EC9706、Eca109细胞系中S100A4及基质金属蛋白酶-2的表达

目的:检测食管鳞状细胞癌EC9706、Eca109细胞系中S100A4及基质金属蛋白酶-2(MMP-2,的表达.方法:采用免疫细胞化学法和Western blotting法检测EC9706、Eca109中S100A4蛋白及MMP-2蛋白的表达,采用RT-PCR法检测EC9706和Eca109细胞中S100A4与MMP-2的mRNA表达.结果:EC9706、Eca109细胞系中均存在S100A4与MMP-2蛋白及mRNA的表达,S100A4蛋白及MMP-2蛋白的阳性表达主要定位于胞浆中,Eca109细胞系中偶见胞核着色.Eca109细胞系中S100A4与MMP-2蛋白和S100A4 mRNA的表达量高于EC9706(P<0.05).结论:在EC9706、Eca109细胞系中均有S100A4、MMP-2的表达,提示S100A4可能在食管鳞状细胞癌的发生、发展中起重要作用.     

全反式维甲酸对食管癌EC9706细胞NDRGl mRNA和蛋白表达的影响

目的:探讨全反式维甲酸(ATRA)对食管癌细胞分化相关基因NDRG1表达的影响.方法:将10μmol/LATRA作用于人食管癌EC9706细胞,应用免疫组织化学SP法和RT-PCR方法分别检测对照组及ATRA作用1 d、2d、3 d及5 d组NDRG1蛋白和mRNA的表达.结果:ATRA作用1 d、2 d、3 d及5 d组NDRG1 mRNA相对含量分别为1.47±0.18、1.69±0.24、1.72±0.19和1.58±0.25,均高于对照组的1.08±0.10(P＜0.05或0.01).ATRA作用1 d、2 d、3 d及5 d组NDRG1蛋白表达积分分别为254±37、277±34、265±30和239±24,均高于对照组的164±29(P＜0.01).结论:ATRA可上调EC9706细胞分化相关基因NDRG1的表达,从而促进其分化.     

DMS0对EC9706细胞端粒酶活性及生长的影响

目的 研究二甲基亚砜(DMSO)对EC9706细胞端粒酶活性及生长的影响。方法 用1．3％DM50处理食管癌EC9706细胞，TRAP—ELISA法检测细胞端粒酶活性的改变，流式细胞仪分析细胞周期的改变。结果 DMSO处理后的EC9706细胞，端粒酶活性明显下降，且细胞周期明显改变，Gl期细胞比率显著增高，S期细胞数显著降低。结论 DMSO可抑制EC9706细胞端粒酶活性，使EC9706细胞生长停滞于Gl期，并诱导细胞凋亡。提示DMSO可用于食管癌的治疗。     

雷帕霉素抑制mTOR信号通路对EC9706细胞生长及凋亡的影响

目的:检测食管鳞状细胞癌组织中哺乳动物雷帕霉素靶蛋白(mTOR)的活性及雷帕霉素(rapa)对食管鳞状细胞癌细胞系EC9706细胞生长及凋亡的影响.方法:采用免疫组织化学SP法检测50例食管鳞状细胞癌组织及15例正常食管组织中mTOR蛋白的表达.分别用不同浓度(20、50和100 nmol/L)的rapa处理食管鳞状细胞癌EC9706细胞系,以未处理组作为阴性对照,采用流式细胞术测定细胞周期和凋亡率.结果:食管鳞状细胞癌组织中mTOR蛋白的阳性表达率为64.0%(32/50),高于正常组织的13.3%(2/15)(χ2=11.873,P=0.001).与对照组比较,rapa可使细胞停滞于G0/G1期(F=102.609,P=0.001),且明显促进细胞凋亡(F=916.882,P=0.001).结论:mTOR信号通路在食管鳞状细胞癌中被显著激活,rapa能抑制食管鳞状细胞癌细胞生长并诱导细胞凋亡.     

沉默EC9706细胞NS基因对裸鼠移植瘤组织中EGF、EGFR基因表达的影响

目的 建立裸鼠食管癌移植瘤模型,探讨由RNAi诱导的EC9706细胞核干细胞因子(nucleostemin,NS)基因沉默对裸鼠移植瘤组织中EGF、EGFR基因表达的影响.方法 裸鼠15只,采用STATA 8.0编制随机化分组程序,均分为3组,分别皮下注入pRNAT-U6.1-siNS2转染的EC9706 细胞(siR...     

RNA干扰对EC9706细胞mTOR表达及细胞生长与凋亡的影响

目的:探讨RNA干扰技术对人食管癌EC9706细胞哺乳动物雷帕霉素靶蛋白(mTOR)的表达及细胞生长与凋亡的影响.方法:设计合成mTOR siRNA,采用低、中、高浓度(50、100与150 nmoL/L)的mTOR siRNA分别转染EC9706细胞24、48与72 h.同时设无义对照组(转染无义对照siRNA)、空白对照组(转染空脂质体)及正常对照组(不转染).采用免疫细胞化学与原位杂交法分别检测各组EC9706细胞中mTOR蛋白与mRNA的表达;应用MTT法检测细胞增殖,计算细胞生长抑制率;应用TUNEL法检测转染24 h时细胞凋亡,计算凋亡指数(AI).结果:转染24、48与72 h,6组细胞mTOR蛋白和mRNA的表达差异均有统计学意义(mTOR蛋白:F=24.14,45.78,59.19,P均＜0.001;mTOR mRNA:F=41.42,69.74,43.71,P均＜0.001),细胞生长抑制率差异亦有统计学意义(F=143.85,172.98,155.01,P均＜0.001);低、中、高浓度组转染不同时间点间比较,mTOR蛋白(F=42.23,29.46,50.22,P均＜0.001)、mTOR mRNA(F=6.48,8.50,4.80,P均＜0.05)及细胞生长抑制率(F=78.77,76.14,52.28,P均＜0.001)差异均有统计学意义.mTOR siRNA转染组EC9706细胞mTOR蛋白与mRNA的表达均低于各对照组,且mTOR蛋白及mRNA的表达随mTOR siRNA浓度的增加及转染时间的延长而减弱(P＜0.05).不同浓度mTOR siRNA转染组EC9706细胞生长抑制率均高于各对照组,且细胞生长抑制率随mTOR siRNA浓度的增加和转染时间的延长而升高(P＜0.05).转染24 h,6组细胞AI相比,差异有统计学意义(F=442.96,P＜0.001),mTOR siRNA转染组AI均高于各对照组,且高浓度转染组AI高(P＜0.05).结论:mTOR siRNA可有效抑制EC9706细胞mTOR蛋白与mRNA的表达,且能抑制EC9706细胞的增殖并促进其凋亡.     

维生素D3对EC9706细胞增殖、裸鼠移植瘤生长及NDRG1蛋白表达的影响

目的:观察1,25-(OH)2维生素D3对食管癌EC9706细胞细胞增殖、细胞周期、食管癌细胞裸鼠移植瘤生长及对NDRG1蛋白表达的影响.方法:采用0.3 μmol/L的1,25-(OH)2维生素D3作用于EC9706细胞后,MTT法检测肿瘤细胞的增殖情况,流式细胞仪检测细胞周期的变化.BALB/c小鼠荷瘤后,用5 μg/kg 1,25-(OH)2维生素D3溶液皮下注射于移植瘤周围,观察移植瘤生长情况,并采用免疫组织化学方法检测裸鼠移植瘤组织中NDRG1蛋白表达水平.实验中均以未经1,25-(OH)2维生素D3处理作为对照组.结果:①MTT实验结果显示,1,25-(OH)2维生素D3作用1～5 d时各组吸光度均低于对照组,差异有统计学意义(P<0.05);随着1,25-(OH)2维生素D3作用时间的延长,细胞增殖抑制率逐渐升高(1 d:7.4%,3 d:21.1%,5 d:23.8%).②细胞周期检测结果显示,不同培养时间组G1期细胞分别与对照组比较,差异均有统计学意义(P<0.05).③与对照组相比,1,25-(OH)2维生素D3可上调NDRG1蛋白表达水平.结论:1,25-(OH)2维生素D3可抑制食管癌细胞增殖,并通过上调NDRG1的表达而抑制食管癌裸鼠移植瘤的生长.     

Stathmin siRNA对EC9706细胞紫杉醇化疗敏感性的影响

目的:探讨Stathmin表达下调的EC9076细胞对紫杉醇(PTX)化疗敏感性的变化。方法:将EC9706细胞分为PTX组、pSUPER+PTX组和pSUPER-S2+PTX组3组,MTT法检测pSUPER-S2+PTX对EC9706细胞存活率的影响;流式细胞术检测其对EC9076细胞周期的影响;采用AnnexinV-FITC/PI合染流式细胞仪、原位酶标记法和DNALadder检测其对EC9076细胞凋亡的影响。结果:MTT结果显示,pSUPER-S2+PTX组EC9706细胞存活率低于PTX组和pSUPER+PTX组(F组间=7.324,P=0.022;F时间=6.471,P=0.027)。与PTX组和pSUPER+PTX组相比,pSUPER-S2+PTX能明显增加G2/M期细胞、减少G0/G1期细胞(F=75.360,10.938,P<0.001);流式细胞仪和TUNEL法检测早期细胞凋亡率均显示pSUPER-S2+PTX可促进细胞凋亡(F=36.827和15.091,F<0.001)。DNALadder实验显示pSUPER-S2+PTX组凋亡条带明显增多。讨论:抑制Stathmin的表达能增加EC9706细胞对PTX的化疗敏感性。     

EC9706细胞和人食管鳞状细胞癌组织中MAL基因启动子区的甲基化状态

目的:探讨人食管鳞状细胞癌(食管鳞癌)MAL基因启动子区的甲基化状态。方法:利用亚硫酸氢盐测序法检测人食管鳞癌细胞系EC9706中MAL基因启动子区CpG位点甲基化的发生情况。根据测序结果选用甲基化敏感性限制性内切酶酶切结合PCR技术进一步检测26例食管鳞癌组织及配对癌旁正常组织MAL基因启动子区的甲基化情况。结果:EC9706细胞中MAL基因启动子区检测出42个胞嘧啶位点的甲基化,占所有CpG位点的73.7%(42/57)。食管鳞癌组织中MAL基因的甲基化率为53.8%(14/26),远远高于配对癌旁正常组织的7.7%(2/26)(χ2=10.924,P<0.001)。不同临床病理特征食管鳞癌组织中MAL基因启动子区甲基化率差异均无统计学意义(P>0.05)。结论:MAL基因启动子区的甲基化可能是食管鳞癌发生的机制之一。     

PTEN基因表达对EC9706细胞增殖、侵袭、凋亡能力的影响

目的:观察PTEN基因表达水平的变化对食管癌EC9706细胞增殖、侵袭、凋亡能力的影响。方法:构建2个靶向PTEN的siRNA载体及1个PTEN表达载体,分别转染EC9706细胞。实验分沉默1组、沉默2组、siRNA载体对照组、PTEN表达组、表达载体对照组和未转染组。RT-PCR、Westernblot法检测转染后各组细胞PTEN基因mRNA和蛋白表达水平。采用CCK-8试验、软琼脂克隆形成实验、流式细胞术和Transwell试验分别检测各组细胞增殖、克隆形成能力、细胞凋亡率及侵袭能力。结果:与未转染组比较,沉默1组、沉默2组PTENmRNA和蛋白表达量均降低,PTEN表达组PTENmRNA相对表达量升高(F=25.762,P<0.001);与未转染组比较,PTEN表达组细胞软琼脂克隆形成数和穿透细胞数均降低,细胞凋亡率增加(F=50.752、29.981、32.193,P均<0.001)。结论:上调PTEN的表达水平可以有效抑制EC9706细胞的增殖、克隆形成和侵袭转移能力,同时促进细胞凋亡。     

PTEN反义寡核苷酸对EC9706细胞增殖、凋亡和PTEN、mTOR表达的影响

目的:探讨PTEN反义寡核苷酸(ASODN)对食管癌EC9706细胞增殖、凋亡和PTEN、mTOR表达的影响.方法:利用阳离子脂质体介导PTEN的ASODN和无义寡核苷酸(N-ODN)转染食管癌EC9706细胞,终浓度为3、6和12μmol/L的ASODN为实验组,终浓度12 μmol/L的N-ODN为N-ODN对照组,不进行转染的为空白对照组.运用MTT法、TUNEL检测空白对照组、N-ODN对照组及3种浓度的ASODN作用24、48及72 h后食管癌EC9706细胞增殖和凋亡情况;采用免疫细胞化学技术及原位杂交方法检测各组EC9706细胞中PTEN蛋白、mTOR蛋白和mRNA的表达.结果:①随PTEN ASODN转染浓度(F3μmol/L=784.774,F6μmol/L=242.884,F12μmol/L=412.105,P均＜0.001)和时间(F24 h=60.676,F48 b=57.703,F72 h=51.841,P＜0.001)的增加,食管癌EC9706细胞的增殖增强.②随PTEN ASODN转染浓度(F3μmol/L=36.655,F6μ=mol/L47.594,F12μmol/L=85.264,P均＜0.001)和时间(F24h=4.860,F48 h=4.901,F72 h=8.153,P＜0.001)的增加,食管癌EC9706细胞的凋亡下降.③随PTENASODN转染浓度(F3μmol/L=45.634,F6μmol/L=66.399,F12μmol/L=72.763,P均＜0.001)和时间(F24h=4.065,F48 h=3.985,F72 h=5.446,P＜0.001)的增加,PTEN的蛋白表达降低;mRNA的表达也降低(F3μmol/L=23.357,F6μmol/L=43.272,F12μmol/L=51.402,P均＜0.001;F24h=3.933,F48 h=4.084,F72 h:4.528,P＜0.001).④mTOR蛋白(F3μmol/L=19.422,F6 μmol/L=30.000,F12 μmol/L=62.168,P＜0.001;F24 h=5.340,F48 h=9.150,F72 h=21.056,P＜0.001)和mRNA(F3μmol/L=19.414,F6 μmol/L=46.571,F12μmol/L=68.634,P＜0.001;F24 h=4.815,F48 h=12.165,F72 h=7.858,P＜0.001)的表达随PTEN ASODN转染浓度和时问的增加而增强.⑤上述各指标中均以12 μmol/LASODN作用72 h的效应最强(P均＜0.05).结论:PTEN ASODN促进食管癌EC9706细胞增殖、抑制凋亡,下调PTEN蛋白和mRNA的表达,上调mTOR蛋白和mRNA的表达.     

靛玉红甲肟对食管癌EC9706细胞增殖、凋亡的影响

目的:探讨靛玉红甲肟对食管癌EC9706细胞增殖和凋亡的影响。方法:分别用0、1、5和10μmol/L靛玉红甲肟处理EC9706细胞12、24和48h后,采用MTT法检测细胞增殖抑制率;用10μmol/L靛玉红甲肟处理EC9706细胞0、24、48和72h后,采用流式细胞术法检测凋亡率;分别用0、1、5和10μmol/L靛玉红甲肟处理EC9706细胞48h后,采用RT-PCR法检测细胞Sox-2mRNA的表达。结果:靛玉红甲肟对食管癌EC9706细胞增殖具有明显的抑制作用,且表现为剂量依赖性和时间依赖性(F剂量=135.237,F时间=96.488,F交互=189.544,P均<0.001)。靛玉红甲肟作用EC9706细胞后,细胞凋亡率呈时间依赖性上升(F=195.350,P<0.001),Sox-2mRNA的表达呈剂量依赖性下调(F=87.552,P<0.001)。结论:靛玉红甲肟对食管癌EC9706细胞具有明显的增殖抑制和诱导凋亡作用,其作用机制可能与下调Sox-2mRNA表达有关。     

雷帕霉素对p70S6K-siRNA转染的EC9706细胞增殖的影响

目的:观察雷帕霉素对p70S6K-siRNA转染的人食管鳞状细胞癌EC9706细胞增殖的影响。方法:用p70S6K-siRNA转染EC9706细胞,分别作用24、48 h后,采用RT-PCR和Western blot检测p70S6K mRNA及蛋白的表达情况;收集转染p70S6K-siRNA 24 h和未转染的EC9706细胞,加入0、25、50、100、150、250、500和1 500 nmol/L的雷帕霉素处理48 h,采用MTT法检测细胞存活率。结果:p70S6K-siRNA转染后,EC9706细胞中p70S6K mRNA及蛋白的表达均明显降低(mRNA:F=57.825;蛋白:F p70S6K=268.897,F p-p70S6K=35.584,P均<0.05)。随雷帕霉素浓度的增加,未转染和转染组EC9706细胞存活率均降低;与未转染组相比,转染组细胞存活率更低(F剂量=664.919,F组间=1 958.000,P均<0.05。)结论:p70S6K-siRNA能增强雷帕霉素对EC9706细胞增殖的抑制作用。     

全反式维甲酸对EC9706细胞体外增殖抑制及诱导凋亡作用

目的:观察全反式维甲酸(ATRA)对食管癌细胞体外增殖抑制及诱导凋亡的作用.方法:应用不同浓度(1×10-6、1×10-5、5×10-5 mol/L)ATRA体外处理人食管癌细胞EC9706(ATRA1、ATRA2、ATRA3组),并设不加ATRA的对照组,倒置显微镜下观察细胞的生长状态,HE染色后光镜下观察细胞结构的改变,应用MTT法测定细胞生长抑制率,免疫组织化学技术检测凋亡相关蛋白Bax及Bcl-2的表达情况.结果:经ATRA处理后,ATRA3组与对照组比较,细胞生长速度减慢,群体倍增时间延长(P均＜0.05);光镜下可见细胞形态趋向良性分化,细胞质内成熟细胞器增多,生长抑制率增加(P＜0.05).与对照组比较,3个ATRA组细胞Bax蛋白表达增加、Bcl-2蛋白表达下降(P<0.01),且以ATRA2、ATRA3组为明显(P<0.05).结论:ATRA能有效抑制EC9706细胞增殖,其机制与Bax及Bcl-2蛋白表达调控有关.     

小分子干扰RNA对EC9706细胞中血管内皮生长因子C表达的影响

目的:观察小分子干扰RNA(siRNA)对人食管癌EC9706细胞中血管内皮生长因子C(VEGF-C)表达的抑制作用.方法:根据VEGF-C cDNA已知序列,设计并体外转录合成3条siRNA,将它们分别导入载体质粒中,用脂质体介导分别转染EC9706细胞,以无关序列转染和正常EC9706细胞为对照.采用免疫细胞化学SP法、半定量RT-PCR和原位杂交技术分别检测上述各组细胞中VEGF-C蛋白和mRNA的表达.结果:正常细胞对照组和无关序列转染组均有大量VEGF-C蛋白阳性颗粒和mRNA阳性条带,而在siRNA转染的3组中,仅有少量VEGF-C阳性表达颗粒和较弱的mRNA阳性条带,与正常细胞对照组和无关序列转染组相比,差异均有统计学意义(P＜0.01).结论:VEGF-C siRNA能有效抑制食管癌EC9706细胞中VEGF-C的表达,可望成为一种抗淋巴管生成的新方法.     

上调stathmin基因表达对食管鳞癌EC9706细胞的作用

目的 构建stathmin基因真核表达载体,研究上调stathmin基因表达对食管癌细胞EC9706的作用.方法 采用RT-PCR扩增stathmin cDNA,克隆至pcDNA3.1(+)真核表达载体.重组载体经脂质体转染EC9706细胞,G418筛选获得稳定转染细胞株.显微镜观察转染细胞形态学变化,Western印迹法检测转染细胞stathmin蛋白的表达.选取稳定转染的细胞株,采用细胞计数法绘制细胞生长曲线,四甲基偶氮唑盐法检测细胞增殖活性,平板克隆形成实验观察细胞克隆形成,流式细胞仪分析细胞周期,裸鼠移植瘤实验研究转染细胞的成瘤性.结果 RT-PCR扩增获得450 bp的cDNA编码序列;克隆至pcDNA3.1(+)载体,获得pcDNA3.1-stathmin重组表达载体.Western印迹法证实重组载体上调EC9706细胞stathmin蛋白表达,差异有统计学意义(P＜0.01).与对照组细胞比较,pcDNA3.1-stathmin转染细胞形态变大、多核、有丝分裂障碍;pcDNA3.1-stathmin转染细胞倍增时间延长(25～28 h)、增殖活性降低、细胞克隆形成率下降(34.5%±6.9%),细胞分裂阻滞于G2/M期(21.7%±3.4%),裸鼠体内致瘤性降低,差异均有统计学意义(均P＜0.01).结论 重组质粒pcDNA3.1-stathmin上调stathmin基因表达能够抑制食管鳞癌EC9706细胞的增殖和致瘤性,stathmin可能成为食管鳞癌患者治疗的理想靶点.     

Cyclin E RNA干扰载体的构建及其对EC9706细胞Cyclin E表达的影响

目的:构建CyclinE基因干扰载体,转染食管癌EC9706细胞,观察其对CyclinE基因表达的影响。方法:设计、合成靶向CyclinE基因siRNA,退火成双链后与pRNAT-CMV3.1/Neo载体连接。转染EC9706细胞后,倒置荧光显微镜下观察细胞转染效果,RT-PCR、Western-blot分别检测CyclinE基因mRNA和蛋白表达水平。结果:构建的2个CyclinE基因siRNA载体插入序列与所设计序列均一致;转染EC9706细胞后,干扰1组、干扰2组与无关siRNA对照组均产生绿色荧光,空白对照组无荧光产生。干扰1组、干扰2组与空白对照组和无关siRNA对照组CyclinEmRNA相对表达量比较,差异有统计学意义(F=15.381,P=0.002),且干扰1组、干扰2组与空白对照组和无关siRNA对照组比较,CyclinEmRNA相对表达量均降低(P均<0.05)。结论:构建的靶向CyclinE基因RNA干扰载体能有效抑制转染细胞CyclinE基因的表达。     

不同基因位点的人端粒酶RNA反义寡核苷酸对食管癌EC9706细胞增殖及端粒酶活性的影响

目的:探讨封闭人端粒酶RNA不同基因位点的硫代修饰性反义寡核苷酸(ASODN)对食管癌细胞增殖及端粒酶活性的影响.方法:采用阳离子脂质体介导的方法,将不同浓度(0 μmol/L、5 μmol/L、10 μmol/L、20μmol/L和30 μmol/L)的5条ASODN(ASODN-1、ASODN-2、ASODN-3、ASODN-4和ASODN-5)和无关序列寡核苷酸(N-ODN)分别导入食管癌EC9706细胞中,应用MTT法及端粒酶活性的定性及定量检测法,测定ASODN对食管癌EC9706细胞增殖及端粒酶活性的抑制作用.结果:5条ASODN和1条N-ODN按照N-ODN、ASODN-4、ASODN-5、ASODN-2、ASODN-1和ASODN-3的顺序,对细胞增殖及端粒酶活性的抑制作用逐渐增高(P＜0.05).结论:封闭hTR功能区的反义寡核苷酸可有效抑制食管癌细胞增殖及端粒酶活性.     

乏氧对EC9706细胞多药耐药相关蛋白表达的影响

目的:研究乏氧对人食管鳞状细胞癌EC9706细胞株的多药耐药相关蛋白(MRP)表达的影响,探讨乏氧诱导因子-1α(HIF-1α)在乏氧引起肿瘤细胞多药耐药中的作用.方法:采用化学性低氧诱导剂氯化钴(CoCl2)体外培养人食管鳞状细胞癌EC9706细胞株,用RNAi沉默HIF-1α基因表达,应用半定量RT-PCR检测HIF-1α基因沉默效果.应用RT-PCR、免疫细胞化学技术检测RNA干扰前后乏氧条件下MRP1蛋白及RNA水平表达的变化.结果:乏氧后EC9706细胞中MRP1 mRNA和蛋白的表达均增加(P<0.05).针对HIF-1α基因的siRNA干扰技术,能有效沉默HIF-1α基因的表达.同样乏氧条件,转染HIF-1α siRNA后EC9706细胞较未转染及转染Control siRNA组细胞相比,MRP1 mRNA和蛋白的表达均减少(P<0.05).结论:HIF-1α上调食管鳞状细胞癌细胞中MRP1的表达可能是乏氧条件下化疗耐药的机制之一;HIF-1α可望成为新的食管鳞状细胞癌治疗的靶点.