重组丙型肝炎病毒基因载体的构建与表达

应用基因重组技术。从载体ＣＤＺ２酶切获得１．７３ｋｂＤＮＡ片段（含１６ｄ９３ｂｐ的ＨＣＶ结构区ｃＤＮＡ，其特异性已为ｓｏｕｔｈｅｒｎｂｌｏｔ证实）。将ＨＣＶｃＵＮＡ片段插入载体ｐｃＤＮＡ３，构建ＨＣＶ重组体。经在大肠杆菌中表达，筛选、酶切分析，获得重组ＨＣＶ（ＰｃＤＮＡ３－ＨＣＶ）。以重组质粒转染Ｈ９细胞（ＣＤ淋巴细胞系），用Ｇ４１８筛选出抗性细胞。经ＲＴ－ＰＣＲ、ｄｏｔ－ＥＬＩＳＡ验证表明，ｐｃＤＮＡ３－ＨＣＶ能在Ｈ９细胞中进行复制、转录和表达。这为丙型肝炎发病机理的研究提供了一个有用模型。     

尿激酶受体反义RNA表达质粒的构建

构建能在哺乳动物细胞中表达尿激酶受体（ｕＰＡＲ）反义ＲＮＡ的表达质粒ｐＵＲＡＳ。方法采用ＲＴ－ＰＣＲ方法扩增并克隆尿激酶受体（ｕＰＡＲ）ｃＤＮＡ５’端－４６～４５４ｂｐ一段长５００ｂｐ的顺序，利用ＤＮＡ重组技术将该片段反向插入表达载体ｐｃＤＮＡ３的ＣＭＶ启动子下游。结果限制性内切酶分析和ＤＮＡ顺序分析证实ＲＴ－ＰＣＲ获得的ｕＰＡＲｃＤＮＡ片段与文献报道相吻合；重组质粒ｐＵＲＡＳ转染肺癌细胞株９５Ｄ，ＮｏｒｔｈｅｒｎＢｌｏｔ证实转染细胞克隆有ｕＰＡＲ反义ＲＮＡ的表达。结论重组质粒ｐＵＲＡＳ能在肺癌细胞株９５Ｄ中表达尿激酶受体反义ＲＮＡ，尿激酶受体（ｕＰＡＲ）反义ＲＮＡ表达质粒的构建获得成功。     

尿激酶受体反义RNA表达质粒的构建

目的 构建能在哺乳动物细胞中表达尿激酶受体（ｕＰＡＲ）反义ＲＮＡ的表达质粒ｐＵＲＡＳ。方法 采用ＲＴ－ＰＣＲ方法扩增并克隆尿激酶受体（ｕＰＡＲ）ｃＤＮＡ５’端－４６￣４５４ｂｐ一段为５００ｂｐ的顺序，利用ＤＮＡ重组技术将该片段反向插入表达载体ｐｃＤＮＡ３的ＣＭＶ启动子下游。结果 限制性内切酶分析和ＤＮＡ顺序分析证实ＲＴ－ＰＣＲ获得ｕＰＡＲ ｃＤＮＡ片段与文献报道相吻合；重组质粒ｐＵＲＡＳ转染肺癌细     

恶性疟原虫裂殖子表面蛋白—2基因克隆及其在大肠杆菌中 …

目的：克隆恶性疟原虫裂殖子表面蛋白２全基因,并在大肠杆菌中进行表达。方法：采用ＰＣＲ扩增恶性疟原虫ＦＣＣ－１／ＨＮ株ＭＳＰ２基因,克隆插入ｐＵＣ１９,并重组人表达质粒载体中,转化大肠杆菌,诱导重组质粒ｐＢＫ－ＣＭＶ／ｍｓｐ２表达ＭＳＰ２蛋白抗原,对表达产物进行ＳＤＳ－ＰＡＧＥ,ｄｏｔ－ＥＬＩＳＡ和Ｗｅｗｔｅｒｎ ｂｌｏｔ鉴定。结果：ＰＣＲ扩增出８２４ｂｐＤＮＡ片段,经酶切鉴定和部分序列测定证实为Ｍ     

人4-1BB-hIgG1Fc融合蛋白真核表达载体的构建

目的：构建人４１ＢＢ胞膜外区ｈＩｇＧ１Ｆｃ融合蛋白真核表达载体。方法：ＰＣＲ扩增人４１ＢＢ胞膜外区和ｈＩｇＧ１Ｆｃ基因片段，用ＨｉｎｄⅢ、ＰｓｔＩ酶切４１ＢＢ胞膜外区，ＰｓｔＩ　、ＥｃｏＲ　Ｉ　酶切ｈＩｇＧ１Ｆｃ　，ＨｉｎｄⅢ、ＥｃｏＲＩ　酶切ｐＣＤＮＡ３，纯化后的酶切产物经Ｔ４ＤＮＡ连接酶连接，转化大肠杆菌ＤＨ５α，氨苄青霉素筛选阳性克隆，ＰＣＲ及测序鉴定。结果：连接反应产物转化大肠杆菌ＤＨ５α，氨苄青霉素筛选出多个阳性克隆；分别以针对４１ＢＢ胞膜外区和ｈＩｇＧ１Ｆｃ的引物进行ＰＣＲ扩增，电泳后观察到一５５８ｂｐ、７０８ｂｐ的特异性条带，与４１ＢＢ胞膜外区和ｈＩｇＧ１Ｆｃ相符，提示构建成功。进一步测序分析证明克隆在ｐＣＤＮＡ３　质粒中的４１ＢＢ和ｈＩｇＧ１Ｆｃ序列和读码框架正确，无基因突变。结论：成功构建人４１ＢＢ胞膜外区ｈＩｇＧ１Ｆｃ融合蛋白真核表达载体，为表达４１ＢＢ融合蛋白奠定基础。     

HCVC基因部分序列的克隆测序

选取５株ＨＣＶ共有序列合成一时５’端加端引物。上游加端为ＥｃｏＲⅠ切点，下游加端为ＢａｍＨＩ切点。以ＲＴ－ＰＣＲ扩增一长为５７８ｂｐ的ｃＤＮＡ作目的基因，相应酶切后，反向插入ＰＵＣ１８的多克隆位点，构建ｐＵＨＣ－Ｃ重组体。分别或混合应用ＨＣＶ特异内外引物和ｐＵＣ特异通用引物以ＰＣＲ扩增重组体，扩增产物分子片段均同预期一致。测序表明克隆基因与ＨＣＶ－ＣＨＮ最同源，在所测ＣＥ４９７个核苷酸及由之推导的１６０个氨基酸区域内。其核苷酸与氨基酸同源性都是９７．５％。     

大鼠肾皮质受体相关蛋白克隆基因重组表达质粒的构建及分子生 …

运用ＤＮＡ重组技术，将用ＲＴ－ＰＣＲ方法克隆的大鼠肾皮质受体相关蛋白３１９个氨基酸的核苷酸序列导入载体ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ和表达载体ｐＧＥＸ中，分别构建了重组质粒ｐＢＳＫ９ＲＡＰ和ｐＧＥＸ－９ＲＨ７，转化入大肠杆菌ＸＬ１－Ｂｌｕｅ和ＤＨ５α中，经ＩＰＴＧ，ｘ＝ｇａｌ抗生素筛选阳性克隆，扩增后，重组质粒用限制性内切酶图谱分析及ＤＮＡ测序分析，证明插入了方向正确，表达阅读框架正确。     

小鼠肥大细胞瘤P815特异抗原P1A的克隆与表达

目的 克隆小鼠肥大细胞瘤Ｐ８１５细胞株的ＰＩＡ基因以制备肿瘤ＤＮＡ疫苗,方法 用ＲＴ－ＰＣＲ方法制备ＰＩＡ基因,以哺乳细胞高效表达质粒ｐＣＩ－ｎｅｏ为载体,构建重组ＤＮＡ疫苗。重组体用克隆位点上游和下游的Ｔ７和Ｔ１３启动了序列为测序引物,用自动测序仪测定鉴定克隆的正确性。再将鉴定过的重组质粒用磷酸钙法转化２９３细胞,用ＲＴ－ＰＣＲ法鉴定转化细胞中ＰＩＡ基因的表达。结果 正确构建了ＰＩＡ／ｐＣＩ－ｎ     

βB2-晶体蛋白的克隆和在大肠杆菌中的高效表达和纯化

目的表达βＢ２－晶体蛋白，以研究其结构与功能的关系。方法用ＲＴ－ＰＣＲ的方法从大鼠晶状体中获得βＢ２－晶体蛋白的ｃＤＮＡ，将ｃＤＮＡ克隆到表达载体ｐＭＯＮ５７４３，转染Ｅ．ｃｏｌｉ菌株ＪＭ１０１，以萘啶酮酸诱导表达βＢ２－晶体蛋白，用ＤＥＡＥ纤维素层析纯化。结果ＲＴ－ＰＣＲ扩增获得约７００ｂｐ的ｃＤＮＡ，在Ｅ．ｃｏｌｉ中获得高效表达，βＢ２－晶体蛋白占细菌总蛋白的３０％。ＤＥＡＥ纯化后获一２４ｋＤ蛋白，分子量与βＢ２－晶体蛋白一致。结论βＢ２－晶体蛋白ｃＤＮＡ可在大肠杆菌中获高效表达，表达产物的分子量约２４ｋＤ。     

pcDNA3.1(+)GDNF真核表达载体的构建及其在真核细胞中的表达

目的　构建ｐｃＤＮＡ3.1(+)胶质细胞源性神经营养因子 (ＧＤＮＦ)真核表达质粒并了解其在真核细胞内的表达。方法　将ＧＤＮＦ逆转录聚合酶链式反应 (ＲＴ ＰＣＲ)产物克隆至ｐｃＤＮＡ3.1(+)真核表达载体上 ,经酶切鉴定及测序分析并以ＦｕＧｅｎｅ 6介导法转染真核细胞 ,了解其在细胞内的表达及其表达蛋白的生物学活性。结果　ＲＴ ＰＣＲ产物为 6 40ｂｐ特异片段 ,ｐｃＤＮＡ3.1(+)ＧＤ ＮＦ重组体经酶切后分别出现 6 40ｂｐ和 30 0ｂｐ片段 ,测序分析与文献报道结果完全一致 ,表明重组ｐｃＤＮＡ3 .1(+)ＧＤＮＦ表达质粒克隆成功。可见…     

CONSTRUCTION，EXPRESSION AND BIOLOGICAL ASSESSMENT OF BPI23—Fcγ1 RECOMBINANT PROTEIN PROKARYOTIC EXPRESSION VECTOR

INTRODUCTIONGram－negativesepsis（GNS）andinfectiousshockarechallengestocliniciansbecauseofhighmortality（１）．Routineantibiotictherapydoesnotworkwellbe－causeoftheincreasingoccurrenceofresistantstrainsand（２）．Anti－lipopolysaccharide（LPS）monoclonal     

pBV-BPI600重组表达载体的构建及其在E.coli中的表达

①采用RT PCR技术 ,以HL 60细胞mRNA为模板扩增获得编码BPI氨基端 1 93个氨基酸 (rBPI2 1)的基因片段 (BPI60 0 ) ;EcoRI/BamHI酶切扩增产物获得BPI 2 0 0bp和BPI 4 0 0bp 2个基因片段。②成功构建PUC1 8 BPI2 0 0和PUC1 8 BPI4 0 0重组克隆载体 ,DNA测序分析结果与文献报道一致。③成功构建pBV2 2 0 BPI60 0重组表达载体 ;转化E .coliDH5α感受态细胞 ,诱导目的重组蛋白表达 ;经SDS PAGE电泳和Western blot鉴定 ,证实表达的重组蛋白确为外源基因 (BPI 60 0bp)编码的产物BPI2 1重组蛋白。     

pPICZα-synBPI_(m600)酵母表达载体的构建和鉴定

为使rBPIm2 3 重组抗菌蛋白在毕赤酵母表达系统中分泌表达 ,拟构建synBPIm60 0 酵母表达载体。以pUC18 synBPI41 4 质粒为模板扩增synBPI2 0 0 基因片段 ,经XhoI/EcoRI双酶切获得synBPI1 85bp基因片段 ;EcoRI/SalI双酶切PBV2 2 0 BPIm60 0 质粒获得BPIm42 0 基因片段 ;将上述 2个基因片段连接后定向克隆到pPICZα酵母表达载体上。连接产物转化E .coliTOP 10F′ ,在含Zeocin的低盐LB固体培养基上筛选阳性转化子。阳性克隆菌经菌落PCR法鉴定、酶切分析和测序鉴定 ,结果与预期相符。提示 :成功构建了pPICZα synBPIm60 0 酵母表达载体     

定点突变对BPI23-Fcγ1重组抗菌蛋白表达和复性率的影响

为提高BPI₂₃-Fcγ1重组抗菌蛋白在原核表达系统中的表达和复性率,采用定点突变法改造pBV-BPI₆₀₀-Fcγ1₇₀₀重组表达载体,转化E.coliDH5α后,通过温控诱导表达.结果表明:①突变后BPI₂₃-Fcγ1重组抗菌蛋白表达量比突变前提高约10%;②表达时间提前约1h;③抗菌活性未受影响;④复性率未见显着提高.     

DDR2/Fc融合基因真核表达载体的构建及表达

目的:构建DDR2/Fc真核表达载体,使其在HEK293细胞中进行表达. 方法:采用PCR技术,分别从大鼠脑组织、含人IgG1 Fc全长互补DNA(cDNA)的质粒中扩增出盘状结构域受体2(DDR2)的DS区域、Fc段,以定向克隆的方法将其串联至真核表达载体pcDNA3.1(-)中,获得重组表达载体DDR2/Fc-pcDNA3.1(-);采用脂质体转染技术转染HEK293细胞; RT-PCR、免疫印迹检测融和蛋白的表达. 结果:DNA测序和限制型酶切鉴定证明两段基因正确克隆至pcDNA3.1(-)的多克隆位点,细胞裂解物中检测到融合蛋白的表达,其分子质量与预期大小一致,该融合蛋白能正确表达于HEK293细胞中. 结论:成功构建了DDR2/Fc融和表达载体,表达了融合蛋白.     

小鼠CTLA4-Fc融合基因真核表达载体的构建及表达

目的 构建小鼠细胞毒性T淋巴细胞相关抗原4Fc融合基因（CTLA4-Fc）的真核表达质粒,并检测其在293T细胞中的表达,为后续在小鼠体内研究CTLA4-Fc抗肿瘤作用机制奠定基础。方法 Gene Runner 软件设计并合成互为搭桥、互为模板的CTLA4融合基因引物,利用重叠PCR方法扩增获得CTLA4基因片段,与pcDNA3.1(+)/Fc (Mouse IgG2a)质粒同时进行双酶切,连接合成CTLA4-Fc融合基因表达质粒;菌落PCR扩增、双酶切以及测序鉴定后,在293T细胞中瞬时转染表达融合基因的质粒,ELISA法检测其在293T细胞内的蛋白表达含量。结果 成功构建CTLA4-Fc融合基因。经菌落PCR和双酶切,琼脂糖电泳检测到CTLA4-Fc片段长度为1 200 bp,CTLA4片段长度为568 bp DNA。将阳性重组克隆菌落挑于液体LB培养基中扩大培养并将菌液送公司测序,测序结果证实DNA序列与GenBank同源性为100%。通过ELISA方法能够检测到CTLA4-Fc质粒在293T细胞中的表达。结论 CTLA4-Fc融合基因正确克隆入pcDNA3.1(+)/Fc (Mouse IgG2a)质粒中,该质粒能够在293T细胞中表达。本研究利用重叠PCR技术扩增获得CTLA4基因序列,能够快速获得目的 基因扩增产物,提高了实验的成功率。     

表达载体sHLA-A2-IgG1-Fc的构建与鉴定

目的构建表达载体pcDNA3.0-sHLA-A2-IgGl-Fc,为进一步真核表达可溶性HLA-A2-IgG1-Fc蛋白奠定基础。方法从T2细胞中提取总RNA,借助RT-PCR技术扩增包括信号肽的可溶性HLA-A2的cDNA序列并把其插入真核表达载体pcDNA3.0,然后经酶切和测序法鉴定;用PCR的方法从含IgG1-Fc基因的PIG质粒中扩增目的基因IgG1-Fc段,然后经酶切后插入前面构建好的表达载体pcDNA3.0-sHLA-A2中,最后经酶切和测序法鉴定。结果经酶切鉴定及测序分析,证实已将目的基因HLA-A2和IgG1-Fc片段插入载体pcDNA3.0。结论本研究成功构建表达载体pcDNA3.0-sHLA-A2-IgG1-Fc。     

重组α2-HS糖蛋白的原核表达、纯化及免疫学活性分析

目的:原核表达并纯化具有生物学活性的重组α2-HS糖蛋白(AHSG)。方法:提取人肝癌细胞株HepG2细胞总RNA,逆转录得cDNA,PCR扩增出目的基因,与pMD18-T载体连接后,转化至大肠杆菌DH5α中,大量扩增后提取克隆质粒,连接至原核表达载体pEP-30a(+)中,转化BL21(DE3),经IPTG诱导蛋白表达,通过镍离子亲和层析的方法纯化重组蛋白,采用SDS-PAGE电泳、免疫印迹杂交法对纯化产物进行分析鉴定。结果:成功构建了AHSG原核表达系统BL21(pET30a-AHSG),最佳诱导条件为80μmol/LIPTG诱导3h;诱导表达的蛋白相对分子质量约54600,主要以不溶性的包涵体形式存在,纯化后的重组蛋白质量浓度最高达2.3g/L,经免疫印迹杂交鉴定有抗原性。结论:成功构建了AHSG原核表达系统,该系统可高效表达重组AHSG蛋白,该蛋白具有良好的抗原性。     

重组人p75NTR169-Fc抗酶裂嵌合体在大肠杆菌中的表达、纯化及活性鉴定

目的制备重组人p75NTR169-Fc融合蛋白,其是一种潜在的抗凋亡和止痛的候选药物。方法 (1)应用PCR法,以本组保存的pUC12-NGFR和人肝cDNA为模板,扩增出p75NTR(1～169氨基酸),IgG Fc(216～433氨基酸)基因顺序,再按照重叠PCR的原则和方法,将两组扩增产物混合变性、复性后再扩增,得到"p75NTR(1～169)-IgG Fc(216～433)"融合基因,缩写为p75NTR169-Fc。(2)应用DNA重组技术将p75NTR169-Fc融合DNA片段经NcoⅠ、EcoRⅠ酶切插入到pET28a(+)原核表达载体中,获得pET28a-p75NTR169-Fc重组质粒。(3)利用pET28a(+)/BL21(DE3)原核表达系统诱导表达目的蛋白,经protein A亲和层析纯化,得到纯度约96%的p75NTR169-Fc重组蛋白质。(4)用MTT方法,以PC12细胞检验不同剂量重组蛋白抗β-淀粉样肽(Aβ25～35)细胞毒的作用。结果 (1)成功构建了pET28a-p75NTR169-Fc/BL21(DE3)表达系统,其高效表达可溶性重组蛋白。实验表明:该重组蛋白p75NTR169-Fc稳定性好,不再被蛋白酶降解,为单一条带。亲和层析纯化后,分子质量均一。(2)p75NTR169-Fc与p75NTR竞争结合Aβ(25～35),拮抗Aβ(25～35)对PC12的细胞毒作用。结论重组人抗酶裂嵌合体蛋白p75NTR169-Fc具有生物学活性,在临床治疗阿尔茨海默病(Alzheimer’s disease,AD)上具有应用前景,系针对神经退行性疾病的新的候选药物。