聚合酶链反应检测银屑病患者皮损中人巨细胞病毒

目的：为了进一步了解人巨细胞病毒（HCMV）与银屑病人发病关系。方法：用针对HCMV染色体上编码蛋白基因的引物进行PCR扩增。对48例银屑病患者皮损中人巨细胞病毒进行检测。结果：48例患者，5例（10．4％）PCR检测阳性，其扩增产物可被限制性内切酶Sau3A切为105bp和185bp二个不同大小的片段，证实扩增产物为预期片段。阳性对照B36也扩出290bp的DNA带，阴性对照均未扩增出。结论：HCMV感染在银屑病发病中有一定的作用。     

PCR检测人巨细胞病毒感染的研究

目的：建立快速简便的聚合酶链反应(PCR)方法检测入巨细胞病毒(HCMV—DNA)。方法：根据国外文献报道的HCMV基因序列,利用计算机辅助设计并选出一对寡核苷酸引物,扩增片段为370hp。结果：在370bp处出现DNA扩增带者为HCMV—DNA阳性。结论：PCR技术检测HCMV—DNA敏感、特异,有望应用于临床作为HCMV感染的早期诊断方法。     

HVP-18、HCMV及HSV多重PCR检测模板的建立方法及应用效果

目的探讨HVP-18、HCMV及HSV多重PCR检测模板的建立方法及应用效果。方法依据HVP-18、HCMV及HSV特异性非编码区保守序列设计三对引物,采用RT-PCR技术对引物进行特异性扩增,通过对单管多重PCR扩增的特异性、敏感性分析以及扩增条件的优化,建立含有三种引物序列的检测模板。结果含有多重引物的检测模板PCR反应体系可同时扩增出HVP-18、HCMV及HSV片段,灵敏度及特异度检测发现其能够对HVP-18、HCMV及HSV基因片段特异性扩增,分别扩增出182bp、206 bp、101 bp目的片段。结论采用多重PCR扩增技术能够建立具有高灵敏度及特异度的HVP-18、HCMV及HSV多重PCR检测模板,满足临床检测需要。     

用套式PCR检测新生儿先天性巨细胞病毒感染

选取ＨＣＭＶＡＤ１６９株ＥｃｏＲＩＪ片段区的ＩＥＡ基因第四外显子为扩增靶序列，合成两对引物，外引物扩增２４２ｂｐ片段，内引物扩增１４６ｂｐ的片段，此方法很灵敏，可检测５－１０ｆｇＨＣＭｖＤＮＡ。我们随机采集５１名新生儿脐带血，应用ＮａＩ法提取全血ＤＮＡ为模板进行扩增，结果表明：３２名为ＨＣＭＶＤＮＡ阳性，以口腔粘液ＤＮＡ（４０名）为模板进行扩增，２４名为ＨＣＭＶＤＮＡ阳性。因此，套式ＰＣＲ可用于临床上快速准确地检测ＨＣＭＶ。     

用双重PCR检测人巨细胞病毒DNA

选取HCMV IEV基因区为扩增的靶序列,合成两对引物,其中一对巢居于另一对之间。扩增片段分别为721 bP和167bp。单次PCR扩增灵敏度达0.5～1.0fg,双重扩增可提高灵敏度10～100倍。用HSV-1,HSV-2,CoxB组1～6型病毒培养物作模板,无非特异扩增。14例疑为CMV感染患儿尿标本经PCR测定,12例检出HCMV DNA,其中11例病毒分离阳性。PCR快速,可靠,比病毒分离简便易行,对临床HCMV感染的诊断有重要意义。     

套式聚合酶链反应扩增尿素酶A基因检测幽门螺杆菌

应用互补于幽门螺杆菌(HP)尿素酶A基因片段的两对引物进行套式聚合酶链反应(N-PCR),外引物的扩增片段为552bp,内引物扩增片段为310bp,用该方法检测1株HP标准菌株(N-CTC14126)和20个HP临床分离株均阳性,而其他12种肠道菌均为阴性,特异性100％,敏感性可检测到0.1fg细菌DNA的水平,优于目前国外的报道。取胃粘膜活检标本30例,用细菌培养、尿素酶试验、组织学染色作为参照方法检测,20例为阳性,10例阴性,N-PCR检测结果与之完全一致。     

检测痕量DNA CYP17基因MspA1I多态性方法探讨

目的建立一种有效的检测痕量DNA细胞色素P45017α酶基因MspA1I多态性的方法。方法利用自行设计引物扩增短DNA片段(208bp)，替代扩增长DNA片段(459bp)的Garey法，检测痕量模板DNA的CYP17基因多态性。结果得到了稳定的、重复性良好的目的DNA片段，使MspA1I多态性分型简便，易行。结论提示可将扩增的短DNA片段替代长DNA片段的原理和方法推广应用于其他痕量DNA多态性分型。     

弓形虫529 bp重复序列基因的PCR阳性质控质粒的构建

目的：构建含有弓形虫529 bp高度重复序列基因的重组质粒,为基于该基因的弓形虫病分子生物学诊断建立标准阳性对照品。方法：以弓形虫RH株基因组DNA为模板,对529 bp的基因片段进行扩增,将纯化后的PCR产物与pMD18-T载体连接后转入大肠埃希菌DH-5α中,提取重组质粒PCR及测序鉴定。以弓形虫529 bp基因为靶基因设计的检测引物,扩增弓形虫基因组DNA及质粒DNA。结果：PCR产物序列与GENBANK中弓形虫529 bp基因序列完全一致。以弓形虫基因组DNA和质粒DNA为模板,成功扩增出预期的249bp基因片段。结论：成功构建可作为标准阳性对照品的含有弓形虫529 bp高度重复序列基因的重组质粒pMD-18-Tox,为经济实用的弓形虫诊断试剂盒的研制奠定了基础。     

浙江地区小儿幽门螺杆菌cagA基因变异性研究

目的 研究浙江地区儿童感染的幽门螺杆菌 (Hp)cagA基因的变异性。方法 应用3对不同引物对66例Hp感染患儿胃粘膜Hp菌株通过聚合酶链反应 (PCR)技术 ,分别扩增cagA基因不同DNA片段 ,检测cagA基因阳性 (cagA +)检出率 ;用免疫印迹法检测患儿血清CagA抗体。结果 Hp 菌株cagA基因DNA404bp、349bp、298bp 片段分别经3对引物扩增后 ,cagA +检出率分别为56.1%、39.4%、72.7% ,三者之间差别有显著性意义(χ2=14.63,P<0.01) ,总阳性检出率为90.9%。66例患儿血清CagA抗体阳性率为97.0%。结论 浙江地区儿童感染的Hp菌株cagA基因存在变异性和多态性 ,增加引物对数量进行检测可以提高Hp菌株cagA +检出率。     

应用氯化锶对小鼠卵母细胞孤雌活化的研究

根据弓形虫P30基因序列设计二对引物分别进行了PCR一次扩增和套式扩增，结果这两对引物在一次扩增和套式扩增中分别出现预期的扩增片段914bp,522bp和522bp；套式扩增出现的条带比一产供销扩增出现的条带亮度明显增强，提示套式扩增比一次扩增具有更高的敏感性，用外引物进行扩增后，最低可以检测到1pg的弓形虫DNA，说明所建立的反应体系具有高度的敏感性。用内引物对人工感染弓形虫的ICR小鼠血液，组织进行弓形虫DNA的检测，结果均扩增出522bp的扩增带。根据B1基因序列设计的弓物进行PCR一次扩增和半套式扩增。结果均出现预期的扩增片段619bp,362bp和362bp；用半套式扩增检测感染弓形虫形虫的ICR小鼠血液，组织时可扩增出522bp的619bp,362bp和362bp；用半套式扩增检测感染弓形虫的ICR小鼠血液，组织时可扩增出522bp的扩增带，半套式扩增比一次扩增更敏感。     

空肠弯曲菌套式PCR快速检测方法的建立与初步应用

目的建立套式PCR快速检测实验动物空肠弯曲菌的方法。方法根据GenBank数据库的空肠弯曲菌flaA基因设计2对引物，对空肠弯曲菌抽提DNA作PCR扩增及克隆测序。同时，对其他病原菌抽提核酸扩增，并对120份临床样品进行检测。结果空肠弯曲菌经2对引物分别扩增出1719bp和640bp片段，与预期大小一致。套式PCR检测的最低限度为10CFU。整个检测过程可在8h内完成。而其他病原菌未出现特异性扩增条带。采用套式PCR对121份临床样品进行检测，检出31份阳性，与传统的细菌分离方法完全一致。结论本研究建立的套式PCR方法具有很好的特异性和敏感性，可用于实验动物空肠弯曲菌的快速检测。     

鸭乙型肝炎病毒核酸荧光定量PCR方法的建立及应用

目的：建立鸭乙型肝炎病毒核酸(DHBV DNA)荧光定量的方法。方法：根据DHBV DNAS基因区的序列设计扩增所需3条引物，通过偶联反应用AmpliSensor荧光信号标记半巢式引物，经过前期不对称扩增、半巢式扩增及在线检测建立DHBV DNA阳性标准品QPCR的标准曲线，并将70份鸭血清分别用荧光定量PCR方法和地高辛标记的DHBV DNA探针斑点杂交的方法检测，比较结果的相关性。结果：DHBV DNA阳性标准品经过30次循环后，扩增产物经2％琼脂糖凝胶电泳检测，可以看出有180bp、70bp两个片段，与设计的片段大小相符，扩增产物的浓度与标准品的起始浓度成正比，扩增指数的数值大小与该循环时己合成的扩增产物的量成正比，起始浓度的大小与要合成的一定扩增产物的量所需的循环次数成反比。用荧定量PCR方法和斑点杂交的方法检测血清中DHBV DNA的结果有良好的相关性(r＝0．97，P＜0.01，ν＝58)。结论：荧光定量PCR方法可作为检测DHBV DNA含量的一个重要手段。     

人巨细胞病毒的PCR检测

①目的 寻找早期快速检测人类巨细胞病毒（HCMV）感染的敏感方法。②方法 用HCMV即刻早期（IE）基因和晚期（LA）基因的7对待异性引物分别进行普通聚合酶链的反应（PCR），套式PCR（nPCR)和双重PCR，检测血清中的HCMV DNA，比较不同引物及不同PCR方法的灵敏度。③结果 同一基因的不同引物扩增HCMV DNA灵敏度差别无显著意义；LA基因的引物扩增灵敏度高于IE基因的引物；3种方法中以nPCR灵敏度最高，其次为双重PCR，普通PCR最低。④结论 用LA基因的特异性引物进行nPCR是早期快速检测HCMV感染的敏感方法。     

泰泽菌PCR检测方法的建立及初步应用

目的 建立和应用泰泽菌巢式PCR检测方法。方法 参照日本学者Goto检测泰泽菌16S rDNA序列设计的两对引物,对PCR的检测条件进行了改进和优化。结果 巢式PCR反应的外引物能引导扩增出一条625 bp的DNA片段,内引物则能引导扩增出一条196 bp的DNA片段。此625 bp和196 bpDNA片段的大小均与Goto报道的结果完全一致。试验证明196 bp的阳性带为泰泽菌16S rDNA特异性保守片段。通过将泰泽菌阳性肝组织标本经系列稀释的试验表明,该PCR方法的检测灵敏度为2个菌。另外,将阳性对照标本扩增的625 bp DNA片段作核酸序列测定,发现其碱基序列与Goto报道的泰泽菌MSK株及RJ株16S rDNA序列均有99％同源性。结论 根据上述结果,我们应用本方法对普通级小鼠、大鼠、金黄色地鼠肝组织标本各5份、普通级豚鼠肝组织标本10份、沙鼠肝组织标本10份、MHV3感染的小鼠肝组织1份进行了初步检测,结果未发现带菌动物。     

PCR快速检测细菌16S rRNA基因的初步研究

目的：建立检测细菌16SrRNA基因的PCR方法。方法:以细菌16S rRNA基因为靶序列。利用计算机软件primer5．0，Bioedit设计2条引物-pml.,pm2并建立相应的PCR方法。采用该PCR方法扩增实验室保留菌株的16srRNA基因,以人类外周血白细胞基因组DNA、HBV—DNA阳性血清以及白色念珠菌为对照。检测该实验方法的特异性;采用倍比稀释的方法进行该实验方法的敏感性实验。结果：用引物pml，pm2对17个不同菌株进行PCR扩增。均得到371bp左右长度的DNA片段。特异性实验表明,此通用引物与人类基因组DNA、真菌及病毒无交叉反应。敏感性实验表明。用pml，pm2引物进行的PCR扩增可检测出20CFU／ml,结论：16S rRNA基因PCR检测方法具有特异、敏感、快速的特点。     

用cox1基因片段的PCR鉴别亚洲带绦虫和牛带绦虫

目的：用cox1基因片段的PCR技术对亚洲带绦虫和牛带绦虫的快速鉴别。方法：用亚洲带绦虫和牛带绦虫线粒体cox1基因片段的特异性引物以及带绦虫cox1基因片段的通用引物,对贵州省都匀地区和从江地区的带绦虫虫卵和节片DNA进行常规PCR扩增,扩增产物经琼脂糖凝胶电泳检测和核酸序列测定,并用NC-BI Blast对扩增产物的核酸序列与NCBI数据库中带绦虫的cox1基因进行比对。结果：5株都匀带绦虫DNA样品经亚洲带绦虫cox1基因片段的特异性引物PCR,均扩增出约260 bp的产物,PCR产物的核酸序列与NCBI数据库中亚洲带绦虫线粒体cox1基因片段的同源性为100%;2株从江带绦虫的DNA样品用亚洲带绦虫特异性引物和牛带绦虫特异性引物的PCR均未见扩增产物,而通用引物PCR则扩增出约1 000 bp的产物,核酸序列与NCBI数据库中牛带绦虫线粒体cox1基因片段的同源性为99%,在牛带绦虫特异性引物的结合位点存在一个碱基差异。结论：常规PCR扩增特异性的cox1基因片段可快速鉴定亚洲带绦虫;从江牛带绦虫株的cox1基因特异性片段部分存在变异,导致与特异性引物结合能力的差异,可采用cox1基因通用引物PCR结合测序进行鉴定。     

双引物聚合酶链反应同时快速检测梅毒螺旋体和单纯疱疹病毒Ⅱ型

目的 建立双引物聚舍酶链反应（PCR）用于同时快速检测梅毒螺旋体和单纯疱疹病毒Ⅱ型。方法 基于单纯疱疹病毒Ⅱ型（HSV-2）的DNA聚合酶基因以及梅毒螺旋体47KD膜蛋白基因序列，自行设计2对特异性寡核苷酸引物，建立了同时检测上速2种痛原体的双引物PCR。结果 各特异性引物仅扩增相应的病原体DNA，即单纯疱疹病毒Ⅱ型扩增产物为202bp以及梅毒螺旋体扩增产物为252bp。其他11种生殖道常见微生物及正常人基因组DNA不被扩增。检测了51例临床标本，梅毒螺旋体暗视野显微镜检查阳性检出率为15．7％，双引物PCR阳性检出率为19．6％；二种方法检测结果间比较差异均无统计学意义（P〉0．05）。HSV阳性培养率23．6％，双引物PCR阳性率47．1％，双引物PCR阳性检出率显著高于HSV培养且差异有统计学意义（P=0．019）；上速临床标本分别进行了2种痛原体的单引物PCR，与双引物PCR对照结果完全一致。结论 我们建立的双引物PCR一次可同时检测2种病原体，且有快速、敏感、特异以及简便的特点。     

流感嗜血杆菌16S rRNA和p6基因PCR检测结果比较

目的 比较流感嗜血杆菌(Hi) 16S rRNA和p6基因的PCR检测结果的差异.方法 以Hi的16S rRNA基因及外膜蛋白p6基因作为靶基因,设计特异性引物分别对临床标本分离的43株Hi进行PCR快速检测. 结果 34株16S rRNA基因扩增出538bp大小DNA片段,检出率为79%;43株p6基因均扩增出296bp大小DNA片段,检出率为100%.同时,其他细菌对照株16S rRNA和p6基因扩增均未出现假阳性结果.结论 相比于16S rRNA基因,p6基因对Hi检测和鉴定更具特异性,可用于临床对Hi感染疾病的快速诊断和流行病学研究.     

建立检测血清HBV DNA的多聚酶链反应技术

建立检测血清HBV DNA的多聚酶链反应技术。人工合成adr、adw和ayw三个业型HBV的两个共有序列NC1和NC2作为引物扩增一长428bp且含一BglⅡ酶切点的HBV C基因片段。含FD酶的反应体系在水浴93℃30秒、55℃60秒、72℃90秒依序循环30周期,当克隆HBV DNA模板最小加量为10 fg时,产物作琼脂糖凝胶电泳经溴化乙锭染色在紫外线下观察仍可见428 bp位置的阳性荧光带。阳性产物经BgⅠⅡ酶切后分为125 bp和303 bp的两个特异片段。同一条件下的阴性对照则出现阴性结果。这一技术用以检测经常规DNA提取的127例HBsAg阳性血清,结果HBV DNA检出率达88％,其中HBeAg阳性血清HBV DNA检出率为97％,抗HBeAg阳性血清HBV DNA检出率为82％。     

基于PCR指纹技术鹿鞭鉴定方法的建立及检测试剂盒的研制

目的 建立鹿鞭及其伪品指纹鉴定方法,开发鹿鞭DNA检测试剂盒.方法 采用改良的SDS方法从鹿鞭及牛鞭基因组中提取DNA.以鹿鞭线粒体细胞色素b作为靶基因,设计鹿鞭特异性引物,利用现代DNA指纹技术,研制了鹿鞭DNA提取和检测试剂,建立鹿鞭指纹鉴定方法,开发出鹿鞭DNA检测试剂盒.结果利用PCR指纹技术提取的鹿鞭基因组DNA为21000 bp,纯度为1.80±0.10之间;应用特异性引物可准确鉴别鹿鞭及牛鞭样品,鹿鞭特异性扩增产物DNA分子片段为307 bp,而牛鞭及阴性对照无扩增条带;自主研发鹿鞭DNA检测试剂盒经反复冻融依然有效,多次进行特异性、稳定性和重现性试验,结果完全一致.结论 鹿鞭DNA检测试剂盒可作为鹿鞭鉴定的有效方法,该方法客观、准确、方便,可有效区分鹿鞭及其伪品.