重组逆转录病毒质粒pLNCX/iNOS的构建

目的　构建含一氧化氮合酶 (iNOS)基因的重组逆转录病毒 pLNCX/iNOS质粒。 方法　用PCR技术从pCMV/iNOS质粒中扩增出iNOS全长DNA ,用限制性内切酶HindⅢ和ClaⅠ对i NOSDNA和逆转录病毒质粒pLNCX分别进行双酶切。在T4连接酶的作用下 ,构建重组逆转录病毒质粒 pLNCX/iNOS ;用脂质体介导的方法把重组质粒DNA转染进入包装细胞PA317中 ,经过G418筛选出抗性克隆。通过NIH3T3细胞测定病毒液的病毒滴度。结果　经过酶切分析证实PCR扩增的iNOSDNA基因序列与鼠源性iNOS基因序列完全一致。重组质粒经酶切分析与预期的结果一致。G418筛选出 16个抗性克隆 ,能稳定合成并分泌重组逆转录病毒颗粒。NIH3T3细胞测定病毒滴度为 2 1× 10 4 CFU/ml。结论　逆转录病毒载体 pLNCX可有效地介导iNOS的转染     

PIG-A基因逆转录病毒表达载体及包装细胞系的建立

目的 构建含磷脂酰肌醇聚糖A类基因(PIG-A)的逆转录病毒载体并对其进行包装,获得稳定的产毒细胞系.方法 采用PCR方法从质粒pEBPIG-A中扩增PIG-A基因片断,Bam HⅠ及XhoⅠ双酶切后连接至逆转录病毒载体pLEGFP-C1,用限制性内切酶和DNA序列测定的方法对重组质粒进行鉴定.脂质体法转染PA317包装细胞,荧光显微镜下观察EGFP瞬时表达,G418筛选抗性克隆,收集病毒上清后感染NIH3T3细胞测定病毒滴度.结果 酶切证实PIG-A基因克隆至逆转录病毒载体,测序结果和原始序列相同.重组逆转录病毒载体转染PA317包装细胞,24～48h后荧光显微镜下观察到绿色荧光蛋白的表达.经G418筛选得到6个稳定抗性克隆,病毒滴度最高达1.6×105CFU/ml.结论 构建了含PIG-A基因的逆转录病毒载体,获得了稳定的产毒细胞系.     

新型假型逆转录病毒载体的构建

目的 将疱疹性口炎病毒壳G糖蛋白(VSV-G)用于构建新型假型逆转录病毒载体(VSV-G/MuLV)。方法 利用三质粒系统一过性转染293T/17细胞,通过磷酸钙共沉淀法产生VSV-G/MuLV;一过性转染后的病毒上清转导包装细胞系293/GPC以产生VSV-G/MuLV生产细胞系。G418筛选未成功转导的细胞,经筛选后的293/GPG细胞生产VSV-G/MuLV;用病毒上清转染NIH3T3细胞,并采用G418克隆筛选法测定病毒滴度。结果 感染后的NIH3T3细胞在G418的筛选培养下,有大量克隆形成。经计数和计算,VSV-G/MuLV病毒上清滴度为6×106。结论 成功构建了VSV-G/MuLV;该型病毒转染效率高,可直接转导大多数细胞,在有效监控条件下,VSV-G/MuLV作为载体可用于基因治疗。     

携带LMO3基因逆转录病毒载体的构建及其在NIH/3T3细胞中的表达

目的构建单纯LIM蛋白3(LMO3)的逆转录表达载体,并观察其在NIH/3T3细胞中的表达情况。方法重组载体pLXSN-LMO3经酶切及测序鉴定后,脂质体法转染到pA317包装细胞,G418筛选稳定的病毒产生细胞株。重组逆转录病毒体外感染NIH/3T3,并对其进行病毒滴度检测,NIH/3T3细胞分为3组:以pLXSN-LMO3转染为实验组,以pLXSN转染为阴性对照组,正常细胞为空白对照组。采用免疫荧光组化染色和蛋白印迹(Western blot)法鉴定NIH/3T3细胞中LMO3的表达。结果重组逆转录病毒载体pLXSN-LMO3经酶切及测序鉴定构建正确,其病毒滴度平均可达4.04×106cfu/ml,各组NIH/3T3细胞免疫荧光组化染色及Western blot检测均有LMO3蛋白表达,其中实验组高表达LMO3,与阴性对照组、空白对照组比较差异具有统计学意义(P<0.05)。结论成功构建了携带LMO3基因逆转录病毒载体,并能在NIH/3T3细胞中高表达LMO3蛋白,为下一步开展基因治疗奠定了基础。     

携带LMO3基因逆转录病毒载体的构建及其在NIH/3 T3细胞中的表达

目的：构建单纯LIM蛋白3（LMO3）的逆转录表达载体,并观察其在 NIH/3T3细胞中的表达情况。方法重组载体pLXSN-LMO3经酶切及测序鉴定后,脂质体法转染到pA317包装细胞,G418筛选稳定的病毒产生细胞株。重组逆转录病毒体外感染NIH/3T3,并对其进行病毒滴度检测,NIH/3T3细胞分为3组：以pLXSN-LMO3转染为实验组,以pLXSN转染为阴性对照组,正常细胞为空白对照组。采用免疫荧光组化染色和蛋白印迹（ Western blot）法鉴定NIH/3T3细胞中LMO3的表达。结果重组逆转录病毒载体pLXSN-LMO3经酶切及测序鉴定构建正确,其病毒滴度平均可达4.04×106 cfu/ml,各组NIH/3T3细胞免疫荧光组化染色及Western blot检测均有LMO3蛋白表达,其中实验组高表达LMO3,与阴性对照组、空白对照组比较差异具有统计学意义（P〈0.05）。结论成功构建了携带LMO3基因逆转录病毒载体,并能在NIH/3T3细胞中高表达LMO3蛋白,为下一步开展基因治疗奠定了基础。     

逆转录病毒介导的牛生长激素基因转染NIH3T3细胞和人胚肺成纤维细胞

目的：以牛生长激素(bGH)为模型，建立逆转录病毒载体转移系统，体外转染鼠成纤维细胞株NIH3T3和人胚肺成纤维细胞2BS，以获得bGH表达。方法：将PCR扩增的bGH基因片段插入逆转录病毒载体pSXLC-MDR相应酶切位点，获得的重组逆转录病毒质粒。应用脂质体方法转洒重组质粒进入包装细胞PA317，筛选长春新碱抗性克隆株，收集上清液感染NIH3T3细胞和人胚肺成纤维细胞2BS，筛选携带bGH基因的成纤维细胞的克隆株3T3／bGH和2BS／bGH。结果：RT－PCR分析表明基因转染组的3T3／bGH细胞和2BS／bGH细胞在相当于680bp处有一清晰的条带，而空质粒对照组无相应条带出现。RIA分析表明转染基因细胞的培养液及胞浆蛋白有bGH蛋白表达，而作为对照的3T3／mdr细胞和NIH／3T3细胞均无此蛋白表达。结论：应用逆转录病毒IRBS载体系统转染bGH基因进入成纤维细胞，该系统易筛选，转染效率较高。     

Fas配体基因逆转录病毒途径转染骨髓CD_(34)~+细胞

目的　借助逆转录病毒途径 ,FasL基因转染骨髓CD34+3 4 细胞。方法　将人FasLcDNA顺向插入逆转录病毒载体质粒PLXSN ;PLXSN -hFasL质粒脂质体转染PA317包装细胞 ;G418筛选抗生克隆 ;PCR鉴定整合细胞 ;扩增 ;制毒 :病毒滴度测定。试剂盒分选骨髓CD34+3 4 细胞 ;流式细胞仪分析其纯度 ;体外扩增培养 (IL -3+IL -6 +SCF) ;病毒上清转染CD34+3 4 细胞 ;流式细胞仪检测FasL阳性细胞率。结果　成功构建PLXSN -hFasL质粒 ;PA317细胞进行包装后所获假性病毒上清滴度为 1.7× 10 5CFU/ml ;对 11份正常人或良性贫血患者髓血进行CD34+3 4 细胞分选 ,所得CD34+3 4 细胞数为 1.35± 0 .45× 10 5,纯度为 85 %～ 97% ;体外扩增培养 10～ 12d ,细胞数达到 2 .5± 0 .7× 10 6(扩增约 18.5倍 ) ;病毒上清转染后 48～ 72h ,流式细胞仪检测 2 4.2± 2 .4%CD34+3 4 细胞表达FasL(P <0 .0 1) (未转染的CD34+3 4 细胞FasL阳性率为 7.6± 1.1% )。结论　通过逆转录病毒途径 ,FasL基因可有效转染骨髓CD34+3 4 细胞     

大肠癌线粒体DNA诱导NIH3T3细胞D-环突变的作用与机制

目的观察突变的大肠癌细胞线粒体DNA(mtDNA)转导NIH3T3细胞后转染细胞mtDNA D-环突变特性。方法通过脂质体法(Lipofection2000TM)将大肠癌细胞突变的mtDNA真核表达载体转染NIH3T3细胞,利用G418抗性筛选克隆细胞;用PCR法检测转染细胞线粒体突变情况。结果突变mtDNA导致转染细胞mtDNA的突变和多态性变化。结论突变的大肠癌mtDNA可致NIH3T3细胞mtDNA位点变化,但具体的机制和过程有待于进一步研究。     

环氧化酶Ⅱ基因克隆及表达

利用RT－PCR技术从NIH3T3细胞中克隆出环氧化酶ⅡcDNA，全长1815bp，测序分析表明与文献报道已知相符，构建真核表达载体。用阳离子脂质体介导转染的方法转染至宿主细胞HEK293细胞中，G418筛选出稳定转染的细胞克隆。加入底物花生四烯酸，通过测定PGE2含量的变化判断酶活，结果表明重组质粒能够表达环氧化酶。     

人PD-1基因克隆及其在L929基因转染细胞上的表达

目的 克隆人PD-1基因,构建含有该目的基因的重组逆转录病毒载体,并转染入L929细胞,获得稳定高表达PD-1分子的L929细胞。方法 用PCR法从pGEX-5X-3-PD-1扩增出PD-1基因,通过双酶切（PstI BamHI）装入逆转录病毒载体pGEZ Term中,脂质体法共转染包装细胞293T,用含有完整病毒颗粒的293T细胞的培养上清感染L929细胞,72h后,加入Zeocin进行筛选,挑选出能稳定表达PD-1分子的L929细胞株。结果 成功克隆了人PD-1基因,构建了含PD-1基因的重组逆转录病毒载体,包装出具有感染能力的重组PD-1逆转录病毒,筛选出具有稳定表达人PD-1分子的L929基因转染细胞。经流式细胞仪检测：PD-1分子在L929基因转染细胞中具有高表达,达到97．6％。结论 构建了含人PD-1基因重组逆转录病毒的载体,筛选出稳定表达人PD-1分子的L929细胞株。