不同支架材料构建组织工程化口腔黏膜的比较

目的 比较3种不同支架材料--聚羟基乙酸(PGA)、胶原膜和脱细胞真皮基质材料(Alloderm)在构建组织工程化口腔黏膜方面的特点.方法 体外培养、扩增人口腔黏膜上皮细胞和成纤维细胞(OFC).呈对数生长期的OFC接种至PGA支架上培养7 d后,将口腔黏膜上皮细胞分别与PGA-OFC、胶原膜和Alloderm复合,液面下培养4 ～ 7 d后,进行气-液界面培养7 d.光镜、电镜下进行组织形态学及超微结构观察.结果 以PGA为支架构建的组织工程化口腔黏膜,含类似上皮层和固有层,但细胞层次不清;胶原膜上可见口腔黏膜上皮细胞黏附生长,并形成复层上皮样组织,但无成熟的桥粒及基底膜样结构;以Alloderm作为支架材料的构建物,出现正常上皮形态,含半桥粒及细胞指状突起等超微结构.结论 PGA、胶原膜和Alloderm支架材料都能构建出含上皮层和固有层的口腔黏膜样组织;胶原膜由于降解速度和不易操作等特点,而不适宜作为组织工程化口腔黏膜支架材料;Alloderm作为支架的构建物更接近于人类正常口腔黏膜.     

不同支架材料构建组织工程化口腔黏膜回植动物的比较

目的以不同支架材料聚羟基乙酸(PGA)和脱细胞真皮基质材料(A lloderm)构建组织工程化口腔黏膜后回植裸鼠,观察其存活及生长情况。方法人口腔黏膜成纤维细胞(OFC)接种至PGA支架上培养7 d后,将口腔黏膜上皮细胞分别与PGA-OFC和A lloderm复合,液面下培养47~d后,进行气-液界面培养7 d,然后回植裸鼠背部皮下。回植后7、14 d分别取材观察。结果以PGA和A lloderm为支架构建的组织工程化口腔黏膜均可在裸鼠体内至少存活2周,并与裸鼠自身组织融合生长;在观察的第2周,以PGA为支架构建的组织工程化口腔黏膜出现血管化,以A lloderm为支架构建的组织工程化口腔黏膜上皮分化较为明显。结论PGA孔隙有利于细胞和血管的生长,但其强度随降解而降低;以A lloderm为支架的构建物显示出较清晰的组织学结构。     

不同支架材料构建组织工程化口腔黏膜回植动物的比较

目的 以不同支架材料聚羟基乙酸(PGA)和脱细胞真皮基质材料(Alloderm)构建组织工程化口腔黏膜后回植裸鼠,观察其存活及生长情况.方法 人口腔黏膜成纤维细胞(OFC)接种至PGA支架上培养7 d后,将口腔黏膜上皮细胞分别与PGA-OFC和Alloderm复合,液面下培养4 ～ 7 d后,进行气-液界面培养7 d,然后回植裸鼠背部皮下.回植后7、14 d分别取材观察.结果 以PGA和Alloderm为支架构建的组织工程化口腔黏膜均可在裸鼠体内至少存活2周,并与裸鼠自身组织融合生长;在观察的第2周,以PGA为支架构建的组织工程化口腔黏膜出现血管化,以Alloderm为支架构建的组织工程化口腔黏膜上皮分化较为明显.结论 PGA孔隙有利于细胞和血管的生长,但其强度随降解而降低;以Alloderm为支架的构建物显示出较清晰的组织学结构.     

4种支架构建复合式口腔黏膜的组织学特点

目的利用4种不同支架材料构建复合式口腔黏膜,并比较其组织结构特点。方法体外培养人口腔黏膜的成纤维细胞和角质形成细胞,在4种支架材料中加入成纤维细胞,培养7d后,在支架表面加入角质形成细胞,培养4d后,移至气-液界面继续培养7d。苏木精-伊红染色镜下观察构建的复合式口腔黏膜的组织形态学特点。结果 4种支架均可构建形成复层上皮。其中,上皮层与脱细胞真皮基质材料(de-epidermised dermis,DED)结合紧密,形成的人工黏膜有明显的上皮钉突。不同于以往报道,上皮层与Alloderm结合并不十分紧密。以胶原凝胶为基质形成的人工口腔黏膜最厚,有明显分层。以胶原海绵-胶原凝胶为基质形成的复层上皮在部分区域长入至胶原海绵的空隙中。结论以DED和胶原凝胶为支架构建的口腔黏膜更接近于天然结构,而后者脆性较大,限制了其临床应用的可能。     

组织工程化人口腔黏膜的构建

目的:用组织工程方法培养人全层口腔黏膜.方法:婴儿唇裂多余口腔黏膜组织为取材对象,分离成纤维细胞与上皮细胞,分别接种在聚乳酸羟基乙酸(PLGA)膜上培养,后将其移至气液面进行复合.HE染色、免疫组化AE1/AE3及Vimentin染色,光镜、倒置相差显微镜、扫描电镜观察其形态结构.结果:口腔黏膜具备上皮层和上皮下纤维组织,上皮细胞3～7层,见桥粒连接,AE1/AE3阳性;同有层细胞核形Vimentin( ).结论:成功培养全层人口腔黏膜,PLGA可作为口腔黏膜组织工程支架材料.     

兔口腔黏膜上皮细胞羊膜种植及生物学特性研究

目的研究羊膜作为载体种植兔口腔黏膜上皮细胞的可行性及生物学特征，探索眼表重建良好和来源丰富的移植材料和方法。方法将兔口腔黏膜上皮细胞种植于去上皮羊膜基底膜进行体外培养扩增。倒置显微镜观察细胞在羊膜上的动态生长过程，将培养获得的复合上皮片作常规病理切片HE染色和透射电镜观察。采用AE5单克隆抗体鉴定培养组织中有无角蛋白3表达。结果免口腔黏膜上皮细胞在去上皮羊膜基底膜面能黏附生长并增殖，体外培养3周左右即可在羊膜上汇合成片并分层。形成的复合组织由羊膜基底膜和较扁平的2～3层上皮细胞组成，基底层细胞与羊膜之间有半桥粒连接，细胞之间可见桥粒连接，细胞表达角蛋白3。结论兔口腔黏膜上皮细胞在去上皮羊膜上体外培养扩增能获得类似于角膜上皮的复层组织，为解决眼表重建供体来源不足的现状带来了新的希望。     

人口腔黏膜上皮细胞的培养及其在PLGA膜上生长的初步实验

目的 :探讨人口腔黏膜上皮细胞的原代培养和体外生长方法。方法 :采用美国DispaseⅡ试剂获取人体正常口腔黏膜上皮的原代细胞 ,将其种植在PLGA膜上 ,通过光学显微镜形态学检查、扫描电镜和免疫组织化学进行细胞定性。结果 :采用DispaseⅡ可成功地分离出口腔黏膜上皮层和上皮下层 ,通过进一步处理后可获取口腔黏膜上皮细胞的原代细胞 ,将其植入PLAG膜上 ,细胞获得很快生长 ,5d时细胞出现分化 ,8d时可以长到 5层左右。结论 :本方法可较好地获取口腔黏膜原代细胞 ,获取的口腔黏膜原代上皮细胞种植在PLAG膜上可获得良好的生长。     

组织工程化尿路上皮结构体内外构建研究

目的探讨工程化尿路上皮结构的构建方法。方法机械分离获取膀胱黏膜层,胰蛋白酶消化法获取膀胱移行上皮细胞,用DKSFM培养基体外培养扩增。以自制的猪小肠黏膜下层(SIS)为支架材料,将培养的膀胱移行上皮细胞接种到支架材料表面,观察细胞在支架材料表面的生长增殖情况;并将体外构建的细胞-支架材料复合物植入裸鼠背部皮下,不同时间点取材进行组织学和免疫组织化学检测。结果膀胱移行上皮细胞在SIS表面能够黏附、生长和增殖。体外复合培养9d后,膀胱移行上皮细胞铺满SIS表面,呈单层细胞结构。裸鼠体内植入4周和8周后,SIS上种植的膀胱移行上皮细胞形成多层结构,抗细胞角蛋白免疫组化染色,细胞胞浆成棕黄色阳性反应。结论采用组织工程技术能够在体内外初步构建尿路上皮结构,为进一步组织工程泌尿道修复重建实验奠定了基础。     

人口腔黏膜上皮细胞的培养及其在PLGA膜上生长的初步实验

目的：探讨人口腔黏膜上皮细胞的原代培养和体外生长方法。方法：采用美国DispaseⅡ试削获取人体正常口腔黏膜上皮的原代细胞，将其种植在PLGA膜上，通过光学显微镜形态学检查、扫描电镜和免疫组织化学进行细胞定性。结果：采用DispaseⅡ可成功地分离出口腔黏膜上皮层和上皮下层，通过进一步处理后可获取口腔黏膜上皮细胞的原代细胞，将其植入PLAG膜上，细胞获得很快生长，5d时细胞出现分化，8d时可以长到5层左右。结论：本方法可较好地获取口腔黏膜原代细胞，获取的口腔黏膜原代上皮细胞种植在PIAG膜上可获得良好的生长。     

人工生物可降解支架聚乳酸-聚乙醇酸种植人食管上皮细胞的实验研究

目的研究人食管上皮细胞在聚乳酸-聚乙醇酸(PLGA)三维支架上的贴附和生长情况,利用组织工程技术培养工程化人工食管.方法制作PLGA三维细胞支架;分离培养成人食管上皮细胞,体外扩增后种植到PLGA支架上.在体外和裸鼠体内分别培养食管上皮细胞-支架复合物,分期终止培养,进行组织学染色、扫描电镜、细胞角蛋白免疫组织化学检测.结果体外培养发现,人食管上皮细胞在支架材料上贴附生长良好,长期培养仍保持食管上皮细胞特性,裸鼠体内培养4周后可形成食管黏膜样组织.结论 PLGA支架适合食管上皮细胞黏附生长,可作为食管组织工程的细胞载体.利用组织工程的方法可获得适于移植的工程化人工い食管.     

组织工程化口腔粘膜的构建技术初步研究

目的　探索组织工程化口腔粘膜的构建方法。方法　用 Dispase中性蛋白酶分离提取未长毛的 SD乳鼠硬腭口腔粘膜细胞 ,用角化细胞培养液对口腔粘膜细胞进行培养 ,以自制藻酸钠薄膜作为支架材料构建组织工程化的口腔粘膜。结果　 Dispase中性蛋白酶可较好地分离提纯口腔粘膜细胞 ,用 Dispase消化酶分离获取上皮后 ,再用胰蛋白酶消化上皮为单细胞的最佳时间为 10 m in,过低的细胞密度不易形成克隆 ,鼠口腔粘膜细胞培养的最适密度为 1.5× 10 5/ cm2 。角化细胞培养液能对鼠口腔粘膜细胞进行培养 ,且没有成纤维细胞污染 ;口腔粘膜细胞在藻酸钠薄膜上生长良好。结论　利用角化细胞培养液作为培养基 ,藻酸钠薄膜作为支架材料可成功构建组织工程化口腔粘膜     

新型快速成形的三维多孔支架材料构建组织工程软骨

目的:探讨以骨髓基质细胞(BMSC)为种子细胞,以快速成形的生物相容性材料为支架构建组织工程软骨的可行性.方法:成年兔BMSC在成软骨培养液中诱导培养,使之具有软骨细胞表型后,接种于快速成形的生物相容性三维支架材料聚乳酸/聚羟乙酸共聚物(poly-lactic-co-glycolic acid,PLGA),经体外培养扩增2 wk后植入自体肌袋,术后8 wk取材,进行组织学、甲苯胺蓝染色及II型胶原免疫组织化学观察.结果:成年兔BMSC在体外可诱导为软骨细胞,接种于三维支架材料培养后,扫描电境观察见细胞在支架上可大量扩增;接种细胞的支架植入自体肌袋8 wk,可形成软骨样组织,甲苯胺蓝染色及II型胶原免疫组化染色阳性.结论:具有软骨细胞表型的BMSC接种于快速成形的三维支架材料在体内非关节环境可形成软骨样组织.     

聚乳酸-羟基乙酸共聚物和胶原膜对体外培养人表皮角质细胞分泌细胞因子的影响

目的探讨聚乳酸-羟基乙酸共聚物（PLGA）和胶原膜对表皮角质细胞分泌细胞因子的影响及其在创面修复中的可能作用机制。方法实验组分为PLGA组和胶原膜组,表皮角质细胞以3×10^7cm^-2密度分别种植于PLGA和胶原膜上;对照组为单层表皮角质细胞培养。于第7天和第14天扫描电镜下观察细胞生长状况;种植后第1,3,5,7,14天收集细胞培养上清液,检测乳酸脱氢酶（LDH）水平观察细胞损伤程度,应用ELISA法检测培养上清液中自细胞介素一18（IL-18）、白细胞介素-6（IL-6）和白细胞介素8（IL-8）的水平。结果表皮角质细胞种植后第7天,扫描电镜下可见细胞粘附于PLGA和胶原膜呈原有三维结构稳定均一生长,第14天有纤维丝状细胞外基质生成。实验组和对照组各时相点LDH水平差别无统计学意义。PLGA组和胶原膜组表皮角质细胞分泌IL-1β、IL-6和IL-8水平与对照组比较均有不同程度上升,其差别具有统计学意义（P〈0．05或P〈0．01）。结论PLGA和胶原膜在构建组织工程皮肤中作为一种生物支架,增强表皮角质细胞分泌IL-1β、IL-6和IL-8能力,对加速创面愈合可能起着积极作用。     

组织工程化皮瓣的构建

目的应用脂肪组织来源干细胞(ASCs)在体外构建组织工程脂肪并与已构建的复合皮组装培育,试构建出含脂肪层的组织工程化皮瓣。方法(1)构建组织工程脂肪从脂肪组织中分离培养ASCs并进行三系分化诱导鉴定。ASCs与胶原凝胶混合并进行体外成脂诱导,诱导15 d后分别进行倒置显微镜、油红O染色及HE染色观察。(2)构建复合皮从包皮组织中分离培养表皮细胞(Kc)和成纤维细胞(Fb)。Fb与胶原凝胶混合后培养5 d,将Kc接种到含有Fb的凝胶表面,在液面下培养4 d后移至气-液界面继续培养10 d形成复合皮。(3)构建含皮下脂肪组织的3层结构的皮肤复合组织将培养的复合皮与脂肪组织按正常皮肤结构顺序组装后继续培养3 d并行HE染色观察。结果(1)ASCs具有成脂、成软骨和成骨分化能力。ASCs凝胶复合物体外成脂诱导15 d后,可见细胞内充满圆形脂滴,呈单房或多房形,油红O染色及HE染色均显示为成熟脂滴。(2)经过气-液界面培养后,Kc成层分化,形成基底上层。(3)组装培育后的皮肤复合组织分3层,表层Kc成层分化并形成基底上层;中层和底层连接处细胞聚集;成脂分化的ASCs位于底层。结论分别应用Kc、Fb和ASCs三种细胞,在体外构建出组织工程化脂肪和复合皮,且按序组装培育,可构建出组织工程化皮瓣。     

组织工程血管高分子生物支架研究进展

可替代自体血管的组织工程血管已应用于心血管疾病临床治疗。传统人工血管免疫排斥、吻合口增生、血栓等因素阻碍其临床应用与发展。随着组织工程血管技术的发展,高分子生物支架赋予人工血管再生潜能,即种子细胞的种植、黏附、增殖,随之支架适时降解,最终新血管形成。可见,组织工程血管的发展需要良好组织相容性高分子生物支架材料及新型支架制作技术。现就近年来组织工程血管高分子生物支架材料及制作工艺研究新进展予以综述。     

胶原凝胶包埋软骨细胞接种骨胶原基质支架体外构建组织工程软骨

目的探讨复合应用胶原凝胶和骨胶原基质（BCM）支架作为软骨细胞载体体外构建组织工程软骨的有效性和可行性.方法将胶原凝胶包埋的软骨细胞接种BCM支架并在体外培养,应用倒置相差显微镜和扫描电镜观察软骨细胞的粘附、生长和增殖情况,培养14d,行HE、TB（甲苯胺蓝）染色观察软骨组织形成情况.结果软骨细胞在支架上粘附、生长和增殖良好,体外培养14d能形成较成熟的软骨组织.结论胶原凝胶复合BCM支架可作为软骨细胞的载体体外构建组织工程软骨.