人脑神经干细胞对不同储存方式及分离培养和诱导分化条件的要求

背景：近年来发现神经干细胞可于体外增殖并分化为神经细胞，是用来修复替代损伤神经组织的较为理想的来源，但是神经干细胞的培养中如何提高它的增殖能力，诱导分化成需要的表现型，尚处于研究探讨阶段。目的：探讨细胞冻存和非冻存方法分离培养人脑神经干细胞及诱导其向成熟神经细胞分化的培养条件。设计：以细胞为观察对象，单一样本研究。单位：江西医学院泌尿外科研究所，江西医学院第二附属医院神经外科。材料：实验于2003-12／2004-06在江西医学院泌尿外科研究所完成。取16周龄新鲜人胚脑组织。方法：用胰蛋白酶消化法从人胚脑中分离单个细胞，细胞冻存1个月后复苏或／和新鲜细胞用无血清培养基进行体外培养，碱性成纤维细胞生长因子和表皮生长因子刺激细胞生长，用血清诱导其分化；采用免疫荧光细胞化学染色方法检测培养的细胞神经巢蛋白抗原和分化后成熟神经细胞抗原神经元特异性烯醇化酶的表达。观察碱性成纤维细胞生长因子和表皮生长因子及血清对分离培养的人脑神经干细胞增殖与分化的影响。主要观察指标：①冻存与新鲜细胞后续培养的生长状况。②细胞形态变化。③神经干细胞标志物神经巢蛋白及成熟神经细胞标志神经元特异性烯醇化酶的鉴定。结果：①从胚龄16周的新鲜人胚脑中成功分离出神经干细胞。人胚脑原代细胞为圆形亮球状，培养3d后可见细胞开始聚集成神经球，部分呈悬浮生长，2周后神经球增大，部分细胞增大数倍，具有极强折光性，可见分裂增殖。经传代后细胞仍保持原有特征，细胞形态不变。克隆细胞在有血清培养基中培养，24h后可见大部分细胞贴壁生长，细胞从神经球游出分散，形态不规则；48h后多数细胞分化为大量形态不一的、分散成片的多突起星状细胞和神经元样细胞，突起相互交织成网。②分离出的神经干细胞在体外培养条件下传代培养，并表达神经干细胞标志巢蛋白；含血清培养基培养48h分化后的细胞主要表达成熟神经细胞标志神经元特异性烯醇化酶。③冻存复苏的细胞95％，以上为活细胞，与新鲜细胞比较，细胞生长状况无明显差别。结论：用无血清培养条件下结合碱性成纤维细胞生长因子和表皮生长因子的作用，使干细胞体外得到了分离培养、增殖和纯化，证实其方法可行，同时冻存和新鲜细胞的比较，说明可用冻存方法保存人胚脑细胞，复苏后使用。     

人脑神经干细胞的分离培养及鉴定的研究

目的探讨分离培养人脑神经干细胞的方法及条件.方法用胰蛋白酶消化法从人胚脑中分离单个细胞,用无血清培养基进行体外培养,bFGF和EGF刺激细胞生长,用血清诱导其分化;采用免疫荧光细胞化学染色方法检测培养的细胞神经巢蛋白(Nestin)抗原和分化后成熟神经细胞抗原神经元特异性烯醇化酶(NSE)的表达.结果从胚龄16周的新鲜人胚脑中成功分离出神经干细胞.该细胞可在体外培养条件下传代培养,并表达神经干细胞标志Nestin;分化后的细胞主要表达成熟神经细胞标志NSE.结论在体外培养条件下可从人胚脑中分离培养出神经干细胞.     

人脑神经干细胞的分离培养及鉴定的研究

目的探讨分离培养人脑神经干细胞的方法及条件。方法用胰蛋白酶消化法从人胚脑中分离单个细胞,用无血清培养基进行体外培养,bFGF和EGF刺激细胞生长,用血清诱导其分化;采用免疫荧光细胞化学染色方法检测培养的细胞神经巢蛋白(Nestin)抗原和分化后成熟神经细胞抗原神经元特异性烯醇化酶(NSE)的表达。结果从胚龄16周的新鲜人胚脑中成功分离出神经干细胞。该细胞可在体外培养条件下传代培养,并表达神经干细胞标志Nestin;分化后的细胞主要表达成熟神经细胞标志NSE。结论在体外培养条件下可从人胚脑中分离培养出神经干细胞。     

大胚龄人神经干细胞长期冻存后的复苏培养

目的探讨长期冻存后的大胚龄人胚神经干细胞（neural stem cells,NSCs）的生长及其生物学特性。方法分别于冻存后6、12及24个月,快速解冻复苏胚龄为16～20周的胎脑细胞,采用无血清培养液悬浮培养,观察培养细胞的活性及成球时间,采用免疫细胞化学方法鉴定这些细胞球及其分化成熟后的细胞表面标志。结果培养传代的细胞透亮﹑成球时间短,与取自新鲜胎脑的神经干细胞无明显区别。细胞球Nestin染色阳性,成熟分化后神经元特异性烯醇化酶（NSE）、胶质纤维酸性蛋白（GFAP）及2＇,3＇-环腺苷酸-3＇-磷酸二酯酶（CNPase）抗原呈阳性。结论长期冻存后的人大胚龄神经干细胞仍具有较强增殖能力及多分化潜能。     

两份人脐血间充质干细胞混合培养及向神经元样细胞的分化

背景:脐血间充质干细胞可诱导分化为神经样细胞,但在临床中发现干细胞培养细胞增殖的数量不足.目的:观察两份脐血间充质干细胞混合培养的生长情况,以及经碱性成纤维细胞生长因子诱导脐血间充质干细胞向神经元样细胞的分化.设计、时间及地点:于2007-01/10在郑州大学基础医学院微生物与免疫学实验室完成以细胞为对象的对照观察性实验.材料:健康分娩产妇自愿捐献的脐血60~180mL.方法:应用Ficoll-Hypaque淋巴细胞分离液以密度梯度法获取脐血间充质干细胞,加入碱性成纤维细胞生长因子诱导分化.当细胞传至第3代时,随机取培养的6份脐血间充质干细胞(半量)为A组,6份脐血间充质干细胞(半量)为B组,将A、B组各剩余的半量脐血间充质干细胞混合为C组.3组细胞密度均为1.0×104 L-1.主要观察指标:以活细胞计数和MTT比色法比较3组细胞扩增数量,免疫组织化学检测脐血间充质干细胞神经胶质细胞标志物、神经元特异性烯醇化酶和巢蛋白的表达.结果:活细胞计数和MTT比色检测显示,将两份不同脐血间充质干细胞混合后,细胞贴壁比单份脐血间充质干细胞快(P＜0.05),增殖也非常快(P＜0.05).3组细胞经碱性成纤维细胞生长因子诱导后均表达神经胶质细胞标志物、神经元特异性烯醇化酶和巢蛋白,并且巢蛋白阳性表达率无差别(P＞0.05).结论:混合脐血间充质干细胞之间有互相促增殖作用,应用碱性成纤维细胞生长因子诱导的脐血间充质干细胞可表达神经胶质细胞标志物、神经元特异性烯醇化酶和巢蛋白.     

无血清条件下体外分离培养鼠胚胎脑组织神经干细胞

背景:神经干细胞的体外培养成功为治疗中枢神经系统疾病提供了新的思路,但神经干细胞的分化和功能修复机制尚不甚清楚.移植后的细胞能否与体内细胞结合以及建立起正常的神经系统突触联系急需解决.目的:在无血清条件下体外分离培养胚鼠神经干细胞,观察其生长及分化情况.设计、时间及地点:细胞学体外观察,于2007-03/2008-01在天津市环湖医院神经干细胞室完成.材料;孕14～16 d的SD大鼠,由北京维通利华实验动物中心提供.方法:取孕鼠胚胎的脑海马组织.通过机械分离和胰蛋白酶消化结合法体外分离培养神经干细胞,在含有碱性成纤维细胞生长因子、表皮生长因子及B27的无血清DMEM/F12培养基中传代扩增.取原代培养7 d的神经干细胞,制备单细胞悬液,接种后加入含体积分数为10%胎牛血清的DMEM培养液诱导3 d.主要观察指标:倒置显微镜下观察神经干细胞的增殖分化过程,并行免疫荧光染色鉴定.通过细胞免疫化学染色检测诱导分化后的细胞类犁.结果:分离培养的神经干细胞在无血清培养基中不断分裂增殖,8 d左右即可形成胞体透亮、折光性好的干细胞球,悬浮生长,免疫荧光染色巢蛋白呈阳性表达.神经干细胞球诱导5 d,免疫细胞化学染色后可见胶质纤维酸性蛋白及神经元特异性烯醇酶呈阳性表达的细胞.结论:体外无血清条件下,分离培养的神经干细胞生长状态良好,且具有自我更新和增殖能力.诱导后能够向神经元及星形胶质细胞方向分化.     

大胚龄人神经干细胞长期冻存后的复苏培养

目的 探讨长期冻存后的大胚龄人胚神经干细胞(neural stem cells,NSCs)的生长及其生物学特性.方法 分别于冻存后6、12及24个月,快速解冻复苏胚龄为16～20周的胎脑细胞,采用无血清培养液悬浮培养.观察培养细胞的活性及成球时间,采用免疫细胞化学方法鉴定这些细胞球及其分化成熟后的细胞表面标志.结果 培养传代的细胞透亮、成球时问短,与取自新鲜胎脑的神经干细胞无明显区别.细胞球Nestin染色阳性,成熟分化后神经元特异性烯～M(NSE)、胶质纤维酸性蛋白(GFAP.)及2,3',-环腺苷酸-3,-磷酸二酯酶(CNPase)抗原呈阳性.结论 长期冻存后的人大胚龄神经干细胞仍具有较强增殖能力及多分化潜能.     

碱性成纤维生长因子和神经生长因子联合应用培养成年大鼠海马神经干细胞向神经元样细胞的分化

背景：影响神经干细胞向神经元分化的因素很多,各种营养因子可以不同程度地刺激神经干细胞向神经元分化,如何使神经干细胞大量分化为神经元是研究的热点问题。目的：观察联合应用碱性成纤维生长因子和神经生长因子对成年大鼠海马神经干细胞为神经元的影响。方法：无菌条件下分离大鼠脑海马组织,传至第4代克隆球直径约为200μm时,滴加DMEM/F12＋2%B27＋20μg/L表皮生长因子＋20μg/L碱性成纤维细胞生长因子,进行单细胞克隆培养,传代的神经干细胞分成空白对照组、碱性成纤维细胞生长因子组、神经生长因子组、碱性成纤维细胞生长因子＋神经生长因子组。观察传代后的克隆球进行神经干细胞免疫细胞化学染色鉴定,计数神经元特异性烯醇化酶阳性细胞率,检测神经干细胞向神经元的分化情况。结果与结论：①单细胞克隆培养后,克隆球细胞表达巢蛋白,诱导分化后神经元特异性烯醇化酶、胶质纤维酸性蛋白均呈阳性表达。②与空白对照组神经干细胞分化为神经元的比例比较,碱性成纤维细胞生长因子组、神经生长因子组、碱性成纤维细胞生长因子组＋神经生长因子组均明显提高（P〈0.05）,且碱性成纤维细胞生长因子组＋神经生长因子组神经元的比例最高（P〈0.05）。提示,碱性成纤维细胞生长因子可以提高神经生长因子诱和神经生长因子均可促进神经干细胞向神经元分化,且二者联合应用效果更佳。     

碱性成纤维生长因子和神经生长因子联合应用培养成年大鼠海马神经干细胞向神经元样细胞的分化

背景:影响神经干细胞向神经元分化的因素很多,各种营养因子可以不同程度地刺激神经干细胞向神经元分化,如何使神经干细胞大量分化为神经元是研究的热点问题。目的:观察联合应用碱性成纤维生长因子和神经生长因子对成年大鼠海马神经干细胞为神经元的影响。方法:无菌条件下分离大鼠脑海马组织,传至第4代克隆球直径约为200μm时,滴加DMEM/F12+2%B27+20μg/L表皮生长因子+20μg/L碱性成纤维细胞生长因子,进行单细胞克隆培养,传代的神经干细胞分成空白对照组、碱性成纤维细胞生长因子组、神经生长因子组、碱性成纤维细胞生长因子+神经生长因子组。观察传代后的克隆球进行神经干细胞免疫细胞化学染色鉴定,计数神经元特异性烯醇化酶阳性细胞率,检测神经干细胞向神经元的分化情况。结果与结论:①单细胞克隆培养后,克隆球细胞表达巢蛋白,诱导分化后神经元特异性烯醇化酶、胶质纤维酸性蛋白均呈阳性表达。②与空白对照组神经干细胞分化为神经元的比例比较,碱性成纤维细胞生长因子组、神经生长因子组、碱性成纤维细胞生长因子组+神经生长因子组均明显提高(P<0.05),且碱性成纤维细胞生长因子组+神经生长因子组神经元的比例最高(P<0.05)。提示,碱性成纤维细胞生长因子可以提高神经生长因子诱和神经生长因子均可促进神经干细胞向神经元分化,且二者联合应用效果更佳。     

星形胶质细胞瘤干细胞的体外分离、培养与鉴定

背景:肿瘤干细胞理论认为肿瘤中存在一小部分具有无限增殖潜能和自我更新能力,能够分化为成熟细胞表型的干细胞样细胞,对肿瘤发生、增殖、侵袭起关键作用。目的:建立体外分离、培养与鉴定星形胶质细胞瘤干细胞的方法。方法:采用直接培养法分离培养星形胶质细胞瘤干细胞。参照神经干细胞培养条件,进行体外培养。观察其增殖、分化并进行巢蛋白、CD133免疫细胞化学鉴定和诱导分化后神经元特异性烯醇化酶、胶质纤维酸性蛋白及O4免疫细胞化学鉴定。结果与结论:培养7-10d,可形成大量悬浮生长巢蛋白及CD133免疫阳性的神经球,经诱导分化后细胞呈神经元特异性烯醇化酶、胶质纤维酸性蛋白或O4免疫阳性。提示星形胶质细胞瘤中存在具有神经干细胞特性的肿瘤干细胞。CD133和巢蛋白是星形胶质细胞瘤干细胞重要的表面标记,可以用于星形胶质细胞瘤干细胞的分离。     

血清预培养促进神经干细胞的增殖

目的 介绍一种时间短、花费少的神经干细胞培养方法。方法 先用含10％胎牛血清的DMEM培养液预培养神经干细胞48h，换含表皮生长因子、碱性成纤维细胞生长因子、B27的DMEM／F12培养液继续培养干细胞球。血清诱导分化后行nestin免疫荧光染色。结果 血清预培养48h后即可见神经干细胞聚球，nestin免疫荧光染色为阳性。结论 血清预培养可使神经干细胞聚球速度加快，促进神经干细胞增殖。     

昆明种小鼠胚胎神经干细胞的分离及培养

目的：在神经干细胞的分离培养过程中，国内外的报道多数是用胰蛋白酶对组织细胞进行消化，但是消化时间比较难把握。采用胰酶消化与机械分离法相结合的方式对昆明种小鼠胚胎脑神经干细胞进行分离、培养和初步的免疫组织化学检测，为相关研究建立实验条件。 方法：实验于2006—10／2007-09在广西医科大学基础医学实验室完成。实验室为广西重点实验室、基础医学博士后工作站。①实验材料：孕14-16d的昆明种小鼠由广西医科大学实验动物中心提供，实验过程中对动物处置符合动物伦理学标准。②实验方法：分离昆明种小鼠胎鼠的脑组织，经胰酶消化加机械吹打后，在加入碱性成纤维细胞生长因子和表皮细胞生长因子的B27无血清培养基中培养。③实验评估：用免疫细胞化学方法鉴定分离的神经干细胞。 结果：在无血清DMEM／F12培养液中，加入碱性成纤维细胞生长因子、表皮细胞生长因子及B27的条件下，培养24h后可见细胞以悬浮方式生长，三五聚集成团块，48h后形成由十数个至数十个细胞组成的，大小不等的细胞球，形态规则，细胞无突起，形成典型的神经球，可传代。免疫细胞化学法检测显示，细胞表达神经巢蛋白。 结论：①来自昆明种小鼠胎脑的神经干细胞能在体外培养、增殖并具有增殖传代能力。②无血清B27培养基添加表皮细胞生长因子、碱性成纤维细胞生长因子有利于神经干细胞的体外培养和促进其增殖。     

人胎脑皮质神经干细胞的分离培养及鉴定

目的探讨人脑皮质中分离培养神经干细胞并鉴定其增殖及分化潜能。方法采用包含碱性成纤维细胞生长因子(bFGF)和表皮细胞生长因子(EGF)的无血清培养和单细胞克隆技术，从30周自愿水囊引产人胎脑皮质中分离出神经干细胞，并进行培养、传代、分化观察，应用免疫组织化学染色对培养的细胞及其分化的细胞进行鉴定。结果从30周人胎脑皮质中成功分离出具有自我更新和多分化潜能的神经干细胞，在无血清培养时细胞呈悬浮状态生长，形成神经球，该细胞具有连续克隆能力，可传代培养，表达神经巢蛋白抗原(Nestin)；在含血清培养时诱导神经干细胞分化，分化后的细胞表达神经元细胞和胶质细胞的特异性抗原。结论神经干细胞的存活和分裂有赖于EGF和bFGF的共同作用；30周人胎脑皮质仍能培养出具有自我复制和分化潜能的神经干细胞。     

表皮生长因子和碱性成纤维细胞生长因子对人胎脑室下区神经干细胞增殖分化的影响

背景由于神经干细胞分化的多向性和不确定性给临床应用造成巨大困难,因此,探讨神经干细胞增殖分化条件已成为解决这一问题的关键.目的观察表皮生长因子和碱性成纤维细胞生长因子对人胎脑神经干细胞增殖分化的影响. 设计以培养的人胚神经干细胞为观察对象,随机对照实验.单位解放军第一军医大学珠江医院儿科.材料实验于2004-01/05在全军儿科中心实验室进行.随机在广州市某三级甲等医院产科选取自愿水囊引产的16周胎儿2例(胎儿父母签署同意书),取其脑室下区组织分别在无血清培养基和血清培养基进行细胞培养.方法采用含有表皮生长因子、碱性成纤维细胞生长因子以及表皮生长因子+碱性成纤维细胞生长因子的无血清培养基对人胎脑室下区组织进行原代细胞培养;两种生长因子的浓度均为20 μg/L,采用血清培养基对原代培养的细胞克隆球进行分化实验;并采用免疫组化技术对分化细胞进行检测.主要观察指标各组克隆球数量及其分化为神经元和星形胶质细胞的变化.结果①碱性成纤维细胞生长因子组、表皮生长因子+碱性成纤维细胞生长因子组形成的原代克隆球数量无显著差异[(150.3±14.9),(173.6±26.4)个/孔,P＞0.05],但均明显多于表皮生长因子组[(99.5±14.9)个/孔,P＜0.01].②碱性成纤维细胞生长因子组以及表皮生长因子+碱性成纤维细胞生长因子组克隆球分化为神经元的数量明显多于表皮生长因子组,而表皮生长因子组产生较多的星形胶质细胞.结论①碱性成纤维细胞生长因子能促进人胎脑室下区神经干细胞增殖,所形成的细胞克隆球能分化出较多的神经元.②两种因子合用并没有获得明显的优于单用碱性成纤维细胞生长因子的结果,提示不存在协同作用.     

大鼠视网膜干细胞的增殖和多向分化

背景：国内对视网膜干细胞的体外分离培养及鉴定仍处于初步探索阶段。目的：体外分离、培养及鉴定新生大鼠视网膜干细胞,探讨其多向分化潜能。方法：用神经干细胞无血清培养方法分离和培养新生24h的SD大鼠睫状体细胞,第6代视网膜干细胞经胎牛血清诱导分化,应用免疫细胞化学方法检测视网膜干细胞的分化特性。结果与结论：体外培养的细胞球具有连续克隆能力,Nestin抗原阳性,BrdU标记结果显示悬浮细胞团主要由分裂增殖的细胞组成,并表达胚胎发育早期视网膜内原始细胞的特异性抗原Chx-10;诱导分化后的细胞表达星形胶质细胞特异性标志物GFAP、神经元特异性标志物NSE、感光细胞标志物Opsin、双极细胞特异性抗原PKC和节细胞特异性抗原β-tubulin,实验初步证实培养的视网膜干细胞具有神经干细胞特性,能自我更新和增殖分化成为感光细胞类型的细胞。     

胚胎大鼠原代神经干细胞培养方法的改进

背景:神经干细胞增殖分化受体内外微环境的影响,不同细胞培养液对细胞的增殖分化有不同的作用.目的:改进传统上应用无血清培养液培养原代神经干细胞的方法,寻找一种快速便捷的培养方式.设计、时间和地点:随机对照细胞实验,于2005-11/2006-09在青岛大学医学院脑科研究所完成.材料:选用孕后12～16 d 的Wistar大鼠10只,取胎鼠脑组织制成细胞悬液.方法:将配置的细胞密度约1×109个/mL滤液接种入4个50 mL细胞培养瓶,分为2组:对照组和实验组,每组2个培养瓶.对照组加入DMEM/F12、2?7型人类白细胞抗原、20 mg/L的碱性成纤维细胞生长因子,20 mg/L的表皮生长因子无血清培养液,实验组加入DMEM/F12、5%胎牛血清,两三天后换为与对照组相同的无血清培养液.主要观察指标:应用倒置显微镜和免疫细胞化学法观察两组神经干细胞的增殖生长状况.结果:神经干细胞生长状态:①两组大多数细胞表达神经干细胞的特征性标志抗原神经巢蛋白,免疫染色呈阳性反应.②实验组神经干细胞的聚球速度明显快于对照组,可提前三四天观察到神经干细胞球.③两组细胞数量基本无差异,实验组细胞球体较对照组大.经血清培养液诱导分化后部分呈神经元特异性烯醇酶阳性,部分呈神经胶质酸性蛋白阳性,表明神经干细胞已分化为神经元样细胞和神经胶质细胞.结论:含血清培养液预先培养可以加快神经干细胞增殖生长速度.     

新生小鼠海马神经干细胞体外培养条件下的增殖与分化

背景：神经干细胞移植可用于中枢神经损伤的临床治疗。目的：观察新生小鼠海马神经干细胞在体外培养条件下的增殖和分化。方法：从新生昆明小鼠海马取材,采用机械分离法对原代细胞进行无血清培养,采用机械法复合酶消化法对原代细胞进行传代,以体积分数为10%胎牛血清诱导分化。免疫荧光行巢蛋白、β-微管蛋白Ⅲ和胶质纤维酸性蛋白染色,对培养的细胞进行鉴定。CCK-8法检测神经干细胞增殖能力。结果与结论：从新生小鼠海马分离得到的细胞具有连续传代形成克隆球的能力,克隆球呈巢蛋白免疫反应阳性;加入胎牛血清可诱导分化为β-微管蛋白Ⅲ和胶质纤维酸性蛋白阳性细胞。提示实验成功建立了体外培养新生小鼠海马组织分离和培养神经干细胞的方法,培养的神经干细胞在体外培养条件下保持着自我增殖和分化的潜能。     

昆明种小鼠胚胎神经干细胞的分离与培养

背景：对于神经千细胞的分离培养,目前多采用胰蛋白酶对组织细胞予以消化,但消化时间较难把握。 目的：采用胰酶消化与机械分离法相结合的方式对昆明种小鼠胚胎脑神经干细胞进行分离、培养,并进行初步的免疫组织化学检测。 设计、时间及地点：细胞学体外观察,于2006～10/2007—09在广西医科大学基础医学实验室完成。材料：孕14-16d的昆明种小鼠由广西医科大学实验动物中心提供。 方法：分离昆明种小鼠胎鼠的脑组织,经胰酶消化加机械吹打后,在加入碱性成纤维细胞生长因子和表皮细胞生长因子的B27无血清DMEMIF12培养基中培养。主要观察指标：用免疫细胞化学方法鉴定分离的神经干细胞。结果：培养24h后,细胞以悬浮方式生长,聚集成团：48h后形成由数十个细胞组成的细胞球,形态规则,体积大小不等,细胞无突起,形成典型的神经球,可传代扩增。免疫细胞化学染色结果示细胞巢蛋白呈阳性表达。 结论：在含有表皮细胞生长因子、碱性成纤维细胞生长因子的无血清B27培养基条件下,有利于小鼠胚胎神经干细胞的体外培养和传代增殖。     

含碱性成纤维细胞生长因子和表皮生长因子培养基先后作用培养建立大鼠胚胎神经干细胞克隆的实验

背景体外培养获得神经干细胞的有效方法是干细胞实验研究中很值得关注的问题.目的观察应用含有不同生长因子的培养基体外培养神经干细胞的有效方法.设计单一样本观察.单位四川大学生命科学院细胞生物学实验室.材料孕14 d SD大鼠10只,DMEM/F12 11,碱性成纤维细胞生长因子,表皮生长因子;巢蛋白抗体IgG,β-微管蛋白Ⅲ抗体Ig G,胶质纤维酸性蛋白抗体Ig G,生物素标记二抗和三抗、异硫氰酸荧光素标记二抗.方法实验于1999/2001在四川大学生命科学院细胞生物学实验室完成.①从胎鼠前脑取出脑组织,采用酶消化、机械吹打、离心、培养原代神经干细胞克隆.②神经干细胞以2×108L-1密度接种培养,分4组,每组6瓶细胞,DMEM/F12组加入DMEM/F12(11)培养基含体积分数为0.1的小牛血清;碱性成纤维细胞生长因子组培养基为含20μg/L碱性成纤维细胞生长因子;表皮生长因子组培养基含30μg/L表皮生长因子;碱性成纤维细胞生长因子+表皮生长因子组先用含碱性成纤维细胞生长因子的培养基培养2 h后再换成含表皮生长因子的培养基培养.培养24 h后更换培养瓶,培养14 d后显微镜下计数原代克隆数,免疫组化法检测干细胞特殊标记蛋白巢蛋白的表达.主要观察指标①神经干细胞的原代克隆.②单细胞克隆培养结果.③诱导分化结果.结果①从胎鼠脑中分离的细胞具有连续传代形成克隆的能力,免疫荧光化学显示细胞球内细胞巢蛋白表达阳性.②采用含碱性成纤维细胞生长因子和表皮生长因子培养基先后作用培养的方法形成神经干细胞克隆率最高(0.630%).③培养的神经干细胞克隆能诱导分化成神经元和神经胶质细胞.结论①结果证实培养分离的细胞是神经干细胞.②采用含碱性成纤维细胞生长因子和表皮生长因子培养基先后作用培养的方法是获得神经干细胞的有效方法.     

不同体外诱导培养条件下新生鼠基底前脑神经干细胞增殖和分化为神经元的能力

目的：研究神经干细胞的增殖、迁移和分化可为揭示神经系统的发生、发育过程提供可靠依据。观察表皮生长因子和碱性成纤维生长因子在体外刺激新生鼠基底前脑神经干细胞的增殖情况，及其各自诱导神经干细胞分化成神经元的能力。 方法：实验于2005-12／2006—07在广州医学院解剖学教研室完成。①动物：清洁级新生24h内的SD大鼠30只，实验过程中对动物的处置符合动物伦理学标准。②实验方法：新生鼠在无菌条件下取脑，分离出基底前脑，胰蛋白酶消化，离心过滤制备单细胞悬液，接种于含B27的DMEM／F12培养基培养瓶中，每瓶40-60万个细胞，加入终浓度均为10μg／L的表皮生长因子和碱性成纤维生长因子刺激生长，在体外进行神经干细胞的克隆培养，传代培养过程中加入终浓度为6mg／LBrdU用于标记神经球，设立3组，各自加入体积分数为0．1的小牛血清、终浓度均为10μg／L的表皮生长因子、碱性成纤维生长因子，对培养得到的神经干细胞进行诱导分化。③实验评估：免疫荧光染色检测神经干细胞巢蛋白抗原的表达，并用BrdU标记和免疫荧光证实其增殖能力。免疫荧光染色检测不同诱导条件下神经干细胞向神经元分化的能力。 结果：①细胞形态观察：从新生鼠基底前脑成功分离出神经干细胞，原代培养呈透亮的圆球形，2—3d后细胞数目明显减少，部分细胞开始分裂。1周左右培养瓶中出现许多由数十到数百个细胞组成的悬浮生长的细胞球，球中的细胞形态规则，边界清楚，折光性较强，胞浆颜色较深，核，浆比较大。该细胞具有连续增殖能力，可以传代培养。②巢蛋白抗原的表达：传代神经球中的细胞均呈巢蛋白抗原阳性。③BrdU标记检测：克隆球中的细胞均为BrdU阳性，表明克隆球是由不断分裂增殖的细胞组成。④诱导分化结果：?