腺病毒介导的P21WAF1/CIP1基因诱导血管平滑肌细胞凋亡

目的：应用重组腺病毒载体介导的P21^WAF1/CIP1基因转染血管平滑肌细胞（VSMC），探讨P21^WAF1/CIP1基因对平滑肌细胞凋亡的诱导作用。材料与方法：P21^WAF1/CIP1的重组病毒载体转染体外培养的猪主动脉平滑肌细胞，应用RT－PCR检测外源性P21^WAF1/CIP1基因的表达，并通过细胞形态、原位细胞凋亡分析、流式细胞仪和细胞生长曲线等方法观察P21诱导VSMC凋亡，抑制VSMC增殖的情况。结果：P21^WAF1/CIP1基因的重组腺病毒载体可以有效地转入平滑肌细胞中，诱导平滑肌细胞凋亡，并能显著地抑制平滑肌细胞增殖。结论：外源性P21^WAF1/CIP1基因转移可以诱导平滑肌细胞凋亡，显著地抑制平滑肌细胞增殖。     

BTEB2反义基因转染对血管平滑肌细胞迁移的影响

目的：研究BTEB2反义基因转染对血管平滑肌细胞（VSMC）增殖的影响。方法：将BTEB2 cDNA反向克隆至腺病毒载体,构建携带反义BTEB2基因的重组腺病毒Ad-ASBTEB2;用Ad-ASBTEB2转染VSMC,经免疫印迹法检测BTEB2蛋白质表达;通过改良Boyden趋化小室检测VSMC迁移数;用免疫细胞化学技术检测促VSMC迁移血小板源性生长因子B链（PDGF）的表达。结果：（1）Ad-ASBTEB2转染明显抑制VSMC的BTEB2蛋白表达;（2）Ad-ASBTEB2组VSMC迁移数较未转染组（P〈0．01）和Ad．LacZ组（P〈0．01）显著减少;（3）Ad-ASBTEB2组PDGF-BB表达较Ad．LacZ组和未转染组显著降低。结论：BTEB2反义基因转染显著抑制AngⅡ诱导的VSMC的迁移,这种抑制作用可能是通过减少促迁移因子的表达而实现的。     

高效反义STAT3对A549细胞辐射敏感性的影响

目的 探讨高效反义STAT3转染肺腺癌A549细胞后,肿瘤细胞辐射敏感性的变化,为提高恶性肿瘤的辐射敏感性提供新的探索思路和途径。方法 用自行设计成功的高效反义STAT3(AS10)转染A549细胞后,以不同剂量γ射线照射,通过CCK-8试剂盒检测细胞增殖变化,Hoechst 33258染色对细胞凋亡作形态学上的观察;用Annexin V/PI复染,流式细胞仪检测细胞早期凋亡率的变化;Western blot检测STAT3蛋白表达及磷酸化变化情况,以及其下游基因表达变化情况。结果高效反义STAT3(AS10)转染后,加以γ射线照射,A549细胞的增殖相比于单独作用组受到明显抑制,细胞早期凋亡水平也增加,STAT3蛋白及其下游Bcl-Xl、Cyclin D1蛋白表达变化明显下降,STAT3蛋白磷酸化水平也降低。结论 反义STAT3(AS10)联合γ射线对A549细胞的增殖抑制和诱导凋亡作用明显增强,提高了A549细胞的辐射敏感性;表明阻断STAT3蛋白表达可能成为一种新的提高肿瘤辐射敏感性的有效手段。     

胃癌相关基因GCRG213真核表达载体的构建及其对胃癌细胞生长特性的影响

目的 研究胃癌相关基因GCRG213正义、反义转染对胃癌细胞MKN45生长特性的影响。方法 将从pGEM-T质粒上扩增出的胃癌相关基因GCRG213的DNA片段,按正向、反向克隆人真核表达载体pcDNA3．1（＋）。测序正确的重组子pcDNA3．1-a（含GCRG213正向克隆）、pcDNA3．1-b（含GCRG213反向克隆）和空载体经脂质体转染人胃癌细胞系MKN45细胞,采用半定量RT-PCR及Western blot方法比较转染不同质粒的MKN45细胞中GCRG213在mRNA和蛋白质水平上的表达差异。选取稳定转染不同质粒的MKN45细胞,采用细胞计数法绘制细胞生长曲线,流式细胞仪分析细胞的增殖状态,Annexin VFITC／PI双标记法检测凋亡细胞。结果经测序证实,GCRG213正向克隆和反向克隆正确插入真核表达载体pcDNA3．1（＋）。与对应的空载体比较,转染pcDNA3.1-a的MKN45细胞中mRNA的表达上调35．4%,蛋白的表达上调49．4％,而转染pcDNA3．1-b的MKN45细胞中mRNA的表达下调32．1％,蛋白的表达下调50．3％。转染了GCRG213正向克隆的MKN45细胞生长增殖速度加快,凋亡率下降,而转染了GCRG213反向克隆的MKN45细胞生长增殖速度减慢,凋亡率增加。结论 胃癌相关基因GCRG213可促进肿瘤细胞的生长,抑制肿瘤细胞凋亡,可能是恶性肿瘤癌变的促进因素之一。     

视黄酸诱导胃腺癌细胞凋亡并上调P21／WAF1基因表达

目的 研究视黄酸（RA）对胃腺癌MGC－803细胞的作用及有关机制。方法 以荧光显微镜、透射电镜和电泳技术检测细胞凋亡,免疫组化检测细胞P21／WAF1蛋白表达。结果 RA处理的MGC－803细胞发生凋亡特征性的改变：细胞皱缩,核染色质凝集,边移,沿核膜内缘分布,呈帽形或半月形,亦可见凋亡小体的产生;基因组DNA沿核小体之间断裂,电泳得到凋亡特征性的DNA梯带;细胞P21／WAF1蛋白表达显著增高。结论 RA诱导胃腺癌MGC－803细胞凋亡与其上调P21／WAF1基因表达有关。     

转染P21~(WAF1)基因对GRC—1肾癌细胞凋亡的影响

目的:建立GRC—1肾癌细胞凋亡模型并探讨P21WAF1基因对肾癌细胞凋亡的影响。方法:采用顺铂诱导法建立肾癌细胞凋亡模型及转染P21WAF1基因方法观察P21WAF1基因的作用。结果:①用20μmol顺铂诱导GRC—1肾癌细胞。建立了细胞凋亡模型,凋亡细胞占细胞总数为29.4％。②成功转染了P21WAF1基因至GRC—1肾癌细胞;③转染P21WAF1基因的GRC—1肾癌细胞,培养至第10代细胞加入20μmol顺铂后,凋亡细胞占细胞总数为75.6％。④凋亡细胞比率29.4％与75.6％之间存在显著性差异,P<0.01。结论:①成功建立了肾癌细胞凋亡模型;②转染P21WAF1基因对肾癌细胞凋亡有促进作用。     

外源性WAF1-S基因表达对喉癌细胞生长的作用

目的 探索WA1F-S基因在喉癌细胞内表达的作用,为喉癌的基因治疗提供理论依据。方法 采用亚克隆技术,构建WAF1-S真核表达载体pcDNA3-WAF1-S。利用lipofectamine介导,将外源野生型WAF1-S基因导入喉癌细胞系Hep-2,筛选阳性克隆,采用打点杂交技术观察WAF1-S基因mRNA在喉癌细胞中的表达,用Western blot及激光共聚焦方法定量分析WAF1-S基因的蛋白表达产物,MTT及流式细胞仪检测Hep-2细胞的生长状态。同时以空载体质粒pcDNA3为对照,分析WAF1基因对喉癌细胞生长的影响。结果 打点杂交证实转染WAF1-S基因的Hep-2细胞有外源WAF1-S基因的表达,外源基因WAF1-S在Hep-2细胞系中的表达能抑制Hep-2细胞系的生长。转染后喉癌细胞中WAF1-S的蛋白表达明显高于对照组。流式细胞仪计数证实WAF1-S能诱导喉癌细胞系Hep-2发生凋亡并导致其发生G1期阻滞。结论 导入外源野生型WAF1-S基因可抑制喉癌细胞生长。     

YAP1基因促进人甲状腺癌细胞生长与迁移

目的 构建带myc标签的人Yes相关转录调节蛋白1(YAP1)基因的真核表达载体,探讨YAP1对甲状腺癌BCPAP细胞增殖和迁移的影响.方法 采用聚合酶链反应(PCR)扩增YAP1的编码区序列,将其插入到pXJ40-myc载体中,构建pXJ40-myc-YAP1重组质粒并鉴定;质粒转染人甲状腺癌BCPAP细胞,Western印迹鉴定融合蛋白表达,细胞增殖实验(CCK-8法)、克隆形成实验、划痕实验检测细胞的生长、增殖和迁移能力的变化.结果 pXJ40-myc-YAP1质粒构建成功;转染BCPAP细胞后重组融合蛋白表达成功;细胞增殖实验、克隆形成及划痕实验证明YAP1可促进甲状腺癌细胞BCPAP的增殖和迁移.结论 带myc标签的人YAP1基因能在人甲状腺癌BCPAP细胞中表达,且可促进该细胞的增殖和迁移,为进一步研究YAP1在甲状腺肿瘤中的功能奠定了基础.     

JTV1对K562细胞增殖和凋亡的影响及其机制

目的观察上调JTV1基因的表达对人白血病K562细胞系增殖与凋亡的影响并探讨其机制。方法将携带有JTV1基因的pcDNA3.1-JTV1载体转染人K562细胞作为阳性转染组,转染pcDNA3.1空载体作为空载体转染组,未转染的K562细胞为未转染组。通过集落形成实验检测各组K562细胞的增殖能力,采用流式细胞术与Annexin-PI双染色结合分析细胞周期和细胞凋亡率,同时采用RT-PCR法检测JTV1基因及凋亡相关基因Bcl-2、Bax、C-myc mRNA水平的变化,采用Western blotting检测基因JTV1及凋亡相关基因Bcl-2、Bax、C-myc蛋白水平的变化。结果集落形成实验结果显示上调JTV1基因表达后K562细胞的增殖能力明显降低。流式细胞术与Annexin-PI双染色检测结果显示,与空载体转染组及未转染组相比,阳性转染组K562细胞的G期细胞比例明显升高(P<0.05);阳性转染组中Bax基因的mRNA水平和蛋白水平较空载体转染组及未转染组均明显上升,而Bcl-2基因和C-myc基因的mRNA水平和蛋白水平则明显下调(P<0.05)。结论 JTV1基因过表达可能通过抑制基因Bcl-2和C-myc的表达增强基因Bax的表达,从而抑制K562细胞系的增殖并促进其凋亡。     

慢病毒介导的siRNA靶向CD47基因对人喉癌细胞Hep-2增殖、凋亡的影响

目的 探究慢病毒载体介导siRNA抑制CD47基因表达后对人喉癌细胞株Hep-2体外增殖凋亡的影响.方法 构建慢病毒载体,将靶向CD47基因的siRNA慢病毒转染至Hep-2细胞;用荧光显微镜行细胞形态学变化观察;RT-PCR检测细胞CD47 mRNA表达的变化;Western blotting检测CD47蛋白表达的变化情况;MTT法检测细胞的增殖凋亡情况.结果 CD47-siRNA慢病毒转染Hep-2细胞后,形态学观察显示CD47-siRNA能有效抑制Hep-2细胞增殖,细胞变形明显,体积变小,可见细胞坏死及凋亡.RT-PCR和Western blotting检测显示,CD47的mRNA和蛋白表达水平显著降低(P＜0.05),使CD47 mRNA表达减少76％～82％,CD47蛋白表达减少77％;慢病毒转染细胞在48h后MTT检测细胞凋亡率明显提高(P＜0.01).结论 慢病毒介导的siRNA干扰CD47基因表达后,明显抑制了喉癌Hep-2细胞CD47的表达并且诱导了Hep-2凋亡.     

鸢尾苷元抗血管平滑肌细胞增殖及抗动脉粥样硬化机制的研究

目的观察鸢尾苷元对氧化低密度脂蛋白诱导血管平滑肌细胞增殖及其单核细胞趋化蛋白-1和细胞间黏附因子-1表达的影响,探讨其抗动脉粥样硬化的作用机制。方法采用体外培养大鼠血管平滑肌细胞,加入氧化低密度脂蛋白100μg/ml建立血管平滑肌细胞增殖模型,加入不同剂量的鸢尾苷元,通过噻唑蓝比色法观察血管平滑肌细胞增殖率,并采用逆转录-聚合酶链反应方法检测血管平滑肌细胞单核细胞趋化蛋白-1和细胞间黏附因子-1mRNA的表达情况。结果鸢尾苷元对氧化低密度脂蛋白所致的血管平滑肌细胞增殖具有明显的抑制作用,并显著抑制氧化低密度脂蛋白诱导血管平滑肌细胞单核细胞趋化蛋白-1和细胞间黏附因子-1mRNA的过度表达。结论鸢尾苷元抗血管平滑肌细胞增殖和抑制氧化低密度脂蛋白诱导的血管平滑肌细胞单核细胞趋化蛋白-1和细胞间黏附因子-1的过度表达,可能是其抗动脉粥样硬化的重要作用机制之一。     

转染P21WAF1基因对BT—325细胞端粒酶表达的影响

目的：观察外源性p231WAF1基因对BT－325细胞的作用,探讨p21WAF1表达水平的改变对细胞端粒酶活性的影响。方法：经脂质体介导的方法将PCEP－WAF1质粒导入BT－325细胞中,细胞克隆转移扩大培养后,采用TRAP－PCR－ELISA、TUNEL和电镜等技术检测外源性p21WAF1基因对BT－325细胞端粒活性和细胞凋亡的作用。结果：较对照组相比,转染外源性p21WAF1基因的BT－325细胞端粒酶表达水平显著下降,伴有显著细胞凋亡现象。结论：外源性p21WAF1基因的表达可促进BT－325细胞端粒酶活性降低,诱导细胞显著凋亡,提示端粒酶的活性表达可能与细胞周期调控存在密切联系。     

姜黄素对人食管癌EC9706细胞增殖及侵袭的影响

目的探讨姜黄素（Curcumin）对人食管癌EC9706细胞增殖、细胞凋亡及侵袭的影响及其分子机制。方法应用0、40、80、120、160μmol/L姜黄素处理EC9706细胞24~72h后,采用四甲基偶氮唑蓝法（MTT）检测细胞增殖抑制率;RT-PCR检测转录因子Ets-1及MMP9（基质金属蛋白酶）mRNA的表达。结果姜黄素作用后,EC9706细胞生长明显减慢,抑制率5.5%~76.2%（P〈0.05）,呈时间-剂量效应关系;Ets-1及MMP9 mRNA表达降低,且两者之间有相关性,有统计学意义（P〈0.01）。结论姜黄素能明显抑制EC9706细胞的增殖及侵袭能力,其机制可能与抑制Ets-1及MMP9表达相关,这可能是姜黄素抑制肿瘤细胞增殖及侵袭的机制之一。     

大鼠颈动脉球囊损伤后血管平滑肌细胞过度增殖与基质交感分子1的关系研究

目的研究大鼠颈动脉球囊损伤后血管平滑肌细胞中基质交感分子1(STIM1)的表达变化情况,揭示平滑肌细胞增殖的内在机制。方法采用大鼠颈动脉球囊损伤后血管再狭窄的动物模型,18只SD大鼠随机均分为3组:对照组、损伤7d组和损伤14d组。免疫组织化学染色和反转录-聚合酶链反应(RT-PCR)检测增生的血管平滑肌细胞中STIM1的表达变化,HE染色评价血管增生情况。结果正常大鼠颈动脉内膜与中膜面积比值(IA/MA)很小,损伤7d组IA/MA值显著高于对照组(P<0.05);损伤14d组IA/MA值显著高于7d组(P<0.05)。损伤后7d血管壁STIM1 mRNA水平显著高于对照组(P<0.05);损伤后14d血管壁STIM1 mRNA显著高于7d组(P<0.05)。免疫组化显示STIM1在血管壁的表达主要位于增殖的平滑肌细胞中,随损伤时间延长其表达量逐渐升高。结论颈动脉球囊损伤后血管平滑肌细胞增殖伴有STIM1表达的上调,STIM1可能参与对血管平滑肌细胞增殖的调控。     

TGFβ1正、反义基因转染60Co照射HELF对TGFβ1及I型前胶原mRNA表达调控影响

目的　观察TGFβ1正、反义基因转染6 0 Coγ射线照射的HELF后对其TGFβ1mRNA及Ⅰ型前胶原mRNA表达调控的影响。方法　采用脂质体介导法进行基因稳定转染 ,转染细胞经PCR ,DNAdotblot鉴定和RNAdotblot分析。结果　选择 5Gy照射细胞 ,采用LipofectAMINE将TGFβ1正、反义基因表达载体pMAMneo TGFβ1和pMAMneo AntiTGFβ1转入HELF ,转染细胞经G418抗性筛选出来 ,并且在糖皮质激素地塞米松诱导下培养。提取培养细胞的RNA和染色体DNA ,转染细胞DNA与地高辛标记的neo特异探针杂交阳性 ,且可用neo基因特异的PCR引物扩增出 2 76bp的阳性片段。对提取的RNA用地高辛标记的TGFβ1探针和α1(Ⅰ )寡核苷酸探针经RNAdotblot分析表明 ,转染pMAMneo AntiTGFβ1的细胞其TGFβ1mRNA水平下降 ,而转染pMAMneo TGFβ1的细胞其TGFβ1mRNA水平则升高。对于Ⅰ型前胶原mRNA ,前者表达水平比未转染细胞低 ,后者则略高。 结论　TGFβ1反义基因转染6 0 Coγ射线照射的人胚肺成纤维细胞后可以使细胞中TGFβ1mRNA含量水平减少 ,使Ⅰ型前胶原mRNA表达水平降低     

半胱氨酸对人血管平滑肌细胞增殖和凋亡的影响

目的观察半胱氨酸（Cys）对人血管平滑肌细胞（VSMCs）增殖和凋亡的影响。方法采用组织贴块法体外培养人VSMCs,用不同浓度的Cys培养液孵育细胞24h,用MTT法检测VSMCs增殖,流式细胞术检测VSMCs凋亡,RT-PCR法检测bax mRNA的表达。结果体外培养的人VSMCs在终浓度为100、200、500和1000μmol/LCys的培养液中孵育24h后的吸光度（A）值均高于对照组（P〈0.05）,表明Cys可诱导人VSMCs增殖;但同时,VSMCs凋亡细胞数明显高于对照组（P〈0.05）,bax的表达增强,表明Cys亦诱导了人VSMCs凋亡。结论浓度较高时半胱氨酸可同时诱导VSMCs增殖和凋亡。     

Ox-LDL对主动脉平滑肌细胞中ABCA1及炎性因子表达的影响

 目的 研究氧化低密度脂蛋白(Ox-LDL)诱导作用下,ATP结合盒转运子A1(ABCA1)对人主动脉平滑肌中单核细胞趋化因子-1(MCP-1)、细胞间黏附分子-1(ICAM-1)mRNA和蛋白质及白介素-1β(IL-1β)表达的影响.方法 复苏培养人主动脉平滑肌细胞CC2571、Ox-LDL (30 μg/ml) 刺激3、6、12、24 h后,以荧光定量RT-PCR法检测ABCA1、ICAM-1、MCP-1mRNA表达,Western蛋白印迹法及ELISA法检测ABCA1、ICAM-1、MCP-1及IL-1β蛋白质表达;用ABCA1的反义寡核苷酸抑制ABCA1表达后,观察上述指标的变化.结果 予Ox-LDL刺激后, CC2571细胞中ABCA1、MCP-1、ICAM-1的mRNA和蛋白及IL-1β蛋白质表达均增加,反义寡核苷酸转染后3、6 h时上述指标的mRNA表达降低,12、24 h蛋白质表达降低.结论 Ox-LDL诱导主动脉平滑肌细胞炎性因子的表达,ABCA1可能通过增强上述炎性因子表达参与动脉粥样硬化(atherosclerosis,AS)的发生.