从噬菌体抗体库筛选人源性抗白细胞介素8抗体

目的: 从噬菌体抗体库中筛选人源性抗IL- 8单链抗体(scFV)。方法: 采用原核表达载体pRSET- IL- 8在大肠杆菌BL21(DE3)中表达IL- 8 His融合蛋白, 并通过亲和层析纯化。以该融合蛋白为固相抗原, 对噬菌体抗体库进行 3轮淘筛, 并对所获阳性克隆进行抗原结合活性测定和DNA序列测定。结果: 获得 2株特异性抗IL- 8噬菌体抗体。对其DNA序列测定结果表明, 其VH基因均属于人IgGVH3亚群, Vλ基因分别属于人VλDPL5和VλDPL2亚群。结论: 利用噬菌体抗体库技术可不经免疫制备人源性抗IL- 8抗体, 为银屑病及相关疾病的临床应用提供了条件。     

人源性抗乳腺癌单链抗体库的筛选与初步鉴定

目的:本研究旨在已构建的大容量人源性抗乳腺癌噬菌体单链抗体库的基础上,筛选出高亲和力的特异性单链抗体(scFv)并对抗体基本特性进行初步鉴定。方法:以人乳腺癌细胞系MCF-7为靶标,经过4轮淘洗,筛选出高亲和力的特异性抗乳腺癌scFv,并对其结构序列进行分析;通过ELISA和Western blot方法,鉴定scFv的亲和力和特异性,以及其蛋白的基本表达情况。结果:成功构建具有高亲和力的抗乳腺癌单链抗体库,获得scFv的长度约为750 bp,ELISA证实所得抗体对乳腺癌细胞具有良好的亲和力和高度的特异性,IPTG诱导表达及Western blot结果显示,scFv为相对分子质量(Mr)30 000的可溶性蛋白。结论:本研究在已构建的大容量抗乳腺癌单链抗体库的基础上,筛选获得了高亲和力的抗乳腺癌单链抗体库。研究结果为进一步获得可应用于临床诊断和治疗的乳腺癌靶向性抗体奠定了良好的基础。     

人源Fab噬菌体抗体库的构建与抗精氨酸加压素抗体的筛选

目的:构建人源天然Fab噬菌体抗体库,筛选抗精氨酸加压素特异性抗体并进行初步鉴定。方法:从18位健康成人的外周血淋巴细胞,提取总RNA。利用RT-PCR扩增人Fab抗体基因片段,将其克隆至噬菌粒载体pComb3XSS内,构建人源天然Fab噬菌体抗体库。以固相化的精氨酸加压素为靶抗原对抗体库进行五轮筛选后,随机挑取50个单克隆进行phage-ELISA检测,阳性克隆行DNA测序分析。结果:成功构建库容为2.4×108的噬菌体抗体库,从中筛选到6株阳性克隆能够与精氨酸加压素特异性结合,其中阳性值最高的C4克隆行DNA测序分析证实其重链属IgG亚类,轻链为λ链。结论:构建大容量人源天然Fab抗体库,从中获得了特异性抗精氨酸加压素人源Fab抗体片段,有望为临床上精氨酸加压素的快速检测技术的建立奠定基础。     

人噬菌体抗体库的构建及人源性bFGF抗体的筛选

目的选用含高效价碱性成纤维细胞生长因子(bFGF)抗体的自身免疫病患者外周血淋巴细胞为材料,构建人噬菌体抗体库,并从中筛选抗bFGF抗体克隆。方法收集自身免疫病患者外周血,提取淋巴细胞总RNA后逆转录得到cDNA第一链,经PCR扩增重链Fd段和轻链基因,分别构建到噬菌粒载体pComb3中,将重组噬菌粒载体电转化大肠杆菌XL1Blue,以辅助噬菌体VCSM13超感染,构建人噬菌体抗体库。经过3轮固相筛选,获得能结合bFGF的抗体克隆,并用ELISA进行进一步鉴定及筛选,获得具有高亲和力的抗bFGF噬菌体抗体克隆。结果构建的人源噬菌体抗体库库容为2.5×107,经3轮筛选获得具有bFGF特异性的Fab噬菌体抗体克隆。结论构建了人噬菌体Fab抗体库,并能够从中筛选出与bFGF特异结合的抗体克隆,为bFGF抗体药物研究奠定基础。     

全合成人源单骨架抗体库的构建及初步筛选

全套抗体库为制备抗任意抗原的人源抗体提供了来源,且具有重要的基础研究和应用价值。因此,构建高质量的抗体库一直是抗体工程研究的热点。全合成抗体库技术以其可控性、可操作性强,组成成分明确,设计灵活并能满足高通量筛选的要求等特点,得以迅速发展和广泛应用[1]。随着对抗体结构和功能认识的深入,人们越来越多地利用蛋白质工程手段进行优化设计,来提高抗体库中抗体分子的表达能力和稳定性,通过提高抗体库中功能性抗体的比例,从而有效地提高抗体库的质量。选用经过优化并具有某些特殊性质(如高稳定性、高表达性质)的抗体序列作为骨架,构…     

从大容量人源噬菌体抗体库中筛选抗黑素瘤特异性抗体

目的:用黑素瘤(MM)细胞系筛选大容量人源噬菌体抗体库,获得能与MM细胞特异性结合的人源性单链抗体(scFv)。方法:用完整的MM细胞对大容量人源噬菌体抗体库进行4轮“吸附-洗脱-扩增”筛选,并通过细胞ELISA法对随机挑选的克隆进行抗原结合活性测定,得到的阳性克隆进一步做DNA序列测定和免疫组化染色鉴定。结果:从80个随机挑选的克隆中,筛得1株抗MM细胞的抗体,该抗体对人的鳞癌细胞、角质形成细胞、黑素细胞、角蛋白、胰蛋白酶、转铁蛋白及小鼠IgG等细胞或抗原的结合反应均呈阴性。免疫组化染色显示,该抗体与MM细胞系Libr的染色呈阳性,对黑素细胞和痣细胞的染色呈阴性。DNA测序结果表明,该抗体VH属于人IgGVH5亚群,VL属于人Vκ亚型。结论:通过筛选噬菌体抗体库获得到1株抗MM细胞的特异性抗体,为MM的靶向治疗研究奠定了基础。     

从噬菌体抗体库筛选获得中和性人源抗甲型肝炎病毒Fab抗体

目的 研究人源抗甲型肝炎病毒基因工程抗体,为预防甲型肝炎病毒感染提供有效的方法。方法 采用噬菌体表面展示技术,从一名甲型肝炎恢复期病人的抗凝血中分离淋巴细胞,提取总ＲＮＡ逆转录后,用一组人ＩｇＧ Ｆａｂ特异性引物扩增。结果 克隆和表达了８株人源抗甲型肝炎病毒抗体Ｆａｂ段基因,经ＥＬＩＳＡ检测为特异性人抗甲型肝炎病毒Ｆａｂ段抗体。结论 该８株人源抗甲型肝炎病毒Ｆａｂ抗体都能与具有中和活性的鼠抗甲型肝炎病毒单克隆抗体产生竞争抑制反应,选其中的２株做体外中和实验,证明都有中和甲型肝炎病毒的活性。     

人源性噬菌体抗体库的构建和抗CEA抗体的筛选及表达

目的构建人源性噬菌体抗体库,筛选和表达人源性抗癌胚抗原(CEA)单克隆抗体。方法从结肠癌患者肠系膜淋巴结中的淋巴细胞克隆出免疫球蛋白Fd段和κ链基因,建成噬菌体抗体库。用人CEA对抗体库进行筛选,将得到的阳性克隆进行表达及检测。结果抗体库库容为5．2×106,Fab基因重组率为30％。ELISA及Western blot分析检测,证实表达出人源抗CEA单克隆抗体。DNA序列测定,证实所获基因为人免疫球蛋白可变区基因。结论成功构建噬菌体抗体库,从中获得人源性抗CEA的单克隆抗体。     

从大容量抗体库中筛选抗TNF-α人单链抗体

目的: 从天然的单链大容量噬菌体抗体库中筛选特异性的抗TNF-á的人单链抗体(scFv).方法: 以TNF-á为抗原, 通过 "吸附-洗脱-扩增"过程从大容量抗体库中筛选特异性抗体, 对其抗原结合活性和序列进行分析鉴定 .结果: 经过4轮筛选, 获得62个与TNF-á结合的阳性克隆, 其中27个特异性结合的克隆, 指纹分析有7种不同的可变区片段; 其中5种获得可溶性表达; 基因序列分析表明其轻重链分属VλⅠ和VHⅣ亚群.结论: 利用单链大容量抗体库技术可以不经免疫制备获得特异性抗TNF-á的scFv, 为今后的研究和应用提供依据.     

从大容量抗体库中筛选抗蓖麻毒蛋白抗体

目的:从天然的单链大容量噬菌体抗体库中筛选特异性的抗蓖麻毒蛋白的人源抗体.方法:将蓖麻毒蛋白固定在抗原管上,通过5轮“吸附-洗脱-扩增“过程从大容量抗体库中筛选到特异性抗体,并转染到HB2151菌中,经IPTG诱导,制备抗蓖麻毒蛋白的可溶性单链抗体.结果:经过5轮筛选,获得40个与蓖麻毒蛋白结合的阳性克隆,其中12个特异性结合的克隆,指纹分析有7种不同的可变区片段;经过基因测序,分析了可变区基因的亚群.并将其制备成可溶性的抗体.结论:利用单链大容量抗体库获得抗蓖麻毒蛋白的噬菌体抗体并且成功制备成可溶性抗体,为今后的研究和应用奠定基础.     

人源抗SARS病毒噬菌体抗体库的构建及筛选

目的: 构建人源抗SARS病毒的Fab片段抗体基因的噬菌体表面呈现文库, 筛选抗SARS病毒特异性的噬菌体抗体。方法: 用PCR扩增人Fab片段抗体基因, 连入载体pComb3内, 构建噬菌体抗体库。以固相化的SARS抗原淘筛抗体库, 并用ELISA检测噬菌体抗体结合SARS病毒的特异性。结果: 用PCR共扩增出 13条Ig基因片段。电转化构建的噬菌体抗体库的库容为 1. 3×106, Fab基因的重组率为60%。以纯化的SARS抗原淘筛 3轮, 特异性富集了抗SARS病毒的噬菌体抗体, 并用ELISA法从中筛选出了 10个结合活性好、特异性强的克隆。结论: 成功地构建了人源抗SARS病毒的组合抗体文库, 从中获得人源抗SARS病毒的特异性抗体。     

人源性噬菌体抗体库的构建及抗amylin抗体的初步筛选

目的:构建人源性噬菌体抗体库,从中筛选胰淀素(amylin)单克隆抗体(mAb),测定其特异性及抗原结合活性。方法:从正常健康人的外周血淋巴细胞中提取总RNA,用RT-PCR方法扩增人免疫球蛋白Fd段和轻链基因,构建噬菌体抗体库。酶切和PCR鉴定后,阳性克隆进行DNA测序分析。用人amylin抗原对抗体库进行筛选富集,将得到的阳性克隆进行Phage-ELISA鉴定,结果进行统计学分析。结果:最终构建的抗体库库容约为0.8×108,酶切鉴定显示有插入片段,抗体库重组率为70%。阳性克隆进行DNA测序证实所获基因为人免疫球蛋白可变区基因。以amylin抗原进行3轮筛选,抗体库得到特异性富集。阳性克隆进行Phage-ELISA检测证实有良好的抗胰淀素抗原的特异性。结论:成功构建了一个人源性噬菌体抗体库,为从中获得人源抗amylin的mAb奠定了实验基础。     

利用噬菌体抗体库制备人源性抗β2糖蛋白-Ⅰ抗体

目的： 制备人源性抗β2糖蛋白-Ⅰ（β2GPI）抗体Fab片段。方法: 以人β2GPI为抗原,从人源性天然抗体库中筛选特异性Fab抗体,并用ELISA方法对所获抗体进行抗原结合活性和特异性鉴定。结果: 通过4轮“亲和吸附-洗脱-扩增”筛选,获得2株抗β2GPI抗体。酶切去掉载体上的噬菌体基因III,得到了可溶性表达的Fab段。经过鉴定,所获抗体具有良好的抗原结合活性和特异性。结论: 利用人源性天然抗体库成功制备了2株抗β2GPI Fab抗体,为深入研究该抗体在抗磷脂抗体综合征发病机理中的作用和探讨新的治疗措施奠定了基础。     

人源性Fab段噬菌体抗体库的构建及抗人β1-AR抗体克隆的筛选

目的构建人源性Fab段噬菌体抗体库并筛选抗人β1-AR抗体克隆.方法通过RT-PCR从抗人β1-AR抗体阳性的扩张性心肌病(DCM)患者的外周血淋巴细胞中扩增出人IgG重链Fd段和κ、λ两轻链基因片段,将其克隆入噬粒pComb3中,构建人源性Fab段噬菌体抗体库,并利用噬菌体表面显示技术,以人β1肾上腺素受体细胞外第二环26肽(β1-ARECⅡ)为抗原肽,对此抗体库进行淘筛富集.结果成功地构建了库容量为1.4×106的人源性Fab段噬菌体抗体库,从此抗体库中筛选到了特异性抗人β1-AR Fab段噬菌体抗体阳性克隆.结论利用噬菌体抗体库技术可以获得表达抗人β1-AR抗体的重组克隆.     

抗转铁蛋白受体抗体的筛选和鉴定

目的:从全人源噬菌体抗体库中筛选抗转铁蛋白受体(TfR)的抗体。方法:从HeLa细胞中提取总RNA,分两段反转录TfR胞外区cDNA,经两轮PCR后,获得胞外区基因。测序正确后,将其插入表达载体pPROEXTMHTa中,并在E.coliBL21(DE3)中表达。目的蛋白通过NiNTA金属螯合层析柱进行纯化、复性。用复性的TfR包被免疫管,从库容为1013cfu/L的全合成人源噬菌体单链抗体库中,筛选抗TfR的抗体。结果:得到约1.9kb的TfR胞外区基因,该基因以包涵体的形式在大肠杆菌中表达;利用纯化、复性的TfR从抗体库中筛选到了8个可与人TfR特异性结合的单链抗体。结论:利用TfR在大肠杆菌表达的复性产物,可以筛选到与天然TfR特异性结合的单链抗体。     

人源抗丙型肝炎病毒噬菌体抗体库的构建及筛选

目的　构建人丙型肝炎病毒 (HCV)特异性噬菌体抗体库 ,制备人源抗HCV单克隆抗体 (mAb)。方法　用常规RT PCR法 ,直接从 5例丙型肝炎患者外周血混合淋巴细胞中 ,扩增抗体重链Fd基因和κ轻链基因 ,与噬菌体载体pComb3连接 ,构建噬菌体抗体Fab库。对抗体库进行 5轮吸附 -洗脱 -扩增的亲和选择后 ,以ELISA法鉴定抗HCV噬菌体抗体。结果　RT PCR可有效地扩增出Fd和κ基因 ,并以此构建成容量为 1 2× 10 7的噬菌体抗体库。经 5轮亲和选择可使特异性噬菌体抗体得到高度富集 ,抗HCV噬菌体抗体阳性克隆达 96 %。结论　抗HCV噬菌体抗体库的构建和人源抗HCVmAb的制备 ,为HCV感染的诊断、治疗和发病机制的研究提供有效的分子工具     

人源抗梭曼过渡态类似物(P6)的抗体筛选

目的:从大容量天然噬菌体抗体库中筛选抗梭曼过渡态类似物的人源单链抗体(scFv)并进行鉴定。方法:以膦酸梭曼水解过渡态类似物五配位-羟基膦酸酯,3-羟基-1-对硝基苯基甲膦酸单频哪基醇酯,为半抗原,通过吸附-洗脱-扩增过程从大容量天然噬菌体抗体库中筛选特异性抗体,对其抗原结合活性进行鉴定。结果:经过4轮的筛选,分别获得14个抗梭曼类似物的阳性克隆。经DNA指纹分析,判断所获克隆分别包含4个不同的抗梭曼类似物的scFv基因。结论:利用噬菌体抗体库技术获得了特异性的人源抗梭曼类似物抗体。     

人源性抗汉坦病毒抗体VH基因噬菌体表面展示文库的构建与筛选

目的 构建人抗汉坦病毒（HV）抗体重链可变区（VH）基因噬菌体表面展示文库,筛选人源性抗HV单克隆抗体（mAb）。方法 从HV吸附筛选的特异性人外周血B淋巴细胞中,用RT－PCR扩增VH基因,与噬菌粒pHEN1连接,构建VH基因噬菌体表面展示文库。经3轮吸附－洗脱－扩增的亲和筛选后,用ELISA鉴定抗HV噬菌体抗体的活性。结果 HV吸附筛选的特异性人外周血B淋巴细胞中,成功扩增出VH基因,并构建了VH基因噬菌体表面展示文库。经3轮亲和筛选,获得24个具有与HV结合活性的重组噬菌粒克隆。对其中一个克隆的VH基因（VH－D10）的序列分析表明,该基因的全长为363bp,编码121个氨基酸,与EMBL和GenBank中所有已知免疫球蛋白（Ig）基因进行同源性比较,其同源序列均人为IgVH原因。结论 成功地构建了人抗HV抗体VH基因噬菌体表面展示文库,并筛选到有HV结合活性的重组噬菌体克隆,为制备人源性抗HVmAb奠定了基础。     

抗SARS-CoV抗原的人源Fab段噬菌体抗体库的构建

目的 :利用抗SARS冠状病毒IgG抗体阳性的SARS康复患者外周血淋巴细胞 ,构建人源Fab段抗体文库。方法 :制备外周血淋巴细胞总RNA ,逆转录成cDNA。以其为模板 ,利用针对家族特异性Ig基因的引物扩增重链Fd段和轻链基因 ,并重组到噬菌粒载体pComb3中 ,将重组噬菌粒载体电转化大肠杆菌XL 1Blue,酶切鉴定抗体库的重组率 ,并测定噬菌体抗体库的库容量。结果 :构建了源于SARS康复患者血清中抗Fab段的抗体文库 ,轻链、重链Fd段基因的重组率分别为91%和 75 % ,库容量为 7.2 3× 10 7。结论 :成功地构建了抗SARS CoV抗原的人源Fab段噬菌体抗体库     

人源性bFGF单链抗体的筛选、表达及鉴定

目的 用重组人碱性成纤维细胞生长因子(rhbFGF)筛选大容量人源噬菌体抗体库,获得能与bFGF特异性结合的人源性单链抗体(scFv).方法 用rhbFGF对大容量人源噬菌体抗体库进行4轮"吸附-洗脱-扩增"筛选,并通过phage ELISA法对随机挑选的克隆进行抗原结合活性测定,得到的阳性克隆进一步进行原核可溶性表达及鉴定.结果 从104个随机挑选的克隆中,筛得39株抗bFGF的抗体,通过对抗体可变区基因进行多样性分析,发现存在8种不同抗体可变区基因,挑选其中8株phage ELISA显色最高的克隆进行酶切和测序鉴定,发现其中7株为正确的抗体基因序列,通过大肠杆菌成功的进行了scFv的可溶性表达,通过竞争ELISA发现其中一株scFv能够抑制bFGF与其高亲和力受体FGFR1βⅢC的结合.结论 通过筛选噬菌体抗体库获得到7株抗bFGF特异性抗体,其中一株抗体能够抑制bFGF与其高亲和力受体FGFR1的结合.