IL-2+IL-15组合培养方案对乳腺癌患者外周血中NK细胞体外扩增的效果

目的：观察IL-2+IL-15组合体外培养方案对于NK、NKT和T细胞亚群的比例、表型、杀伤肿瘤细胞活性与黏附活性的影响,并初步探讨其作用机制。方法：采集天津医科大学附属肿瘤医院生物治疗科2012年5月至2012年7月期间收治的5例乳腺癌患者的外周血单个核细胞（peripheral blood mononuclear cell,PBMC）,用IL-2+IL-15 联合培养方案进行培养,观察培养15 d后细胞的扩增倍数和淋巴细胞亚群比例变化,流式细胞术检测细胞免疫表型、细胞表面受体的表达,LDH释放法和CD107a释放法检测不同细胞亚群对于HLA匹配或不匹配的靶肿瘤细胞系的杀伤活性,活细胞工作站检测总扩增产物对于不同靶肿瘤细胞系的黏附作用。结果：与扩增前相比,IL-2+IL-15培养方案扩增15 d后,NK细胞\[（36.74±1710）% vs （16.34±3.12）%,P<0.05\]、NKT细胞\[（24.88±12.34）% vs （4.06± 2.05）%,P<0.05\]比例显著增加,CD4+ T细胞和Treg细胞比例显著降低（P<0.05）,CD8+ T细胞比例显著升高（P<0.05）;NK细胞表面活化受体NKp30\[（ 92.38±7.19）% vs（32.14±17.64）%,P<0.05\]、NKp44\[（74.26±16.28）% vs（1.94±1.60）%,P＜0.05\]、NKG2D \[（ 98.58±128）% vs（6650±24.84）%,P<0.05\] 的表达率均显著升高,CD16表达率显著降低\[（ 85.12±7.66）% vs（95.60±253）%,P<0.05\]; NKT细胞、T细胞表面活化受体DNAM-1和NKG2D明显升高（P<0.05）。总扩增产物、NK细胞和NKT细胞对HLA不匹配的靶肿瘤细胞的杀伤率均显著高于HLA匹配靶细胞系的杀伤（P<0.05）;在共孵育至84 min时,与HLA匹配的靶肿瘤细胞系相比,总扩增产物细胞与HLA不匹配的靶细胞系黏附结合数目显著增多\[（ 4.80±0.53） vs （2.25±035）个,P<0.05\]。结论：IL-2+IL-15组合方案在扩增NK细胞的同时,也能够有效扩增NKT细胞,即可以扩增CD56+细胞群。并且,扩增产物主要以不受HLA限制的NK细胞杀伤活性为主来杀伤肿瘤细胞。     

红景天提取物对Lewis肺癌小鼠移植瘤中CD4+CD25+Treg的抑制作用

目的： 观察红景天提取物（sachalin rhodiola rhizome extract,SRR）对Lewis肺癌小鼠移植瘤中CD4+CD25+调节性T细胞（regulatory T cell,Treg）的抑制作用,初步探讨其抑制肿瘤生长的机制。 方法： 建立小鼠Lewis肺癌移植瘤模型,随机分为3组：SRR组,紫杉醇（paclitaxel,PTX）阳性对照组和PBS组,记录各组小鼠移植瘤体积变化,计算抑瘤率并观察小鼠生存期。流式细胞术检测移植瘤组织中CD4+CD25+Foxp3+Treg的比例,荧光定量PCR 检测移植瘤组织中 Foxp3 和TGF-β mRNA的表达水平。 结果： 在建模第20天,SRR组小鼠移植瘤体积明显小于PBS组\[（719.6±2.4） vs （1030.5±3.1）mm3,P<005\],但与阳性对照PTX组无显著差异（P>0.05）。SRR组小鼠生存期较PBS组显著延长\[（36.0±1.0） vs （22.0± 2.0）d,P<0.01\],而与PTX组无显著差异（P>0.05）。SRR治疗组小鼠移植瘤组织中CD4+CD25+Foxp3+Treg占CD4+T细胞的比例显著低于PBS组\[（8.5±0.3）% vs （11.2±0.2）%,P<0.01\],但与PTX组无显著差异（P>0.05）。SRR组小鼠移植瘤组织中 Foxp3 mRNA \[（1.2±0.2) vs (2.1±0.2),P<0.05\]、TGF-β mRNA \[（1.2±0.1) vs (2.1±0.2),P<0.05\]表达均明显低于PBS组,而与PTX组无显著差异（P>0.05）。 结论： SRR可能通过下调肿瘤组织中CD4+CD25+Treg比例、 Foxp3 和TGF-β mRNA的表达,增强机体的抗肿瘤免疫应答。     

TLR1/2信号促CD8+T细胞功能及其机制

目的：探讨Toll 受体1/2(Toll like receptor 1/2, TLR1/2)信号对荷瘤小鼠来源的CD8+T细胞功能的影响及其可能机制。方法：利用小鼠Lewis肺癌细胞株3LL建立小鼠肺癌荷瘤模型,MACS分选小鼠脾CD8+T细胞;体外经PBS或TLR1/2激动剂BLP刺激后,Real-time PCR和流式细胞术分别从基因和蛋白水平检测CD8+T细胞的TLR分子表达;用ELISA和流式细胞术检测经PBS或BLP刺激后的CD8+T细胞分泌细胞因子和增殖的能力,并用关键信号分子抑制剂分析可能的分子机制。结果：与PBS对照组相比,TLR1/2激动剂BLP不但有效上调荷瘤机体CD8+T细胞TLR1和TLR2分子的基因水平\[TLR1：（0.353±0.015） vs （0101±0.017）,P<0.01;TLR2：（0.232±0.031） vs （0.080±0.004）,P<0.05\]及蛋白水平（P<0.05）,而且显著促进CD8+T细胞分泌功能性细胞因子\[IFN-γ：（2 375±305） vs （850±50）,P<0.05;IL-2：（1 600±200） vs （350±50）,P<0.05\]和增殖的能力（P<0.05）,这一效应依赖于NF-κB和P38通路。结论： TLR1/2信号直接作用于荷瘤小鼠的CD8+T细胞并促进其功能,该研究既丰富了TLR的作用范围,也为基于TLR激动剂的肿瘤生物治疗提供了实验依据。     

小白菊内酯抑制CD34+ CD38- KG-1a白血病细胞的增殖并增强其被allo-NK细胞杀伤的敏感性

目的：探讨小白菊内酯（parthenolide,PTL）对CD34+CD38- KG-1a白血病细胞的增殖、Bcl-2表达及其被同种异体NK（allo-NK）细胞杀伤敏感性的影响。方法：免疫磁珠法从KG-1a细胞中分离CD34+CD38- KG-1a细胞。XTT法检测PTL对CD34+CD38-白血病细胞增殖的影响,Real-time PCR和Western blotting分别检测PTL对CD34+CD38- KG-1a细胞Bcl-2 mRNA和蛋白表达的影响,LDH释放法观察PTL对CD34+CD38- KG-1a细胞被allo-NK细胞杀伤敏感性的影响。结果：PTL对CD34+CD38- KG-1a细胞增殖的抑制呈剂量（2.5~80 μmol/L)依赖性。PTL浓度为2.5 μmol/L时,PTL组CD34+CD38- KG-1a细胞的增殖抑制率显著高于对照组\[（4.89±1.07）% vs 0,P<0.01\];PTL杀伤CD34+CD38- KG-1a细胞的IC50为20 μmol/L;PTL组CD34+CD38-KG-1a细胞Bcl-2 mRNA \[（0.105±0.007）vs（0.307±0.013）,P＜0.01\]与蛋白表达均显著低于对照组。在效靶比为10∶1,20∶1和40∶1时,allo-NK细胞对PTL组CD34+CD38- KG-1a细胞杀伤率逐步升高,且均高于阴性（无PTL处理）对照组\[(19.76±1.01)%,(30.14±0.96)%和(51.48±3.15)% vs (12.50±1.42)%,(16.90±0.93)%和(31.70±1.53)%（均P<0.01）\];效靶比为40∶1时,allo-NK细胞对PTL组细胞的杀伤效率显著高于阳性（Bcl-2抑制剂ABT-737处理）对照组\[（51.48±3.15）% vs （43.08±2.81）%,P<0.05\]。结论：PTL能抑制CD34+CD38-KG-1a细胞的增殖并增强其被allo-NK细胞杀伤的敏感性,这可能与PTL下调Bcl-2的表达有关。     

CD40L+肺癌细胞抗原负载DC诱导同源肺癌免疫

目的：探讨CD40L+肺癌细胞抗原负载由人外周血单个核细胞（peripheral blood mononuclear cell,PBMC）诱导的DC对同源肺癌的免疫增强作用及其机制。方法：常规方法从正常成人外周血中分离PBMC、诱导分化成DC,以重组载体pDNA3.1-CD40L+转染A549肺癌细胞,制备已转染肺癌细胞抗原对DC进行负载刺激,通过流式细胞术检测DC的CD83、CD86及HLA-DR分子表达,ELISA法检测DC的IL-12分泌水平,再以MTT法检测DC对同源T淋巴细胞增殖状态以及A549肺癌细胞增殖影响,并与空载转染的A549细胞抗原诱导DC的相同功能进行对比。结果：将PBMC成功诱导分化出成熟的DC。重组CD40L诱导组DC的CD83、CD86及HLA-DR分子表达水平明显高于空载组\[(4.78±1.5）% vs （3.38±1.5）%、（9.79±5.27）% vs （5.53±2.17）%和 （11.84±8.31）% vs （537±5.48）%,均P<0.05\];IL-12分泌水平也高于空载组和未转染组（P<0.05)。CD40L+DC可促进T淋巴细胞的增殖(P<0.05),并导致同源T细胞对肺癌A549细胞增殖的抑制作用强于对照组、未转染组和空载组（P<0.05）。结论： CD40L转染肺癌细胞抗原诱导成熟的DC可以增强同源肺癌细胞的特异免疫能力。     

自体DC-CIK细胞治疗晚期肾细胞癌的疗效

目的：探讨自体树突状细胞（dendritic cell,DC）激活的细胞因子诱导的杀伤（cytokine-induced killer,CIK）细胞在晚期肾细胞癌（renal cell carcinoma,RCC）治疗中的临床效果与安全性。方法：采集22例2011年7月至2012年6月期间南京医科大学附属苏州医院肿瘤内科收治的22例RCC Ⅳ期患者\[男性12例、女性10例,中位年龄60.8岁（21~79岁）\]外周血单个核细胞（peripheral blood mononuclear cell,PBMC）,体外制备成DC-CIK细胞。流式细胞术分析DC-CIK细胞中CD3+T、CD8+T、CD4+T、NK（CD3-CD56+）和NKT（CD3+CD56+）细胞的比例,MTT法检测DC-CIK细胞对白血病K562细胞（对NK细胞敏感）和肾癌786-0细胞（对NK细胞不敏感）的杀伤活性。受试患者于常规治疗（手术+化疗+放疗/细胞因子治疗）结束后4周进行DC-CIK细胞治疗,每次静脉回输细胞数约（5.0±0.5）×108个,5次为1疗程,共3个疗程,分别于疗程开始前与结束后1周内监测患者外周免疫学指标（淋巴亚群、细胞因子谱）,严密观察并记录治疗过程中的不良反应。结果：DC-CIK细胞组成为CD3+细胞占（86.92±5.32）%、CD3+CD8+CD56+（NKT细胞）占（52.04±7.33）%、CD8-CD56+（NK细胞）占（785±315）%,DC-CIK细胞对786-0细胞和K562细胞的体外杀伤率相仿（效靶比为3∶1时,杀伤率分别为（16.5±1.7）%和（18.4±1.9）%,P=0.014）。患者接受DC-CIK细胞治疗后,外周血淋巴细胞亚群（CD3+T、CD4+T、CD8+T、CD3-CD56+NK细胞）比例无显著变化（P>0.05）;外周血中IL-2、IL-12和IFN-γ细胞因子水平较治疗前明显提升（均P＜0.05）,而TNF-α 和IL-10变化不明显（均P＞0.05）。2例患者发生一过性发热,持续4~6 h恢复,1例出现短期乏力。结论：DC-CIK细胞体外能有效杀伤786-0细胞和K562细胞。 输注后可提升部分RCC患者免疫水平,安全性良好,可作为晚期RCC患者辅助治疗之一。     

DC-CIK细胞治疗局部晚期和晚期胰腺癌患者的临床疗效

目的： 探讨树突状细胞（dendritic cell,DC）联合细胞因子诱导的杀伤（cytokine-induced killer,CIK）细胞治疗局部晚期和晚期胰腺癌的安全性和有效性。 方法： 采集2011年7月至2012年5月在解放军第81医院生物治疗科治疗的24例Ⅲ～Ⅳ期胰腺癌患者外周血单个核细胞（peripheral blood mononuclear cell,PBMC）,体外诱导培养DC和CIK细胞。DC经胰腺癌细胞株（PANC-1）裂解物致敏后与CIK细胞回输至胰腺癌患者,观察DC-CIK细胞治疗前后患者外周血淋巴细胞亚群、血清肿瘤标志物的改变以及临床疗效。 结果： DC-CIK细胞治疗3个月后,胰腺癌患者外周血CD3+T细胞、CD8+T细胞和CD4+CD25+Treg细胞比例均显著下降（均P<0.05）,CD4+/CD8+比值升高\[（1.1±0.7) vs (1.5±0.9),P<0.05\]。血清肿瘤标志物CA19-9在治疗后1个月\[（382.8±277.7) vs (213.8±214.6),P<0.05\]和治疗后3个月\[（213.8±214.6) vs (1540±118.2),P<001）持续下降。24例患者无1例完全缓解,其中3例部分缓解,4例疾病稳定,17例疾病进展;治疗有效率为125%,疾病控制率为29.2%;中位生存期为5.7个月,6个月生存率为33%,9个月生存率为27%。治疗期间所有患者均未出现 3～4级不良反应。 结论： DC-CIK细胞治疗局部晚期和晚期胰腺癌患者安全可行,可改善患者免疫功能并产生临床获益。     

肝癌Huh7干细胞样细胞的富集培养及鉴定

目的：建立一种体外有效富集、培养和鉴定具有肝癌干细胞特征的细胞亚群的方法。方法：采用成球培养法利用肿瘤干细胞样细胞（cancer stem cell, CSC）分化培养基对肝癌Huh7细胞进行富集培养,获得的干细胞样细胞于体外进一步扩增获得肝癌干细胞球。流式细胞术检测Huh7干细胞样细胞表面肿瘤干细胞标志物EpCAM、CD90和CD133的表达,平板克隆集落形成实验和裸鼠成瘤实验分别检测Huh7细胞和Huh7干细胞样细胞的克隆集落形成能力、体内成瘤能力。结果：Huh7细胞成球培养3~7 d后即可形成肝癌干细胞样细胞球,获得的干细胞样细胞具有自我更新和增殖能力,其EpCAM阳性细胞比例较Huh7细胞明显增加\[（99.6%±0.31）% vs（0.12%±0.05）%,P<0.01\],但两种细胞CD90\[(0.11%±0.06)% vs (0.09%±0.07)%, P>0.05\]和CD133\[(0.17%±0.08)% vs (0.15%±0.05)%, P>0.05]表达差异无统计学意义。Huh7干细胞样细胞克隆集落形成数量明显多于Huh7细胞\[（188.67±12.5）vs （79±16.7）个,P<0.01\];当接种量为5×104个细胞时,与接种Huh7细胞的对照裸鼠相比,接种Huh7干细胞样细胞的裸鼠成瘤时间更短（11 vs 30 d）,成瘤率更高（100% vs 16.67%）;接种5×105数量级的细胞时,实验组成瘤体积\[（171.90±10.94）vs（86.39±11.21）mm3, P<0.01\]和瘤体质量\[（2.98±0.82）vs（0.32±0.17）g, P<0.01\]均明显大于对照组。结论：利用成球培养法能够从Huh7肝癌细胞系中富集培养获得Huh7肝癌干细胞,其具有比Huh7细胞更强的成瘤能力。     

四种NK细胞体外扩增方案的比较

目的： 通过对4种NK细胞体外培养方案扩增后产物的细胞免疫表型、扩增倍数以及杀伤活性进行比较,确定一种高效的NK细胞体外扩增方案。 方法: 建立4种NK细胞体外培养方案：方案1为经典的NK细胞体外扩增方案(IL-2+IL-15);方案2为IL-2+IL-15+IL-18;方案3为IL-2+IL-15+IL-7;方案4为新型NK培养基（IL-2+OKT3）。收集天津医科大学附属肿瘤医院生物治疗科2012年2月至2012年4月间10例晚期实体瘤患者的PBMC,按照4种方案进行体外扩增。在体外扩增的0、5、10、15 d,采用流式细胞仪检测各淋巴细胞亚群（尤其是NK细胞）的比例;比较各方案体外扩增15 d后的NK细胞的扩增倍数、淋巴细胞亚群比例变化,并采用LDH法检测各方案扩增产物对人白血病K562细胞的杀伤活性。结果： 上述4种NK细胞培养方案体外扩增15 d后,细胞总数分别扩增（40.1±20.00）、（44.08±22.09）、（44.82±23.67）、（46.82±2502）倍,其中NK细胞的扩增倍数分别为（75.86±28.57）、（93.32±32.16）、（88.66±24.94）,（58.88±41.53）倍。NK细胞比例由0 d的（20.44±2.23）%分别扩增至15 d的（48.30±13.90）%、（54.72±12.25）%、（55.94±12.70）%和(54.5±14.93)%;各培养方案组在总细胞扩增倍数、NK细胞扩增倍数上的差异均无统计学意义（P>0.05）。前3种培养方案体外扩增产物的杀伤活性明显高于方案4\[（63.40±500）%、（77.30±9.40）%、（62.17±5.60）% vs （37.39±10.42）%,均P<005\],而方案1、2、3之间体外扩增产物杀伤活性的差异则无统计学意义（P>0.05）。 结论： 细胞因子组合对于体外大规模培养NK细胞有着一定的优势,但不同的细胞因子组合（方案1中是否加入IL-18或IL-7）对NK细胞体外大规模扩增的影响差异并不显著;但前3个方案扩增产物对K562细胞的杀伤活性明显强于方案4。     

自体CIK细胞治疗对恶性肿瘤患者免疫功能和生活质量的影响

目的：探讨自体细胞因子诱导的杀伤（cytokine-induced killer,CIK）细胞对恶性肿瘤患者免疫功能和生活质量的影响。 方法： 回顾性分析在我院经过CIK细胞治疗的58例恶性肿瘤患者临床资料,流式细胞仪检测患者治疗前后外周血CD3+、CD3+CD4+、CD3+CD8+、CD3-CD16+ CD 56+和CD3+CD16+ CD 56+细胞的表达水平;42例患者治疗前后采用世界卫生组织生活质量测定简表(WHOQOL-BREF)分别进行问卷调查;治疗过程中监测相关的不良反应。 结果： 患者CIK细胞培养液体取样标本中CD3+总T淋巴细胞、CD3+CD4+T辅助淋巴细胞以及CD3+CD8+T抑制淋巴细胞的亚群水平分别为（8279±11.98）%、（30.32±11.23）%和（49.10±11.65）%,CD4+/CD8+的比值为0.67±0.34,而CD3-CD16+CD56+NK细胞和CD3+CD16+CD56+CIK细胞亚群水平分别为（16.58±11.83）%和（13.74±8.66）%。与治疗前相比,治疗后的患者外周血中CD3+总T淋巴细胞亚群、CD3+CD4+T辅助淋巴细胞亚群、CD3+CD8+T抑制淋巴细胞亚群和CD3+CD16+ CD 56+CIK细胞亚群水平均明显升高(P<0.05),CD3-CD16+ CD 56+NK细胞亚群水平较治疗前下降(P<0.05)。经过CIK细胞治疗后,患者的生理、心理、社会关系和环境关系均得到很好的改善(P<0.05)。自体CIK细胞治疗过程中不良反应发生率低,均可控制。 结论： 自体CIK细胞治疗增强了患者的免疫功能,改善了患者的生活质量,且不良反应较轻。     

白细胞介素-27促进CIK细胞的增殖及其对淋巴瘤细胞的杀伤能力

目的： 初步探讨重组人白介素-27（interleukin-27, IL-27）体外对人外周血来源的细胞因子诱导的杀伤（cytokine induced killer,CIK）细胞增殖及其对肿瘤细胞的杀伤能力的影响。 方法:无菌条件下分离健康志愿者外周血单个核细胞（peripheral blood mononuclear cell,PBMC）,第0天加入IFN-γ、CD3单抗,之后根据加入不同细胞因子剂量随机分为六组进行CIK细胞培养：A组（IL-2：1 000 U/ml,正常对照组）, B组（IL-2：1 000 U/ml,IL-27：20 ng/ml）, C组（IL-2：1 000 U/ml,IL-27：10 ng/ml）, D组（IL-2：500 U/ml,IL-27：10 ng/ml）,E组（IL-2：1 000 U/ml,IL-27：5 ng/ml）, F组（IL-2：1 000 U/ml,IL-27：40 ng/ml）。倒置相差显微镜下观察各组CIK细胞生长情况,流式细胞术检测各组CIK细胞CD3 +CD56 +T、CD8 +T细胞的表达,自动细胞计数仪计数各组CIK细胞增殖情况,MTS方法测定各组CIK细胞对淋巴瘤K562细胞的杀伤活性。 结果： 培养第11天,D组与A、B、C组比较,CIK细胞中CD3 +CD56 +T细胞的表达\[（6657±244）% vs（6003±175）%,（5551±003）%,（5607±083）%;均P<005\]、CD8 +T细胞的表达\[（8167±197）%  vs（7030±267）%,（7492±247）%,（7443±190）%;均P<005\]都明显增强;D组CIK细胞培养的扩增倍数明显高于A、B、C组\[（4 81187±2307)  vs  (3 25773±9197), (379092±6449), (4 00985±4308)倍;均P<005\];效靶比40 ∶1时; D组CIK细胞培养第11天时杀伤力为（7671±221）%,显著高于其他各组（均P<005）。 结论： 细胞因子IL-27体外可显著提高CIK细胞的增殖能力和杀伤能力,最佳培养周期为11 d。     

K562工程细胞联合IL-2扩增方案对人NK细胞扩增和活化的效果

目的：评价新建立的K562工程细胞联合IL-2扩增方案对人NK细胞扩增和活化的效果。 方法：采集健康志愿者和肿瘤患者的外周血PBMC并分离NK细胞,采用前期构建的K562工程细胞(将IL-15、4-1BBL和IL-18在白血病K562细胞上进行跨膜表达获取）联合IL-2培养方案对NK细胞进行扩增和活化,以流式细胞术检测NK细胞的扩增效果和NK细胞表面受体表达水平,CCK-8法检测扩增后NK细胞对肿瘤细胞的杀伤活性和ADCC活性,CCK-8法检测在培养方案扩增末期加入TKD多肽对NK细胞的活化效果。结果：对于健康志愿者的NK细胞,新建立扩增培养方案可使NK细胞在PBMC中的比例提高至（93±3）%;使NK细胞中活化性受体NKG2D、CD94、NKp30、NKp44和NKp46的比例分别提高60%、40%、20%、40%和63%,而抑制性受体的表达变化不大;扩增后NK细胞对白血病细胞K562、肺癌细胞A549、肝癌细胞SMMU-7721和乳腺癌细胞MCF-7的杀伤活性分别提高了19%、29%、26%和28%,其ADCC活性从（33±5.6）%上升至（65±12）%;方案中增加TKD可使NK细胞的杀伤活性从（86±4）%提高至（96±2）%。对于肿瘤患者的NK细胞,新扩增方案使其在PBMC的比例提高至（90.0±8.0）%,其对K562细胞的杀伤活性提高了17%左右。 结论： K562工程细胞联合IL-2扩增方案可高效扩增NK细胞,明显激活其杀伤活性,扩增和活化的NK细胞可满足临床治疗的需要。     

细胞因子组合体外扩增人NK细胞的研究

目的：探讨细胞因子IL-2、IL-12、IL-15和IL-18组合对体外扩增人外周血来源的NK细胞受体表达及杀伤肿瘤细胞能力。方法：NK细胞的培养分为cIK组、IL2＋II,15组和IL-2＋IL-12＋IL-15＋IL-18组;流式细胞术检测培养的细胞表型及NK细胞受体表达;LDH法检测不同效靶比NK细胞对不同肿瘤细胞株的杀伤作用。结果：外周血淋巴细胞经细胞因子IL-2＋IL广12＋IL-15＋IL-18组合作用下,17d后NK细胞（CD3-CD56＋）比例上升至80％以上,NK细胞数扩增〉1000倍,明显高于其他两组,F=37．154,P〈0．001。NK细胞活化标志CD69。‘分子增加（t-21．271,P〈0．001）,NK细胞活化性受体（NKG2D、NKp30、NKp44和NKp46）均有不同程度上调（P值均〈0．05）,而NK细胞抑制性受体CDl58b（t=3．416,P=0．021）和CDl59a（t=4．209,P=0．018）不同程度下调,T淋巴细胞、B淋巴细胞（CD19＋）、单核巨噬细胞（CD14＋）、调节性T细胞（T—reg）等均显著减少,P〈0．001。对扩增的NK细胞杀伤敏感的肿瘤细胞株均高表达MHCI类相关蛋白A（majorhistocompatibility complexclass Ichainrelated moleculesA,MICA）,MICA表达分别为K562（46．2±3．2）％、MCF-7（56．5±4．7）％、HTC-8（52．5±4．1）％和Eca-109（36．5±2．5）％,而对NK细胞抵抗的细胞株均低表达或不表达MICA分子,分别为Raji0、MDA-MB-435s0和HT-29（1．2±0．8）％。结论：细胞因子IL-2＋IL-12＋IL-15＋IL-18组合能有效的扩增外周血来源NK细胞,上调其活化性受体,下调抑制性受体,其数量及功能均满足临床治疗需要。     

雷公藤内酯醇对人胰腺癌PANC-1细胞的抑制作用及其可能的机制

目的： 通过体内外实验观察雷公藤内酯醇（triptolide,TPL）对人胰腺癌PANC-1细胞生长和凋亡的抑制作用,并分析其对Toll样受体4（Toll-like receptor 4,TLR4）、血管内皮细胞生长因子（vascular endothelial cell growth factor,VEGF）的表达和肿瘤血管生成的影响。 方法： 以0、20、40、80 ng/ml的TPL作用于PANC-1细胞,MTT法和流式细胞术分别检测TPL对PANC-1细胞增殖和凋亡的影响,Western blotting检测TPL作用后PANC-1细胞中TLR4和VEGF的表达。建立PANC-1细胞裸鼠荷瘤模型并随机分为TPL组、PBS组,测量移植瘤的体积变化,治疗35 d后摘取瘤块,免疫组织化学方法检测移植瘤组织内TLR4、VEGF和CD31的表达,并计算微血管密度（microvessel density,MVD）。 结果： 与0 ng/ml组相比,PANC-1细胞经20、40和80 ng/ml的TPL处理24 h后,细胞凋亡率均显著升高\[（4.7±1.0）%、（10.5±2.0）%、（21.1±4.2）% vs （2.6±05）%,P<0.05或P<0.01\];48 h后,细胞增殖率均显著下降\[（68.0±5.3）%、（59.6±5.0）%、（51.6±4.2）% vs （99.6±5.2）%,均P<0.01\],并较相同浓度TPL处理24 h时显著降低（P<0.05或P<0.01）。80 ng/ml TPL组处理后PANC-1细胞中TLR4蛋白\[(20.2±4.7)% vs (57.5±63)%,P<0.01\]和VEGF蛋白\[ (35.8±4.0)% vs (92.1±8.3)%,P<0.01\]的表达量显著低于未处理组。TPL治疗组第34天的裸鼠移植瘤体积显著小于PBS对照组\[（510.9±79.8）vs（1 220.6±127.2）mm3,P<0.01\];TPL治疗组移植瘤组织内的TLR4、VEGF表达均显著低于PBS组\[（3.2±0.6) vs (6.7±1.1),(3.7±0.7) vs (7.1±1.2);均P<0.01）,其MVD也显著低于PBS组\[(12.2±4.0) vs (22.7±5.6),P<0.01\]。 结论： TPL能够抑制人胰腺癌PANC-1细胞及其裸鼠移植瘤的生长,并促进PANC-1细胞凋亡,其机制可能与TPL抑制TLR4、VEGF表达及肿瘤血管生成有关。     

肿瘤抗原冲击的DC联合CIK细胞治疗复发性多发性骨髓瘤的疗效

目的：观察树突状细胞（dendritic cells, DC）联合细胞因子诱导的杀伤（cytokine-induced killer, CIK）细胞治疗复发性多发性骨髓瘤（multiple myeloma, MM)的疗效以及安全性。方法：采集2005年3月至2014年10月江苏省中医院血液科收治的22例复发性MM患者的骨髓瘤细胞以及外周血单个核细胞,体外培养扩增自体DC-CIK细胞,然后回输治疗,对比治疗前后患者免疫指标及临床治疗效果。结果：DC联合CIK细胞治疗复发性MM总体疗效为,完全缓解（CR）2例,接近完全缓解（nCR）5例,部分缓解（PR） 7例,轻微治疗反应（MR）3例,疾病进展（PD）5例,总体反应率（CR+nCR+PR）为63.64%（14/22）。DC-CIK细胞治疗后患者外周血T细胞亚群比例较治疗前无明显变化,差异无统计学意义（P>0.05）;NK细胞百分率较治疗前明显上升\[(22.26±9.67)% vs (12.61±8.78)%\],差异有统计学意义（P<0.01）;LDH含量\[(166±41)% vs (112±21)%\]和β2-MG含量\[(5.11±2.33)% vs (2.65±1.61)%\]较治疗前均有明显下降,差异有统计学意义（P<0.01）。结论：DC-CIK细胞联合治疗复发性MM具有较好的临床疗效,是一种安全、有效的治疗方法, 有望进一步在骨髓瘤及其他B细胞肿瘤的临床治疗中得到应用。     

DC-CIK细胞免疫治疗胃癌的临床疗效及预后分析

目的：回顾性分析自体DC联合CIK（DC-CIK）细胞治疗96例胃癌患者的临床疗效和安全性。方法：采集2011年8月至2016年4月解放军第86医院肿瘤科及解放军第81医院肿瘤生物治疗中心收治的96例胃癌患者的外周血单核细胞 (peripheral blood mononuclear cell, PBMC),经实验室体外诱导培养DC和CIK细胞,DC通过胃癌MGC-803细胞裂解物致敏后与CIK细胞回输给患者,观察DC-CIK细胞治疗胃癌患者的临床疗效和安全性。结果：96例胃癌患者经DC-CIK细胞免疫治疗后,客观反应率为15.6%,疾病控制率为55.2%;1年生存率为56.0%,36~56个月总生存率维持在37.0%。免疫细胞治疗前后患者外周血肿瘤标志物CEA、CA199和CA724值均无明显变化。细胞治疗后患者外周血CD4+CD25+细胞比例显著下降\[（3.22±1.20)% vs (2.46±1.04)%,P<0.01\],CD3+、CD4+、CD8+、CD3+CD56+细胞百分比及CD4+/CD8+比值均无显著变化(P>0.05)。单因素分析显示,TNM分期、细胞治疗次数、治疗前CEA和CA199值为DC-CIK治疗胃癌预后的影响因素（P<0.05）;多因素分析显示,细胞治疗次数、治疗前CEA和CA199值与DC-CIK细胞治疗胃癌患者的预后相关（P<005）。结论：DC-CIK细胞免疫治疗对于胃癌患者是一种安全有效的治疗方式,多次治疗可能提高患者远期生存率。     

CIK细胞治疗对肿瘤患者外周血免疫细胞亚型的影响

目的： 分析接受细胞因子诱导的杀伤（cytokine-induced killer,CIK）细胞治疗后肿瘤患者外周血免疫细胞亚型的变化,探讨CIK细胞治疗对肿瘤患者免疫功能的影响。 方法： 采集2012年3月7日至2012年8月30日期间河北医科大学第四医院生物治疗科收治的60例肿瘤患者（肺癌25例、胃癌8例、直肠癌6例、食管癌11例、黑素瘤7例和乳腺癌3例）外周血及对照组20名健康志愿者外周血,分离外周血单个核细胞,常规方法体外扩增CIK细胞,分3次回输患者体内,流式细胞术检测CIK细胞治疗前后肿瘤患者外周血淋巴细胞亚型的变化。 结果： 与治疗前相比,经1次CIK细胞治疗后,CD3+CD4+T细胞比例升高（P=0.016）、CD4+/CD8+细胞比值升高（P=0.013）且均达到正常水平,CD3+CD8+细胞比例降低（P=0109）但仍高于对照组（P=0.048);3次CIK细胞治疗后相比1次治疗后无显著变化（P>0.05）。CD4+CD25+Treg比例经1次CIK治疗后较治疗前显著下降（P=0.007）,达到正常水平;3次治疗后持续下降（P=0.005）。CIK治疗对CD3-CD19+B细胞和CD3-CD56+自然杀伤（natural killer,NK）细胞水平无显著影响（P>0.05）。 结论： CIK细胞治疗能够降低肿瘤患者外周血Treg比例,升高CD3+CD4+T细胞比例及CD4+/CD8+细胞比值,从而减轻或消除肿瘤患者的免疫抑制状态。     

造血干细胞移植后淋巴细胞增殖症患者单个核细胞来源DC负载EBV抗原肽制备DC-CIK

目的：以造血干细胞移植后并发淋巴细胞增殖症（posttransplant lympholiferative disorder, PTLD)患者外周血单核细胞培养诱导DC,负载抗原肽后制备DCCIK（cytokineinduced killer cell）,为探索新的PTLD治疗方法奠定基础。方法: 分离造血干细胞移植后EBV（EpsteinBarr virus)感染致PLTD患者外周血单个核细胞,贴壁细胞培养诱导DC,悬浮细胞诱导CIK;负载EBV抗原肽LMP2后建立DCCIK共培养体系。流式细胞仪分析共培养前后细胞的免疫表型,ELISA检测共培养前后细胞上清IFNγ的分泌水平,基因扫描仪分析T细胞受体(T cell receptor, TCR)β家族基因谱。结果: 成功制备负载EBV抗原肽的DCCIK,HLADR+CD86+DC细胞从诱导前的12.5%增加到91.17%;DCCIK共培养14 d后,两例患者的CIK数量分别增加了5.3和6.8倍;CD3+、CD8+、CD3+CD8+以及CD3+CD56+ 细胞比例在DCCIK共培养后均明显升高(均P<005)。抗原肽负载的DCCIK共培养体系中IFNγ的分泌水平明显高于未经抗原肽负载的DC组\[（1 332.6±92.38）pg/ml vs (693.42±62.41) pg/ml,P<0.01）\]。DCCIK培养后细胞的TCRβ家族基因在5.2家族出现单克隆表达峰。结论：EBV抗原肽负载后DC可诱导DCCIK共培养体系中CD3+CD8+以及CD3+CD56+ 细胞扩增,并分泌高水平IFNγ,为临床应用DCCIK对移植后EBV感染致PTLD患者进行过继性细胞免疫治疗提供实验基础。     

五味子提取物对辐射所致小鼠淋巴细胞减少的预防效果及其机制

目的：研究中药五味子（Schisandra Chinensis,SC）提取物对辐射所致小鼠外周血淋巴细胞减少的预防效果及其机制。方法：将48只BALB/c小鼠随机分为4组,分别为SC预防组（SC+ray）、NS对照组（NS+ray）、SC对照组（SC）和正常对照组（NS）。一次性6 Gy γ射线照射,照射后进行小鼠外周血白细胞和淋巴细胞计数,细胞免疫荧光检测外周血Ｔ淋巴细胞亚群,Gimsa染色观察小鼠胸腺细胞形态,流式细胞术检测胸腺细胞凋亡率,RTPCR法检测胸腺组织中Bcl2和Fas 基因mRNA的表达。结果：NS对照组小鼠照射后外周血白细胞总数和淋巴细胞数量及亚群均明显下降(P<0.0),SC预防组较NS对照组白细胞总数和淋巴细胞数量均明显升高(P<0.01);SC预防组小鼠外周血中CD3+、CD4+和CD8+T细胞百分率较NS对照组小鼠明显升高（P<0.01）。NS对照组小鼠照射后胸腺细胞数目减少,并可见多处片状细胞凋亡和坏死;SC预防治疗组较NS对照组胸腺细胞凋亡率明显降低\[(21.32±2.56)% vs (2.87±1.03)%,P<0.01\];RTPCR结果表明,照射后小鼠胸腺细胞Bcl2表达明显降低,Fas表达明显升高(均P<0.01),而SC预防组较NS对照组Bcl2表达明显升高,Fas表达明显降低(均P<0.05)。结论：SC通过升高Bcl2表达、降低Fas表达调控胸腺细胞凋亡,从而有效预防辐射所致小鼠外周血淋巴细胞的减少。     

DC-CIK细胞治疗晚期转移性鼻咽癌的疗效

目的：评价DC-CIK细胞治疗晚期转移性鼻咽癌患者的疗效。方法：回顾性分析2011年8月至2015年6月解放军第八一医院肿瘤生物治疗科行DC-CIK细胞治疗的29例晚期转移性鼻咽癌患者。观察DC-CIK细胞治疗前后患者的疗效、安全性及EB病毒VCA-IgA抗体水平和淋巴细胞亚群的变化。结果：29例鼻咽癌患者经DC-CIK细胞治疗后客观缓解率为0,疾病控制率为65.5%,中位生存时间为42个月,1~4年生存率都为68.0%,无严重不良反应。治疗后29例患者的外周血EB病毒VCA-IgA抗体显著低于治疗前\[（30.88±3.91）U/ml vs (49.86±5.02) U/ml, P<0.05）\]。经细胞治疗后CD8+ T细胞显著上升（P<0.05）、CD4+/ CD8+ T细胞比值显著下降（P<0.05）。结论：DC-CIK细胞治疗转移性鼻咽癌安全、可行,能产生一定的临床获益。