转染survivin对HLF细胞增殖及凋亡的影响

 【【目的】 探讨survivin基因表达对人肺纤维母细胞（humanlungfibroblast，HLF）增殖、凋亡的影响。【方法】 构建survivin基因真核表达质粒peDNA3．1／SVN；利用脂质体转染法将其转入不表达survivin mRNA的HLF细胞系。连续培养10周。筛选出稳定表达的阳性克隆（HLF／SVN）及转空质粒对照（HLF／K）。用RT-PCR、免疫组化、Western blot检测细胞中survivin、bel-2和caspase3mRNA表达：通过观察细胞生长曲线、细胞凋亡指数。探讨转染survivin基因对HLF细胞生长、凋亡的影响。【结果】转染peDNA3．1／SVN后。在4、6、8和10周HLF／SVN细胞查见survivinmRNA表达；免疫组化和Westernblot见HLF／SVN细胞survivin阳性表达；转染后caspase3mRNA受到抑制，表达减弱或消失。HLF／SVN细胞凋亡指数（0．3％、1．0％、1．5％）皆低于HLF（0．9％、4．3％、2．1％）及HLF／K（0．8％、1．4％、2．8％）。细胞生长曲线示HLF／SVN细胞生长快于HLF和HLF／K，差异有统计学意义（P〈0．05）。【结论】survivin基因能促进HLF细胞生长。可能通过抑制凋亡和促进细胞分裂而发挥作用。     

3种不同的survivin siRNA对EJ28细胞增殖和凋亡的影响

目的 观察靶向survivin的不同siRNA对EJ28细胞增殖和凋亡的影响.方法 通过化学合成方法合成3对siRNA和1对荧光标记的阴性对照siRNA.转染荧光标记的siRNA后,在荧光显微镜下观察转染效率.实验分为siRNA164、siRNA167、siRNA389、阴性对照组、脂质体对照组和细胞对照组.转染后24、48 h和72 h,MTT法检测siRNA对EJ28细胞增殖的影响,流式细胞术检测凋亡率.结果 靶向survivin的序列特异性siRNA均能抑制EJ28细胞的增殖,其中以siRNA164抑制细胞的增殖能力最强(P＜0.05),转染48 h后的抑制率最高[(41.32±2.54)%];转染48 h后,siRNA164组凋亡率最高[(13.20±0.25)%].结论 靶向survivin的RNAi技术在膀胱癌的基因治疗中可能具有一定的价值.     

抑制survivin基因表达对肺腺癌A549细胞增殖和凋亡的影响

目的研究survivin基因与肺腺癌的关系,探讨survivin对肺腺癌A549细胞增殖和凋亡的影响。方法合成抑制survivin基因的siRNA,通过脂质体转染到肺腺癌A549细胞中,荧光倒置显微镜下观察细胞形态学变化,流式细胞仪检测各组细胞增殖和凋亡指数,Western blot检测survivin编码表达的蛋白,RT-PCR检测survivin mRNA的表达。结果抑制survivin在肺腺癌A549细胞中的表达后,能够抑制A549细胞增殖,诱导细胞的凋亡,survivin基因编码表达的蛋白明显减少。结论应用RNAi抑制survivin基因,可以抑制A549细胞增殖,促进细胞凋亡。survivin能作为治疗肺腺癌的一个潜在的基因靶点。     

RNA干扰survivin基因对宫颈癌细胞中survivin蛋白表达及caspase-3酶活性的影响

目的观察RNA干扰survivin基因对宫颈癌细胞中survivin蛋白表达及caspase－3酶活性的影响。方法针对survivinmRNA序列设计合成3对编码小干扰RNA（siRNA）的DNA模板,构建shRNA重组质粒,转染Hela细胞,筛选获得转染效率最高的阳性克隆,阴性对照为阳性克隆随机打乱序列。Westernblot方法检测survivin蛋白表达,分光光度法检测caspase－3酶活性。结果干扰48h时,siRNA－168载体干预组干预效果最好,siRNA阳性质粒干扰组（实验组）survivin蛋白表达量为阴性对照组中survivin蛋白表达量的13％,是空白组survivin蛋白表达量的16％。干扰后caspase－3活性表达升高,实验组与阴性对照组、实验组与空白组相比差异均有统计学意义（P〈0．05）。结论siRNA可有效抑制Hela细胞survivin蛋白表达。升高caspase－3酶活性。     

靶向survivin基因siRNA对喉癌细胞增殖、凋亡的影响

目的观察靶向survivin基因的siRNA对喉癌细胞Hep-2增殖和凋亡的影响,为喉癌的基因治疗提供有效靶点及技术。方法使用阳离子脂质体LipofectamineTM2000将靶向survivin基因的siRNA转染至喉癌细胞株Hep-2;MTT[3-（4,5-二甲基噻唑-2）-2,5-二苯基四氮唑溴盐]法检测对喉癌细胞Hep-2增殖的影响;RT-PCR检测喉癌细胞Hep-2survivin基因mRNA表达的变化;Western Blot检测survivin基因蛋白表达;流式细胞技术检测喉癌细胞Hep-2凋亡情况。结果各浓度survivin-siRNA转染组细胞增殖抑制率和凋亡率均明显高于对照组（〈0.05）,survivinmRNA和蛋白表达有不同程度减弱,并且有明显的浓度依赖性,随着浓度的上升表达率下降。结论利用RNA干扰技术沉默survivin基因表达可以显著抑制喉癌细胞Hep-2细胞增殖,并在一定程度上诱导其自发凋亡,不同浓度survivin-siRNA转染能下调survivinmRNA和蛋白表达,靶向survivin基因的RNA干扰技术在喉癌的基因治疗中具有一定价值。     

抑制survivin表达对前列腺癌细胞pc-3凋亡的影响

[目的]研究survivin与前列腺癌的关系,探讨survivin对前列腺癌细胞pc-3凋亡的影响及其机制。 [方法]运用RNA干扰技术阻断survivin在前列腺癌细胞pc-3中的表达,采用流式细胞计数等方法检测survivin 被阻断后,对前列腺癌细胞pc-3凋亡的影响。[结果]阻断survivin在前列腺癌细胞pc-3中的表达后,能够引起 pc-3细胞的凋亡,其机制可能是由于活化了凋亡通路的caspase-3。[结论]Survivin可以做为治疗前列腺癌的一个潜在的基因靶点。     

hCAP-18/LL-37基因转染对Lewis肺癌细胞增殖及凋亡的影响

目的:观察人源抗菌肽hCAP-18/LL-37基因转染对Lewis肺癌细胞增殖的抑制作用,探讨其抗肿瘤的可能机制。方法:将含hCAP-18/LL-37的真核表达质粒瞬时转染Lewis肺癌细胞,同时设正常对照组、转染空载体组和转染重组基因组,MTT比色检测Lewis肺癌细胞转染后48和72 h的增殖活性,流式细胞术和荧光染色检测细胞凋亡。免疫细胞化学染色检测Bax、Bcl-2蛋白表达。结果：转染重组基因组Lewis细胞增殖受到明显抑制,与转染空载体组比较,转染后48和72 h的抑制率分别为3.51%和17.65%;流式细胞术检测转染重组基因组凋亡率为7.4%,正常对照组凋亡率为4.4%,转染空载体组凋亡率为5.2%;免疫细胞化学染色,转染重
组基因组Lewis细胞Bax蛋白表达增加,与对照组比较差异有显著性(P<0.05);Bcl-2蛋白表达减少,但与对照组比较差异无显著性(P<0.05)。结论：hCAP-18/LL-37基因瞬时转染Le
wis肺癌细胞,可抑制肿瘤细胞生长、调控凋亡相关基因Bax、 Bcl-2表达,诱导肿瘤细胞凋亡。     

脂质体转染survivin siRNA对A549细胞增殖及凋亡的影响

目的:探讨脂质体转染survivin siRNA 对人肺腺癌A549细胞增殖、凋亡的影响.方法:人工合成抑制survivin基因的siRNA片段,通过脂质体转染到A549细胞内,倒置荧光显微镜下观察细胞形态学变化;用四氮唑盐(M1Tr)法观察转染后24h,48h,72h对细胞增生的影响;流式细胞术检测各组细胞周期变化和凋亡指数;RT-PCR检测survivin mRNA的表达.结果:转染siRNA后的A549细胞,细胞增殖受到显著抑制,细胞明显出现凋亡,survivin基因mRNA表达显著下降.结论:应用RNA干扰靶向抑制survivin基因可以显著抑制A549细胞增殖,促进细胞凋亡.survivin可能成为肺癌基因治疗的一个新靶点.     

乙肝病毒X基因的转染及表达对HL-7702肝细胞凋亡的影响

目的 探讨乙肝病毒(HBV)X基因及其蛋白产物HBxAg对肝细胞HL-7702凋亡的影响，阐释HBVX基因及产物在包括肝细胞癌(HCC)的HBV感染相关疾病中的作用。方法 用分子克隆方法构建HBVX基因重组质粒pcDNA3-X，并用脂质体转染法将其导入肝细胞HL-7702中，G418选择培养，RT-PCR鉴定以构建稳定表达HBVX基因的肝细胞株HL-7702／HBx．以转染空质粒pcDNA3的HL-7702(HL-7702／pcDNA3)和未转染的HL-7702作对照，用流式细胞分析，TUNEI．技术和电镜来分析细胞凋亡情况。用pcDNA3-X瞬时转染肝细胞HL-7702，在转染后24．48，72．96，120h，分别抽提RNA后用RT-PCR法对HBVX基因表达进行半定量检测，并对不同时段的转染细胞行流式细胞分析探讨肝细胞凋亡的状况。结果 重组质粒pcDNA3-X转染后经G418筛选，肝细胞株HL-7702／HBx经RT-PCR鉴定证实有稳定表达HBVX基因；流式细胞、TUNEL技术显示HL-7702／HBx细胞凋亡明显高于HL-7702／pcDNA3和HL-7702．电镜报告HL-7702／HBx细胞出现凋亡现象．有凋亡小体，对照组未发现；瞬时转染RT-PCR显示转染后72hHBVX基因表达量最高，流式细胞仪分析发现肝细胞凋亡于72h达到最高值，之后随着X基因表达量下降，肝细胞凋亡减少。结论 HBVX基因及其蛋白产物X蛋白有促进HL-7702肝细胞凋亡的作用．二者间存在着量效关系．即X基因表达越高，肝细胞凋亡越明显。HBxAg通过调控肝细胞凋亡在肝细胞的恶性转化中起重要作用。     

靶向抑制survivin对胰腺癌细胞增殖和凋亡效应的影响

目的 探讨反义survivin—脂质体复合物对胰腺癌细胞增殖和凋亡效应的影响及机制,为胰腺癌及survivin阳性肿瘤的治疗提供理论依据。方法 用脂质体介导survivin反义寡核苷酸转染胰腺癌细胞系PANC—1细胞;通过RT—PCR、Western印迹试验检测survivin表达水平;MTY法测量细胞生长情况;流式细胞术测定caspase—3活性及凋亡率;电镜观察细胞形态学变化;应用激光共聚焦显微镜免疫荧光分析法评价脂质体反义复合物在亚细胞水平对survivin蛋白分子的影响。结果 反义survivin脂质体复合物有效下调survivin表达水平,并呈剂量依赖关系,IC50值为300nmoL／L,最大效应浓度为500nmoL／L,此时表达水平下调了80％。类似细胞生长抑制结果为MTY实验所证实。与此同时,caspase—3活性和凋亡率随转染时间延长而逐渐递增,并出现凋亡形态学变化,如胞浆空泡变性、核浓缩和核碎裂。免疫荧光分析,标记有FITC—绿荧光染色的survivin蛋白分子在未转染的细胞浆中清晰可见,并呈“斑点”状分布;而在转染细胞中几乎没有发现,但是符合细胞凋亡的形态学特征。结论 靶向抑制联系细胞增殖和凋亡的关键分子—survivin在胰腺癌治疗中有良好的应用前景。     

pcDNA3.1-FKBP12.6基因表达载体的构建及扩增

目的构建并扩增pcDNA3.1-FKBP12.6基因表达载体。方法目的基因全基因合成,PCR加入酶切位点,连接入pGEM-Teasy载体,经酶切鉴定及测序后获得测序正确的目的基因。连接入真核表达载体pcDNA3.1(-),再经酶切鉴定及测序后进行pcDNA3.1-FKBP12.6的扩增。结果成功构建并扩增pcDNA3.1-FKBP12.6基因表达载体。结论pCDNA3.1-FK-BP12.6表达载体的构建,为深入研究FKBP12.6基因对心肌细胞结构和功能的影响奠定基础,进而为探索安全、高效的心肌功能异常的治疗提供新的途径。     

硒对紫外线诱导HLF细胞凋亡的保护作用

目的：探讨紫外线诱导人HLF细胞凋亡时DNA降解特点，以及硒对紫外线诱导细胞凋亡的保护作用。方法：紫外线分别照射体外培养的人肺成纤维细胞3min和5min，同时添加亚硒酸钠（8ng/ml），设立对照组。利用吖啶橙荧光染料染色鉴定凋亡细胞，利用琼脂糖凝胶电泳检测DNA ladder。结果：紫外线可以诱导人肺成纤维细胞（28代）凋亡，作用存在时间效应关系。紫外线诱导人肺成纤维细胞凋亡时，未出现典型的DNA ladder现象。硒对于紫外线诱导的细胞凋亡有显著的抑制作用。结论：DNA ladder不能作为细胞凋亡的唯一的标志，紫外线诱导的细胞凋亡与DNA ladder的出现并不总是一致的。硒具有拮抗紫外线诱导的细胞凋亡作用。     

成纤维细胞激活蛋白及其突变体真核表达质粒的构建及鉴定

目的：构建并鉴定人成纤维细胞激活蛋白（ FAPα）真核表达质粒pcDNA－wFAPα（野生型FAPα）、pcDNA－tFAPα（胞外段FAPα）和pcDNA－mFAPα（缺失624～704位氨基酸的突变型FAPα）。方法以口腔癌组织总RNA为模板,采用RT－PCR方法扩增wFAPαcDNA基因片段,连接至真核表达质粒pcDNA3．1（＋）获得重组pcDNA－wFAPα质粒。以重组 pcDNA －wFAPα为模板,扩增 tFAPα基因片段;用 overlap PCR 技术,获得mFAPα基因;分别连接至pcDNA3．1（＋）获得重组pcDNA－tFAPα和pcDNA－mFAPα质粒。结果酶切鉴定和测序验证皆显示pcDNA－wFAPα、pcDNA－tFAPα和pcDNA－mFAPα为正确重组质粒。结论成功构建人野生型FAPα（ wFAPα）、胞外段FAPα（ tFAPα）和突变型FAPα（ mFAPα）真核表达质粒,为进一步研究FAPα在口腔鳞癌发病过程中的分子机制奠定基础。     

细胞凋亡因子survivin与男性不育症

细胞凋亡是生精过程中的一个普遍现象,它的失调与男性不育症有着密切关系。survivin是一种细胞凋亡抑制蛋白,它在细胞分裂时调控细胞凋亡,不仅在人类肿瘤组织中普遍过度表达,而且表达于人类的正常睾丸组织中。不断有研究显示survivin是精子发生过程中的一个潜在的分子标志物,它的表达在生精障碍的患者中有明显改变。本文就survivin与男性不育症的关系作一综述。     

肺癌组织中p63和Survivin蛋白的表达及其意义

[目的]研究p63和survivin两种蛋白在肺癌组织中的表达及其临床意义。[方法]通过免疫组织化学染色检测77例肺癌组织和10例非肿瘤性肺组织中的p63和survivin两种蛋白的表达及其与肺癌的组织类型、分化程度、复发转移和预后的关系。[结果]①10例非肿瘤性肺组织中,仅在支气管的假复层柱状上皮中见到P63的表达,未见survivin表达。②肺癌组织中p63的阳性细胞百分数为(51.7±32.7)％;其在无淋巴结转移组的阳性细胞百分数明显较淋巴结转移组低(P=0.010);p63的阳性细胞百分数与肿瘤大小、组织类型、分化程度、临床分期、复发和预后均无关(P>0.05)。③肺癌组织中survivin的阳性表达率为53.2％;其在复发组和淋巴结转移组的阳性表达率均明显高于无复发组和无淋巴结转移组(P=0.025和0.015);survivin(++～+++)组的生存期明显较(-～+)组短。[结论]p63和survivin均与肺癌的发生发展有关,survivin尤其与肺癌的复发、淋巴结转移有着密切关系,它的高表达提示肿瘤患者预后不良。     

pcDNA3.1(+)/ATP7B对TX小鼠成纤维细胞铜代谢的影响

[目的]研究Wilson病野生型基因ATP7B cDNA真核表达载体pcDNA3.1( )/ATP7B对TX小鼠成纤维细胞铜代谢的影响.[方法]构建人Wilson病野生型基因ATP7B cDNA的真核表达载体pcDNA3.1( )/ATP7B.随机选取TX小鼠20只构建TX小鼠的成纤维细胞模型,平行分成3组,一组未加质粒,另两组分别加入等量pcDNA3.1( )和pcDNA3.1( )/ATP7B,观察对细胞模型铜代谢的影响.并进行免疫组化实验以观察表达是否增强.[结果]实验前未加质粒组,加入pcDNA3.1( )组与加入pcDNA3.1( )/ATP7B组细胞内铜含量分别为(78±20),(77±17),(75±13)ng/mg;实验后分别为(76±20),(74±13),(40±10)ng/mg.与未加质粒组和加入pcDNA3.1( )相比,加入pcDNA3.1( )/ATP7B组的细胞内铜含量显著下降(P皆＜0.01),其细胞内ATP7B蛋白的表达明显增强.[结论]Wilson病真核表达载体pcDNA3.1( )/ATP7B在TX小鼠成纤维细胞水平上确有排铜作用.     

得力生诱导肺癌细胞株A549细胞凋亡及其对survivin基因表达的影响

目的探讨中成药得力生诱导肺癌细胞株A549细胞凋亡及其对survivin基因表达的影响。方法采用MTT法测定细胞增殖抑制率,在显微镜下观察细胞凋亡的形态特点,应用流式细胞仪检测细胞凋亡率,采用逆转录聚合酶连反应（RT—PCR）法测定survivin mRNA的表达。结果（1）得力生在4mL／L-100mL／L浓度范围内可抑制A549细胞增殖,此作用与药物体积浓度无明显相关关系,但该作用具有时间依赖性（r=0．991,P=0．001）。（2）20mL／L浓度的得力生在体外可诱导A549细胞凋亡,且其作用具有时间依赖性（r=0．997,P=0．049）。（3）RT—PCR结果显示,得力生可明显抑制A549细胞中表达survivin,与对照组相比,差异具有统计学意义（r=4．333,P〈0．05）。结论得力生可抑制A549细胞增殖,诱导A549细胞凋亡,其作用机制可能与抑制survivin基因表达有关。     

miR-181a真核表达载体的构建及鉴定

目的: 构建miR-181a真核表达载体,获得食管癌细胞TE11在其中稳定表达的细胞系,为研究miR-181a的功能以及其在食管癌细胞TE11中的作用机理奠定基础。方法: 根据miR-181a成熟序列在基因组中的位置及其上下游250个碱基序列,以293T细胞基因组DNA为模板设计PCR引物,扩增包含miR-181a前体的序列,连接到线性化的pMD18-T Simple载体中,经BamHⅠ和EcoRⅠ双酶切后亚克隆到pcDNA3. 1 ( + )中,并对重组质粒进行双酶切和测序分析;鉴定完全正确的重组质粒转染食管癌细胞TE11,用G418 ( 350 mg/L )筛选4周获得miR-181a稳定表达细胞系TE11-miR-181a,提取TE11-miR-181a细胞总RNA,用real-time PCR鉴定pcDNA3. 1 ( + )-miR-181a可在真核细胞中稳定过表达。结果: 成功构建了miR-181a的真核表达载体,并获得了在TE11细胞中稳定表达重组质粒的细胞系TE11-miR-181a。结论: miR-181a真核表达载体在食管癌细胞TE11中稳定高表达,为进一步研究miR-181a在食管癌细胞TE11中的功能及基因调控机制奠定了基础。     

Gadd45a表达质粒的构建及在人类T细胞中的表达

目的:构建Gadd45a表达质粒,并诱导该质粒在人类T细胞中的表达.方法:采用反转录PCR法从人胚胎干细胞中扩增Gadd45a的蛋白质编码框,将之克隆至pcDNA3.1载体后,利用电穿孔方法将构建好的表达质粒pcDNA3.1-Gadd45a和空白质粒pcDNA3.1分别转染至Jurkat细胞或正常人CD4+T细胞,分别...