法采用沉淀煮沸裂解法提取含不同浓度血红蛋白或肝素的血浆标本中的HBVDNA,应用FQ-PCR方法对HBVDNA进行定量检测。结果血浆标本中血红蛋白浓度〈37g/L或肝素浓度〈62.5U/ml时,对HBVDNA的定量结果无明显影响,但当肝素浓度达到125U/ml以上时,PCR反应明显受到抑制。结论对轻微的溶血和使用常规浓度肝素抗凝的血浆标本,可采用沉淀煮沸裂解法提取HBVDNA进行FQ-PCR定量检测。     

病毒性脑炎患者脑脊液肠道病毒和EV71检测与分析

目的 探讨肠道病毒和EV71所致脑炎的发病情况及荧光定量PCR诊断病毒性脑炎的意义.方法 收集银川市118例临床诊断病毒性脑炎、脑膜炎患者脑脊液和血清,用荧光定量PCR检测肠道病毒和EV71阳性率及病毒拷贝数,用间接酶联免疫吸附试验（ELISA）定性检测血清EV71病毒IgM抗体.结果 荧光定量PCR检测肠道病毒阳性病例42例,检测阳性率为35.6％;EV71阳性病例22例,检测阳性率为18.6％,占EV阳性病例的52.3％;ELISA定性检测EV71病毒IgM抗体,阳性病例30例,检测阳性率25.4％,肠道病毒和EV71病毒性脑炎患者6岁以内幼儿明显多见于其他年龄组.结论 肠道病毒是本地区病毒性脑炎、脑膜炎患者最常见的病原体,EV71可能是本地区肠道病毒性脑炎中最多见的一种,肠道病毒和EV71感染所致脑炎都以6以内幼儿为主;荧光定量PCR对EV71检测特异性高于ELISA.     

LAMP与FQ—PCR技术检测HBVDNA的特异性和灵敏度比较

目的 采用环介导等温扩增反应（Loop-mediated isothermal amplification,LAMP）技术与实时荧光定量 PCR（real-time fluorescent quantitative PCR,FQ-PCR）技术检测 HBV DNA,并对 LAMP 方法的反应条件进行优化,比较两种方法检测 HBV DNA 的灵敏度及特异性。方法 选取经医院确诊的乙肝患者的血清,提取血清中的 HBV DNA 作为扩增模板,同时,对 LAMP 方法的各种条件进行优化,并分别采用 LAMP 和 FQ-PCR 两种方法对同一 HBV DNA 模板做 10 倍梯度稀释的标本进行 HBV DNA 的检测,比较其灵敏度;且分别用两种方法对乳头瘤病毒（HPV）、EB 病毒、大肠埃希氏菌、金黄色葡萄球菌、鲍曼不动杆菌、铜绿假单胞菌以及正常人血清基因组 DNA 在相同条件下进行实验,观察两种方法在检测中是否出现假阳性结果,以确定两种方法的特异性。结果 对同一 HBV DNA 模板进行 10 倍梯度稀释后,FQ-PCR 技术在待测血清标本（2.38×107copy/ml）被稀释到 10-5,就难以进行准确检测了,而 LAMP 方法在待测血清标本被稀释到 10-7时,仍然能够获得较好的扩增结果;对 HPV、EB 病毒、大肠埃希氏菌、金黄色葡萄球菌、鲍曼不动杆菌、铜绿假单胞菌以及正常人血清基因组 DNA 进行 LAMP 和 FQ-PCR 检测,结果均为阴性。结论 采用 LAMP方法可以成功、快速、高效、特异的扩增 HBV DNA,与 FQ-PCR 方法比较,都能特异地检测 HBV DNA,但 LAMP 方法具有更高的灵敏性,操作更为简单、方便,而且不需要昂贵的仪器,更适合基层检测机构的推广使用。     

PCR-ELISA法及荧光定量PCR法检测HBV感染者精液HBV-DNA的探讨

目的探讨PCR-ELISA法及荧光定量PCR法（FQ-PCR）检测HBV感染者精液中HBV-DNA检出情况及其临床意义。方法选取男性HBV感染者60例,采集患者精液、静脉血,用PCR-ELISA法来检测患者精液及血清中HBV-DNA。同时采用荧光定量PCR检测患者精液中HBV-DNA。结果PCR-ELISA法：60例精液标本HBVDNA阳性12例,阳性率18.33%,拷贝数为1.267×10^3-6.532×10^5/ml,平均拷贝数为4.781×10^4/ml;60例血清标本阳性53例,阳性率为88.33%,拷贝数1.462×10^3-5.153×10^7/ml,平均拷贝数为2.451×10^6/ml。荧光定量PCR法：60例精液标本HBVDNA阳性13例,阳性率21.67%,拷贝数为1.357×10^3-7.113×10^5/ml,平均拷贝数为4.983×10^4/ml;两种检验方法检测精液HBV-DNA的阳性检出率比较无显著性意义（P〉0.05）。结论PCR-ELISA法与荧光定量PCR定量检测精液中HBVDNA同样具有较强的特异性和灵敏度,为临床了解乙型肝炎患者精液中肝炎病毒的感染状态提供了帮助,具有重要的临床意义。