TNF-α对人脐静脉内皮细胞表达MCP-1及IL-8的影响

本研究探讨肿瘤坏死因子仪（TNF-α）刺激人脐静脉内皮细胞（HUVEC）后对细胞表达单核细胞趋化蛋白-1（MCP-1）和白介素-8（IL-8）的影响及其可能的分子机制。用RT—PCR的方法检测MCP-1和IL-8mRNA的表达,免疫荧光染色法检测HUVEC核内转录因子KB（NF-κBp65）的激活。结果表明：TNF-α刺激HUVEC后,细胞内MCP-1和IL-8mRNA的表达增强,且有时相性变化;IL-8mRNA表达8小时达到高峰,MCP-1mRNA表达12小时达到高峰。细胞核内NF-κBp65蛋白表达增强,在感染后0．5小时开始增加,1小时达峰值。然后,胞浆染色逐渐减弱,而核染色增强,表明转录因子NF-κBp65明显的核移位。结论：TNF-α刺激HUVEC后能增加细胞内MCP-1、IL-8mRNA和NF-κBp65蛋白质的表达,提示TNF-α可能通过NF-κB途径诱导血管内皮细胞MCP-1和IL-8等炎症介子的过度表达。     

脂多糖对人脐静脉内皮细胞蛋白C受体和核因子-κB表达的影响

目的:观察脂多糖(LPS)对人脐静脉内皮细胞蛋白C受体(EPCR)和核因子-κB(NF-κB)表达的影响.方法:分别在12、24、48 h采用逆转录聚合酶链反应(RT-PCR)、western-blot技术测定正常对照组、LPS组培养的人脐静脉内皮细胞EPCR mRNA、蛋白及NF-κB蛋白的表达.结果:与正常对照组比较,LPS(24、48 h)组EPCR mRNA,LPS(24 h)组EPCR蛋白含量均显著下降(均P<0.01),LPS(48 h)组EPCR蛋白含量亦显著下降(P<0.05);与LPS(24 h)组比较,LPS(12 h)组EPCR蛋白含量明显增高(P相似文献   

肿瘤坏死因子α刺激人脐静脉内皮细胞线粒体偶联因子6表达及其分子机制

背景:线粒体偶联因子6作为一种新的血管活性肽,参与了许多生理功能调节. 目的:探讨人脐静脉内皮细胞在肿瘤坏死因子α刺激下线粒体偶联因子6的表达及其分子机制.设计、时间及地点:分组对照观察,实验于2006-06/2007-03在南方医科大学附属珠江医院完成.材料:健康产妇足月分娩的脐带来源于南方医科大学附属珠江医院产科(产妇均签署知情同意书);肿瘤坏死因子α为北京邦定泰克生物有限公司产品;鼠抗人线粒体偶联因子6单克隆抗体为美国凤凰药业公司产品.方法:应用肿瘤坏死因子α(100～250 μg/L)刺激体外培养的人脐静脉内皮细胞.主要观察指标:以流式细胞术检测线粒体偶联因子6在细胞膜上的表达,以反转录-聚合酶链反应方法检测线粒体偶联因子6 mRNA不同时间的表达变化,以蛋白质印迹分析检测细胞核中N F -κB不同时间的表达变化,同时检测胞浆中IκBα的含量变化.结果: 肿瘤坏死因子α刺激人脐静脉血管内皮细胞膜表面线粒体偶联因子6表达增加,线粒体偶联因子6 mRNA表达增强,刺激1 h后线粒体偶联因子6 mRNA表达最强,1.5 h后回到原来水平,核内核因子κB含量在6 h明显增加,之后一直持续高水平状态,而胞浆中IκBα含量在6 h明显减少,之后一直持续低水平状态.结论:肿瘤坏死因子α刺激人脐静脉血管内皮细胞后,迅速活化核因子κB,启动线粒体偶联因子6的转录,线粒体偶联因子6 mRNA的表达增加,线粒体偶联因子6合成增加,导致线粒体偶联因子6在细胞膜表面表达增加.     

姜黄素抑制NRLP-3表达对抗肿瘤坏死因子α诱导的人血管内皮细胞炎症

背景：前期研究表明,姜黄素对细胞氧化应激炎症有重要作用。目的：拟进一步阐明姜黄素在血管内皮细胞病理性炎症反应中的生物学作用及机制。方法：以人血管内皮细胞为细胞模型,应用肿瘤坏死因子α（10μg/L）作为刺激因子,姜黄素（0,50,100μmol/L）孵育24 h作为干预治疗组。应用HRP标记的BSA检测内皮细胞通透性,应用罗丹明标记的鬼笔碱染色检测F-actin变化,酶联免疫吸附实验检测细胞分泌白细胞介素1β的变化,进一步通过免疫荧光染色检测细胞内核转录因子κB蛋白表达和转位;应用Western blot方法检测炎症小体相关基因NRLP-3和caspase-1的表达。结果与结论：HRP-BSA检测提示,姜黄素可呈剂量依赖性对抗刺激引起的血管内皮细胞通透性增加。同时,抑制F-actin应力纤维的形成。ELISA检测发现,姜黄素治疗后,可呈剂量依赖性抑制肿瘤坏死因子α刺激引起的血管内皮细胞白细胞介素1β分泌。同时,免疫荧光分析证实,肿瘤坏死因子α刺激后,对照组血管内皮细胞中核转录因子κB表达持续增高且发生明显的入核转位现象,而100μg/L姜黄素干预组细胞中炎症递质转录因子核κB表达定位无明显改变。Western blotting结果证实,炎症小体调控基因NRLP3和caspase-1表达在姜黄素干预组受到明显抑制。结果表明姜黄素可通过减少核转录因子κB的表达对抗肿瘤坏死因子α刺激引起的炎症小体活化和白细胞介素1β分泌,对抗细胞病理性炎症损伤发生。     

NF—κB decoy对人脐静脉内皮细胞组织因子表达及凝血因子Ⅶ激活抑制作用的研究

目的 用decoy策略调控核因子κB（NF-κB）调节组织因子（TF）表达及相应的因子Ⅶ（FⅦ）活化，探讨冠心病新的防治方法。方法 用流式细胞术检测NF－κB decoy对人脐静脉内皮细胞（HUVEC）的转染效率，用凝胶迁移率改变竞争实验证实NF－κB decoy的作用机制，用RT－PCR检测组织因子（TF）mRNA，流式细胞术检测HUVEC表面TF抗原，重组组织因子一期凝历法检测与HUVEC共孵育的血浆中活化因子Ⅶ（FⅦa)活性。结果 decoy能成功地转梁入HUVEC内，能与TF启动子的κB位点顺式作用元件竞争性结合转录因子，NF－κB，明显抑制肿瘤坏死因子α（TNFα）刺激的HUVEC TF mRNATF抗原表达及相应的FⅦa活性。结论 NF－κB decoy能通过抑制TF表达而抑制FⅦ的激活，为冠心病的防治提供新的思路。     

氧化型低密度脂蛋白诱导内皮细胞凋亡中前蛋白转化酶枯草溶菌素9与炎症因子的关系

目的 观察氧化型低密度脂蛋白(ox-LDL)诱导的人脐静脉内皮细胞(HUVECs)凋亡中前蛋白转化酶枯草溶菌素9(PCSK9)与炎症因子表达的关系。方法 用ox-LDL处理HUVECs 0小时、12小时、24小时、36小时、48小时,分别检测PCSK9、白细胞介素6(IL-6)、单核细胞趋化蛋白1(MCP-1)、基质金属蛋白酶9(MMP-9)、C反应蛋白(CRP) mRNA和蛋白的表达以及核因子-κB (NF-κB)核位移。Lipofectamine 2000转染PCSK9小分子干扰RNA(PCSK9 siRNA)进入HUVECs 6小时后,加入ox-LDL处理24小时,分别检测PCSK9、IL-6、MCP-1、MMP-9、CRP的表达以及NF-κB核位移。结果 随着ox-LDL处理时间的增加,PCSK9、IL-6、MCP-1、MMP-9、CRP mRNA的表达上调、NF-κB的核位移明显增加,以24小时表达(核位移)最明显,随后表达(核位移)逐渐减少(P<0.05);细胞培养上清液中IL-6、MCP-1、MMP-9、CRP蛋白的浓度随着时间的推移逐渐增加,48小时达到峰值,与0小时比较,48小时增加最明显(P<0.01)。siRNA组PCSK9、IL-6、MCP-1、MMP-9、CRP mRNA和蛋白的表达以及NF-κB核位移较阴性转染组明显降低(P<0.01)。结论 PCSK9 siRNA能够抑制ox-LDL诱导的HUVECs炎症因子的表达,PCSK9可能参与了炎症反应的调节。     

核因子κBp65特异性小干涉核糖核酸抑制肿瘤坏死因子α诱导大鼠关节滑膜细胞中一氧化氮合酶2和环氧合酶2的表达

目的:利用核因子κBp65特异性小干涉核糖核酸抑制肿瘤坏死因子α诱导的关节滑膜细胞中一氧化氮合酶2和环氧合酶2的表达,探讨基因治疗类风湿性关节炎的新方法。方法:实验于2005-03/2006-03在北京大学医学部中心实验室(国家级)完成。①实验材料:清洁级健康近交系SD大鼠10只;一氧化氮合酶2,环氧合酶2,3-磷酸甘油醛脱氢酶引物(由北京奥科生物公司合成);肿瘤坏死因子α(Sigma公司);核因子κBp65特异性小干涉核糖核酸和转染条件由北京大学运动医学研究所陈连旭博士提供。②实验干预:切取大鼠髋关节和膝关节的滑膜体外培养滑膜细胞。利用脂质体siPORTTMLipid将核因子κBp65特异性小干涉核糖核酸转染滑膜细胞,再加入肿瘤坏死因子α刺激。阴性对照为任意编码的小干涉核糖核酸,阳性对照为针对3-磷酸甘油醛脱氢酶的小干涉核糖核酸。③实验评估:提取滑膜细胞中的核蛋白,利用电泳迁移率试验检测核因子κB的活性;提取滑膜细胞的核糖核酸和总蛋白,利用反转录聚合酶链反应和蛋白质免疫印记法从信使核糖核酸和蛋白质两水平检测一氧化氮合酶2和环氧合酶2的表达。结果:①肿瘤坏死因子α和核因子κBp65特异性小干涉核糖核酸对核因子κB转录活性的影响:与正常滑膜细胞相比,肿瘤坏死因子α可以显著提高核因子κB的结合能力,而事先转染小干涉核糖核酸48h,再用肿瘤坏死因子α刺激,核因子κB的结合能力又显著降低。②核因子κBp65特异性小干涉核糖核酸对核因子κB下游因子的影响:在培养的滑膜细胞中,肿瘤坏死因子α可以显著增加一氧化氮合酶2和环氧合酶2的表达;在转染小干涉核糖核酸抑制核因子κBp65的表达后再用肿瘤坏死因子α刺激,一氧化氮合酶2和环氧合酶2的表达被抑制。结论:①核因子κBp65特异性小干涉核糖核酸可降低肿瘤坏死因子α诱导的滑膜细胞中核因子κB的转录活性,抑制其下游因子一氧化氮合酶2和环氧合酶2的表达。②核因子κBp65特异性小干涉核糖核酸可用于基因治疗类风湿性关节炎的试验研究。     

黄芪甲苷对缺氧/复氧损伤人脐静脉内皮细胞与中性粒细胞黏附能力及细胞核转录因子κB表达的影响

目的:采用人脐静脉内皮细胞缺氧复氧模型模拟器官组织缺血-再灌注所诱导的血管改变,观察黄芪甲苷对缺氧/复氧损伤血管内皮细胞与中性粒细胞黏附及细胞核转录因子κB表达的干预作用.方法:实验于2005-0912006-05在青岛大学医学院附属医院脑血管病研究所细胞生物工程实验室进行.①实验材料:新生儿脐带(由青岛大学医学院附属医院妇产科提供,产妇及其家属知情同意,实验符合赫尔辛基宣言中的伦理学标准).②实验过程及分组:人脐静脉内皮细胞原代培养,传至3代后,随机分为3组.对照组:常规培养:缺氧/复氧组:先缺氧处理1 h,再复氧1 h;药物干预组:在培养液中加入终浓度分别为20,40,80 mg/L的黄芪甲苷预处理,12 h后进行缺氧/复氧处理.③实验评估:分别用硫代巴比妥法和酶联免疫吸附试验测定细胞培养液中丙二醛的含量和细胞间黏附分子1浓度:免疫化学法测人脐静脉内皮细胞核转录因子κB的表达:虎红染色法检测人脐静脉内皮细胞与中性粒细胞黏附.结果:①与对照组比较,缺氧/复氧组细胞培养液中丙二醛含量增多(P＜0.01);随着黄芪甲苷预处理剂量的增加,丙二醛含量降低(P＜0.01),呈剂量依赖性.②与对照组比较,缺氧复氧组人脐静脉内皮细胞核转录因子κB阳性细胞率、细胞培养液中细胞间黏附分子1浓度及中性粒细胞黏附率升高(P均＜0.01);随着黄芪甲苷预处理剂量的增加,核转录因子κB表达阳性细胞率、中性粒细胞黏附率下降(P＜0.05或P＜0.01),细胞间黏附分子1浓度减少(P＜0.01),呈剂量依赖性.结论:黄芪甲苷通过抑制缺氧复氧引起的血管内皮细胞核转录因子κB表达,减轻血管内皮细胞与中性粒细胞黏附,对缺氧/复氧损伤血管内皮细胞具有保护作用,且呈剂量依赖性.     

白藜芦醇联合间充质干细胞改善损伤内皮细胞的代谢记忆效应

背景：自藜芦醇联合间充质干细胞是否能够进一步改善高糖诱导内皮细胞产生的不良记忆目前鲜有报道。目的：验证不同浓度的白藜芦醇联合问充质干细胞对高糖诱导人脐静脉内皮细胞损伤代谢记忆效应的保护作用。方法：将人脐静脉内皮细胞分为10组：正常对照组、甘露醇对照组、高糖组、白藜芦醇低剂量组（0．1μmol／L）、白藜芦醇中剂量组（1μmol／L）、白藜芦醇高剂量组（10μmol／L）、干细胞组、白藜芦醇低剂量＋干细胞组、白藜芦醇中剂量＋干细胞组及白藜芦醇高剂量＋干细胞组。分别于5．5mmol／L葡萄糖培养第1,4,6天收集细胞培养上清液、提取细胞核蛋白,应用ELISA法检测细胞培养上清中血管细胞黏附分子1、单核细胞趋化蛋白1、纤溶酶原激活剂抑制剂1的表达水平,以Westernblot法检测细胞内核因子KB的蛋白水平。结果与结论：与正常对照组相比,高糖可诱导内皮细胞核因子KB表达上调,同时血管细胞黏附分子1、单核细胞趋化蛋白1和纤溶酶原激活剂抑制剂1水平升高,且在糖浓度恢复正常后仍持续上升。与高糖组相比,白藜芦醇及其联合干细胞干预后可以使内皮细胞核因子KB表达及血管细胞黏附分子1、单核细胞趋化蛋白1和纤溶酶原激活剂抑制剂1水平呈白藜芦醇剂量依赖性降低。干细胞组上述指标与高糖组比差异无显著性意义,甘露醇组与正常对照组相比差异无显著性意义。结果提示白藜芦醇可能通过核因子KB通路降低血管细胞黏附分子1、单核细胞趋化蛋白1和纤溶酶原激活剂抑制剂1水平,改善高糖代谢记忆效应介导的内皮细胞损伤。而间充质干细胞发挥内皮细胞保护作用可能不仅有赖于核因子KB通路。     

核因子-κB、肿瘤坏死因子-α在糖尿病大鼠膀胱的表达及相互关系的研究

[目的]观察糖尿病大鼠膀胱组织的病理改变,检测核因子-kBp65、肿瘤坏死因子-α表达的变化,并探讨两者关系.[方法]采用右下腹腔内一次性注射链脲佐菌素60 mg/kg诱导Wistar大鼠糖尿病模型26只,分别于成模后1、3、6个月观察膀胱组织的病理改变,检测核因子-κBp65、肿瘤坏死因子-α表达变化.[结果]随糖尿病病程延长,膀胱组织发生病理改变,核因子-κBp65、肿瘤坏死因子-α表达显著增强,两者呈正相关.[结论]核因子-KBp65、肿瘤坏死因子-α与糖尿病膀胱的病理、功能改变相关.