下期发表论文摘要预报

灵芝真菌发酵生产灵芝多糖和灵芝酸方庆华 ,　钟建江*(华东理工大学生物反应器工程国家重点实验室 ,上海 2 0 0 2 37)　　摘要 :提出了灵芝真菌同时高效生产灵芝多糖和灵芝酸的发酵过程。在摇瓶中考察了氮源、接种量、起始糖浓度和装液量对灵芝细胞生长及灵芝多糖和灵芝酸生产的影响。结果表明酵母膏和蛋白胨复配作为氮源有利于细胞生长。接种量对细胞量有一定影响 ,但是对产物积累量影响更大。在50 g/L起始糖浓度下 ,细胞干重达到 1 6.7g/L,同时胞内多糖、胞外多糖和灵芝酸分别达 1 .1 9g/L,0 .854g/L和 2 1 2 .3mg/L。考察装液量发现 ,…     

灵芝真菌发酵胞外多糖反馈抑制的初步研究

探讨了灵芝胞外多糖自身反馈抑制作用。在摇瓶中考察了灵芝真菌发酵菌丝体生长、胞外多糖(EPS)和胞内多糖(IPS)合成的动态过程。在培养168h时，生物量达到最大值3．18g／L(干重)，培养216h时，胞外多糖达到最高浓度1．24g／L，EPS和生物量的变化趋势大致呈正相关。在摇瓶培养基中添加同源胞外多糖，以浓度梯度实验法考察培养基中的同源胞外多糖浓度对灵芝真菌发酵胞外多糖产量的影响，结果表明：培养基中添加的同源胞外多糖浓度高于0．59g/L时，EPS的产生受到明显抑制，其趋势是随着培养基中同源灵芝胞外多糖浓度的增加，反馈抑制作用逐渐增强，当培养基中添加的同源胞外多糖浓度高于2．34g/L时，菌丝的生长和胞外多糖的产生完全受到抑制。     

灵芝菌发酵培养基的优化及灵芝胞外多糖的分离纯化

用正交法研究了不同条件对灵芝菌生长影响,从中选出了灵芝 菌液体深层发酵的优化 培养基：葡萄糖 3.6%,蛋白胨 0.4%,pH 6.0,酵母膏 0.2%,KH2PO40.1%,MgSO 4· 7H2O 0.05%,Vit B1 0.005%,每升发酵液产干菌丝体 15.6 g,粗多糖 0.72 g。 经葡 聚糖凝胶层析对灵芝胞外多糖进行了分离纯化,共有 5 个组分,并用红外光谱、紫外光谱 ,气相色谱等手段进一步分析了灵芝胞外多糖的组成,结果表明灵芝胞外多糖系由甘露糖、 果糖、葡萄糖通过糖 β-D 糖苷键构成。     

HPLC法和UV-VIS法测定灵芝孢子粉中灵芝三萜及灵芝多糖的含量

目的建立测定灵芝孢子粉中的两个有效成分灵芝三萜及灵芝多糖含量的方法,为进一步开发和应用灵芝孢子粉提供依据。方法以灵芝酸C2为标准品,通过HPLC法对灵芝孢子粉中灵芝酸C2的含量进行测定。色谱条件为：检测波长254nm;流动相为甲醇：水=55∶45,各加1%冰醋酸;柱温40℃;流速0.7mL/min。以葡萄糖为标准品,采用硫酸-蒽酮比色法,通过UV-VIS法对灵芝孢子粉中灵芝多糖的含量进行测定。结果HPLC法测得三批灵芝孢子粉中灵芝酸C2含量约为0.129‰,0.108‰和0.094‰,灵芝酸C2在7.35～147μg/mL范围内,浓度与峰面积呈良好的线性关系,r=0.9999,回收率为95.9%,95.6%和96.4%。UV-VIS法测得三批灵芝孢子粉中灵芝多糖的含量约为1.152%,1.129%和1.007%,葡萄糖在14.9～119.1μg/mL的范围内,浓度和吸光度呈线性关系,r=0.9991,回收率为95.0%,95.1%和95.2%。结论方法简便、准确,可用于灵芝孢子粉中灵芝三萜和灵芝多糖的含量测定。     

灵芝多糖对B16F10黑素瘤细胞产生白介素10的影响

目的 探讨灵芝多糖对B16F10黑素瘤细胞产生白介素10(IL-10)的影响.方法 分别将不同浓度灵芝多糖作用于B16F10黑素瘤细胞,通过RT-PCR方法和蛋白印迹(Western-blot)技术检测IL-10的表达情况.结果 在不同浓度灵芝多糖作用下,经RT-PCR方法检测发现,加入0μg/mL、0.2μg/mL、0.8μg/mL、3.2μg/mL、12.8μg/mL灵芝多糖的B16F10黑素瘤细胞释放IL-10的量分别为1.03±0.15、1.15±0.25、0.92±0.11、0.86±0.64、0.75±0.12,与0μg/mL灵芝多糖组相比较,除0.2μg/mL灵芝多糖组,其他组差异均具有统计学意义,P<0.05.经Western-blot法检测,加入0μg/mL、0.2μg/mL、0.8μg/mL、3.2μg/mL、12.8μg/mL灵芝多糖的B16F10黑素瘤细胞IL-10表达量分别为1.47±0.43、1.58±0.31、0.93±0.12、0.89±0.26、0.40±0.29,与0μg/m L灵芝多糖组相比较,12.8μg/m L灵芝多糖组差异有统计学意义,P<0.05.结论 灵芝多糖对B16F10黑素瘤细胞产生IL-10具有抑制作用.     

RP-HPLC和UV-VIS法测定灵芝不同收获期的多糖肽和灵芝酸

目的 研究灵芝不同栽培方式和不同收获期中多糖肽和灵芝酸A、B的变化,为灵芝规范化栽培及制定产品质量标准提供依据。方法 RP-HPLC测定菌草灵芝和仿野生栽培的灵芝提取物的灵芝酸A、B的变化。色谱柱为XB-C₁₈柱（150 mm×4.6 mm,5 μm）,流动相为0.05%磷酸-乙腈（65∶35）,检测波长254 nm,常温,进样量50 μL。以灵芝多糖肽为对照品,采用Folin-酚试剂法,通过紫外-可见吸收光谱法检测菌草灵芝和仿野生栽培灵芝不同收获期提取物的多糖肽。结果 灵芝酸A、B线性范围分别为14.8～371.0和16.4～409.0 μg/mL,平均回收率为95.0%、100.5%,RSD分别为1.18%、3.37%（n＝6）。灵芝多糖肽在100～600 μg/mL与吸光度值呈线性关系,r＝0.999 5,回收率95%～100%。结论 该方法简便、快速,可用于灵芝及其产品中多糖肽和灵芝酸A、B的质量控制。菌草灵芝沸水提取能将多糖肽和灵芝酸分离,既简化了灵芝水、醇提取工艺,又提高经济效益。     

灵芝酸对痫样放电海马神经元ERK1/2磷酸化水平的影响

目的：探讨灵芝酸对癫痫样放电海马神经元ERK1/2磷酸化水平的影响。方法：以24h内新生Wistar大鼠为细胞源,用Neurobasal培养液培养海马神经元。①应用激光共聚焦显微镜检测培养神经元的纯度及其鉴定。②应用MTT法测灵芝酸的最适无毒浓度。③在研究最大无毒浓度的灵芝酸对痫样放电海马神经元ERK1/2磷酸化水平影响的实验中,将细胞随机分为：①正常对照组：将培养至第9天的海马神经元全液换成正常细胞外液处理3h,然后恢复正常培养3h后取材;②模型组：将培养至第9天的海马神经元全液换成无镁细胞外液处理3h,然后恢复正常培养3h后取材;③治疗组：将培养至第9天的海马神经元根据灵芝酸浓度不同,分为低、中、高三个浓度组（浓度分别为20μg/mL、80μg/mL、320μg/mL）,将各组的维持培养液全液换成无镁细胞外液处理3h,然后全液换成维持培养液配制不同浓度灵芝酸混悬液处理3h后取材。ELISA方法检测ERK1/2磷酸化水平的表达。结果：成功离体培养海马神经元,并用酶联免疫分析ERK1/2磷酸化水平的表达。各实验组中均有ERK1/2的表达并且各治疗组均能降低ERK1/2磷酸化水平,浓度为80μg/mL时结果最明显。结论：海马神经元癫痫样放电后ERK1/2被激活,在有效浓度的灵芝酸能显著抑制此反应中ERK1/2的磷酸化水平。     

灵芝多糖对小鼠黑素瘤B16F10细胞分泌VEGF的抑制作用

目的:探讨灵芝多糖对B16F10黑素瘤细胞分泌血管内皮生长因子(VEGF)的影响.方法:用不同浓度的灵芝多糖处理B16F10黑素瘤细胞,以正常培养基代替灵芝多糖培养B16T10黑素瘤细胞为对照.分别采用Westem blot法和RT-PCR法检测灵芝多糖作用48h后B16F10黑素瘤细胞VEGF蛋白和mRNA表达的变化.结果:浓度为0.8μg/ml、3.2μ g/ml、12.8μg/ml的灵芝多糖处理B16F10细胞后,B16F10细胞VEGF蛋白和mRNA的表达水平均明显降低(P＜0.05).结论:灵芝多糖可能通过抑制B16F10黑素瘤细胞分泌EGF起到抑制肿瘤的作用.     

灵芝对结核分枝杆菌体外抑菌作用的研究

目的研究灵芝对结核分枝杆菌的抑菌作用及其抑菌有效成分分析。方法应用PhaB法检测灵芝水提取物、灵芝总多糖、灵芝总三萜以及4种三萜成分对结核分枝杆菌(mycobacte rium tuberculosis,MTB)标准菌株和2株耐药菌株的抑菌作用。结果灵芝水提取物对标准菌株和耐药菌株在高浓度时具有明显的抑菌作用;灵芝总多糖对MTB不仅没有抑菌作用,且随着多糖浓度的增加,表现出一定的促菌作用;灵芝总三萜浓度500μg/ml时,对MTB的标准菌株和耐药菌株表现出明显的抑菌作用;CM119f、j6、Pa59、Sd164 4种三萜成分对标准菌株的MIC值为480μg/ml,对药多耐菌株的MIC值分别是240~480μg/ml、240~480μg/ml、480μg/ml、240~480μg/ml。结论灵芝对MTB具有抑菌作用,有效成分是灵芝三萜酸,不同的三萜成分不仅对敏感菌株有明显的抑菌活性,对多耐药菌株也具有同样的抑菌能力。     

灵芝多糖对多柔比星诱导心肌细胞损伤保护作用的研究

目的:研究灵芝多糖对多柔比星所致心肌损伤的保护作用,探讨多柔比星对心肌细胞损伤的机制.方法:将不同浓度多柔比星(1、2、4、6μmol/L)与H9C2心肌细胞共培养6、12、24h,计算不同作用时间及药物浓度的细胞抑制率;将H9C2心肌细胞与不同质量浓度(0,3.125,6.25,12.5,25mg/L)的灵芝多糖共培养,1h后加入多柔比星,24h后观察细胞形态变化,并计算细胞抑制率;将灵芝多糖与MCF-7,KB,K562共培养24h,1 h后加入多柔比星,48h后计算细胞生长抑制率.结果:2μmoL/L多柔比星与心肌细胞共培养24h的细胞抑制率最高,25mg/L灵芝多糖可明显降低多柔比星诱导的心肌细胞死亡,且不降低药物抗肿瘤作用.结论:灵芝多糖对心肌细胞具有直接保护作用,且不减弱多柔比星抗肿瘤作用.     

高密度发酵解脂假丝酵母生产RNA的工艺研究

为进一步优化RNA生产工艺,通过对解脂假丝酵母发酵培养,研究了pH、溶氧、还原糖浓度、高密度补料分批发酵和高密度连续发酵等因素对RNA产量及还原糖转化成菌体的转化率（g-DCW/g-reducing sugar）的影响。实验结果表明,最佳培养条件为pH 4,溶氧30%。在分批发酵中,培养基糖浓度为40 g/L时,最高DCW (dry cell weight)可达19.5 g/L,培养时间为8 h,RNA最高含量达到14.3%（g-RNA/g-DCW）,转化率为48.2%。在最佳pH和溶氧条件下进行pH-stat补糖分批发酵,控制罐内培养基糖浓度始终维持在15 g/L以下,最高核酸含量达到14.2%,转化率达到43.5%,最高菌体浓度35.6 g/L,比40 g/L糖浓度条件下分批发酵时的菌体浓度提高了75%。在此基础上进行高密度连续发酵,最终结果与高密度分批发酵相似。首次实现了高密度发酵解脂假丝酵母制备RNA。     

高密度微载体培养人肝癌细胞

目的研究人肝癌细胞在高密度微载体培养时的生长条件与培养方式,建立实验室规模高效、简便培养人肝癌细胞的方法。方法应用微载体CuhiSpher-S和Cytodex-1在1 L SuperSpinner搅拌瓶中培养人肝癌细胞THCC-98,采用批式换液连续培养的方式,对细胞生长及营养物质葡萄糖利用、代谢产物乳酸生成进行分析。结果人肝癌细胞THCC-98在CultiSpher-S和Cytodex-1培养中葡萄糖13消耗量高达2mmol／10^6。细胞（2．17和2．3）,乳酸日生成率为0．75—1．08mmol／10^6。细胞,最高浓度为9mmol／L（9．2比9．5）。通过实施批式换液连续培养,换液0．3—0．9V／d,可使细胞最高密度达（1．04比0．89）×10^7cells／ml。就两种微载体培养比较,CultiSpher-S由于具有更大的表面积／体积比,提供给细胞更大的生长空间,其所能达到的细胞密度高且营养物质利用更为有效。结论用1 L SuperSpinner搅拌瓶Cultisphere微载体批式换液连续高密度培养人肝癌细胞,细胞密度可达10^7cells／ml,批式收获细胞〉10^10。     

D-核糖发酵过程中的pH控制及对产D-核糖关键酶的影响

在枯草芽孢杆菌突变株D-756发酵生产D-核糖过程中，采用葡萄糖和葡萄糖酸钙混合发酵，葡萄糖酸作为pH调节剂，能促进菌体的生长，显著地提高D-核糖的产量。经酶活测定，发现流加葡萄糖酸能提高单位发酵液中葡萄糖酸激酶的酶活。在5L发酵罐中，利用葡萄糖酸维持发酵pH值在7．2，培养72h后产核糖76．8g／L。     

HP LC-ELSD法测定灵芝中灵芝酸A的含量

目的 建立测定灵芝药材中灵芝酸A质量分数的HPLC-ELSD法.方法 采用Welch XtimateTM-C18色谱柱(4.6 mm×250 mm,5μm),流动相为乙腈-体积分数0.01%醋酸(体积比37:63),流速为1 mL/min,柱温为30℃,进样量为10μL;蒸发光散射器漂移管温度为105℃,空气流速为2.8 L/min.结果 灵芝酸A的进样量在0.8928~5.3568μg范围内,峰面积的对数值与进样量的对数值具有良好的线性关系;平均加样回收率为95.81%;不同批次的灵芝样品中灵芝酸A的质量分数范围为0.2143~2.8942 mg/g,结果差异较大.结论 本法操作简单、结果准确、重复性好,为灵芝的质量控制提供参考方法.     

腺苷发酵液中有机酸的代谢规律

选取了优化过程中典型的3种含有不同碳源的培养基配方(其中配方A中含有100g／L葡萄糖，配方B中含100g／L蔗糖，配方C中含100g／L蔗糖和10g／L谷氨酸)，进行摇瓶发酵生产腺苷(AR)，以测定发酵液的生化参数。通过研究发酵液中的有机酸与腺苷的积累在时序性上的代谢规律，在此基础上提出了通过增强TCA循环为手段以提高目的产物产量的观点，即TCA强化论假说。     

重组巴斯德毕赤酵母高密度培养中铵离子浓度的影响

采用Mut^s表型的重组毕赤酵母生产血管生长抑制素，表达阶段流加甘油—甲醇混合碳源以提高菌体密度和血管生长抑制素的表达水平，菌体密度可达174g／L，约是表达阶段采用甲醇为单一碳源的发酵过程的3倍。菌体密度的提高导致表达阶段发酵液中铵离子浓度下降很快，当发酵液中的铵离子浓度低至40mmol／L时，影响了血管生长抑制素的表达。改变pH调节方式并在发酵后期添加25mmol／L(NH4)2SO4使发酵液中铵离子浓度维持在150mmol／L以上，血管生长抑制素的表达产量达到108mg／L。     

玉米浆用量、渗透压和耗糖速率对甘油发酵的影响

Candida krusei发酵生产甘油过程中,菌体生长由玉米浆限制,菌体对玉米浆的得率为1．63g/g,培养其中玉米浆浓度相同时,增加渗透压或通过流加补料限制生长阶段的菌体生长,可使甘油生产阶段的比耗糖速率减慢,比耗糖速率保持在不很高的水平,可以因消耗的葡萄糖用于生长,维持,甘油和副产物形成所占比例的变化而提高甘油得率。     

封闭式光生物反应器集胞藻6803光自养和混合营养培养比较

采用封闭式光生物反应器进行了蓝藻基因工程常用宿主系统集胞藻Synechocystissp.PCC6803的混合营养培养,并与光自养培养进行了比较.在两种培养方式下,集胞藻6803的饱和光强基本相同,都为5000lx.当入射光强为5000lx、初始葡萄糖浓度为1.74g/L时,混合营养生长在葡萄糖消耗完(69.5h)时的藻细胞密度为1.36g/L、叶绿素浓度为20.08mg/L、能量得率为16.7%,分别为同期光自养生长的3.8倍、2.3倍和2.6倍.这表明封闭式光生物反应器混合营养培养方式在促进集胞藻6803生长和光合色素合成及提高培养过程能量得率等方面都有显著作用.     

葡萄糖酸钙对肌苷发酵的影响

在肌苷的摇瓶发酵过程中，10g／L的葡萄糖酸钙适于肌苷的合成和菌体生长。初始培养基中加入10g／L的葡萄糖酸钙，能够诱导葡萄糖酸激酶的生成，大幅提高其比活，增大磷酸戊糖（HMP）途径的通量。肌苷的产率由10.76g／L提高到18.36g／L。     

前体氨基酸对维生素B12发酵合成的影响

谷氨酸、苏氨酸、甘氨酸和甲硫氨酸是维生素B12合成的重要前体。在脱氮假单胞菌（Pseudomonas denitrifican）发酵的产物合成期以补加的方式考察了这4种氨基酸对维生素B12合成的影响。在合成培养基的基础上,通过单因素添加试验分别考察了这些氨基酸对维生素B12合成的影响,发现谷氨酸、甘氨酸和苏氨酸影响显著;并进一步利用三因素三水平的正交试验设计考察了氨基酸混合添加对菌体生长和维生素B12合成的影响,结果表明谷氨酸是最主要的影响因素,并且发现同时添加多种氨基酸更有利。当添加量为谷氨酸0.45 g/L、苏氨酸0.20 g/L、甘氨酸0.15 g/L时,得到的菌体量和维生素B12产量分别比对照组提高了13.1%和46.0%。