弓形虫排泄分泌抗原对B16F10黑素瘤小鼠CD4^＋CD25^＋Foxp3^＋T细胞和NK细胞的影响

目的探讨弓形虫排泄分泌抗原（ESA）对B16F10黑素瘤小鼠CD4＋CD25＋Foxp3＋T细胞和NK细胞数量和功能的影响,观察ESA对肿瘤生长的作用。方法将传代培养的B16F10黑素瘤细胞接种于C57BL/6小鼠右腋窝皮下,建立荷瘤动物模型。采用ESA腹腔注射进行干预,将实验小鼠分为4组：PBS组、B16F10组、PBS＋ESA组、B16F10＋ESA组,分别于ESA干预后2、4、6d取脾,流式细胞术检测各组小鼠脾脏CD4＋CD25＋Foxp3＋T细胞和NK细胞占脾细胞的比例;WST-8法检测各组小鼠CD4＋CD25＋T细胞对CD4＋CD25-T细胞增殖的抑制功能;LDH法检测NK细胞杀伤B16F10功能;观测荷瘤鼠肿瘤体积动态变化。结果 ESA干预4、6d后,荷瘤鼠脾脏CD4＋CD25＋Foxp3＋T细胞占脾细胞的比例分别为（1.65±0.18）%和（1.56±0.17）%,与荷瘤对照组[分别为（2.47±0.10）%和（2.82±0.12）%]比较差异均有统计学意义（P均〈0.05）;ESA干预可使CD4＋CD25＋T细胞对CD4＋CD25-T细胞的抑制功能下降。抑制作用以干预后4、6d较明显,抑制率分别为50.03%和50.00%,低于荷瘤对照组的75.03%和78.14%（P均〈0.05）;荷瘤鼠脾脏NK细胞占脾细胞的比例[（3.58±0.07）%]在ESA干预后6d显著高于荷瘤对照组的（2.61±0.13）%（P〈0.05）。同时NK细胞杀伤B16F10细胞功能也增强,不同效靶细胞比（5∶1、10∶1、20∶1）下分别为26.51%、35.25%、60.19%,明显高于荷瘤对照组的16.81%、24.63%、45.62%（P均〈0.05）;ESA干预后,瘤体出现延缓生长,平均出瘤时间较对照组延迟6d,实验终点荷瘤第35天ESA干预组瘤体体积[（6208.34±443.64）mm3]明显小于荷瘤对照组[（9027.46±1362.01）mm3]（P〈0.05）。结论弓形虫ESA可通过下调荷瘤鼠CD4＋CD25＋Foxp3＋T细胞比例并抑制其功能和上调NK细胞比例并增强其杀伤功能,发挥抗肿瘤作用。     

弓形虫排泄分泌抗原对Lewis肺癌小鼠瘤体生长的抑制作用

目的　探讨弓形虫排泄分泌抗原（ESA）对Lewis肺癌小鼠CD4+CD25+ Foxp3+ T（Treg）细胞亚群的影响,观察弓形虫ESA对肿瘤生长的抑制作用。方法　将C57BL/6小鼠随机分成PBS组（14只）和Lewis组（34只）。Lewis组小鼠右腋窝皮下接种Lewis肺癌细胞2 × 105个,PBS组注射等量无菌PBS。接种后第7 天（D7）,将PBS组小鼠分成PBS2组、PBS2 + ESA组,每组7只;将Lewis组分成Lewis2组和Lewis2 + ESA组,每组17只; PBS2 + ESA组及Lewis2 + ESA组小鼠腹腔注射100 μL弓形虫 ESA。ESA干预后7 d计算各组小鼠脾脏系数,检测Treg细胞数量变化,同时观察荷瘤鼠长期瘤体生长情况。结果　ESA干预后7 d,PBS2 + ESA组[（0.66 ± 0.09）%]和Lewis2 + ESA组[（0.69 ± 0.07）%]脾脏明显增大,脾脏系数与PBS2组[（0.30 ± 0.02）%]和Lewis2组[（0.33 ± 0.03）%]比较,差异均有统计学意义（P 均 < 0.05）。PBS2 + ESA组[（1.28 ± 0.14）%]和Lewis2 + ESA组[（1.58 ± 0.14）%]脾脏Treg细胞占脾细胞的比例均下降,与PBS2组[（2.06 ± 0.07）%]和Lewis2组[（2.44 ± 0.23）%]比较差异均有统计学意义（P 均< 0.05）。ESA干预后,瘤体生长延缓,在实验终点时,Lewis2 + ESA组小鼠瘤体明显小于Lewis2组（P < 0.05）。结论　ESA可下调荷瘤鼠脾脏Treg细胞占脾细胞的比例,抑制瘤体生长。     

弓形虫排泄分泌抗原对Lewis肺癌小鼠瘤体生长的抑制作用

目的　探讨弓形虫排泄分泌抗原（ESA）对Lewis肺癌小鼠CD4+CD25+ Foxp3+ T（Treg）细胞亚群的影响，观察弓形虫ESA对肿瘤生长的抑制作用。方法　将C57BL/6小鼠随机分成PBS组（14只）和Lewis组（34只）。Lewis组小鼠右腋窝皮下接种Lewis肺癌细胞2 × 105个，PBS组注射等量无菌PBS。接种后第7 天（D7），将PBS组小鼠分成PBS2组、PBS2 + ESA组，每组7只；将Lewis组分成Lewis2组和Lewis2 + ESA组，每组17只； PBS2 + ESA组及Lewis2 + ESA组小鼠腹腔注射100 μL弓形虫 ESA。ESA干预后7 d计算各组小鼠脾脏系数，检测Treg细胞数量变化，同时观察荷瘤鼠长期瘤体生长情况。结果　ESA干预后7 d，PBS2 + ESA组[（0.66 ± 0.09）%]和Lewis2 + ESA组[（0.69 ± 0.07）%]脾脏明显增大，脾脏系数与PBS2组[（0.30 ± 0.02）%]和Lewis2组[（0.33 ± 0.03）%]比较，差异均有统计学意义（P 均 < 0.05）。PBS2 + ESA组[（1.28 ± 0.14）%]和Lewis2 + ESA组[（1.58 ± 0.14）%]脾脏Treg细胞占脾细胞的比例均下降，与PBS2组[（2.06 ± 0.07）%]和Lewis2组[（2.44 ± 0.23）%]比较差异均有统计学意义（P 均< 0.05）。ESA干预后，瘤体生长延缓，在实验终点时，Lewis2 + ESA组小鼠瘤体明显小于Lewis2组（P < 0.05）。结论　ESA可下调荷瘤鼠脾脏Treg细胞占脾细胞的比例，抑制瘤体生长。     

自然杀伤细胞抑制血吸虫病肝纤维化作用的研究

目的 通过单抗敲低或过继自然杀伤(NK)细胞,探讨NK细胞在血吸虫病肝纤维化中的作用。方法 24只C57BL/6健康小鼠取肝脏,制备NK细胞,用白细胞介素-15 (IL-15)、IL-2、IL-18活化NK细胞。40只C57BL/6健康小鼠随机分为单抗组、IgG组、生理盐水组、NK细胞组、PBS组等5组,每组8只,每鼠经腹部贴片感染日本血吸虫尾蚴(20±1)条。单抗组、IgG组和生理盐水组小鼠于感染前1周开始,每周分别尾静脉注射1次抗NK1.1单抗(100μg/鼠)、IgG (100μg/鼠)、生理盐水,每次200μl/鼠;NK细胞组和PBS组小鼠于感染后4周开始,每周分别尾静脉注射1次活化的NK细胞(1×10~5/鼠)、PBS,每次200μl/鼠。感染后6和8周,分别取各组小鼠肝脏,流式细胞术检测小鼠肝NK细胞比例变化,Masson染色观察肝组织纤维化变化,荧光定量PCR检测Ⅰ型胶原蛋白(Ⅰ-C)、Ⅲ-C、Ⅳ-C、层黏连蛋白(LN)、纤维连接蛋白(FN) mRNA相对转录水平等肝纤维化指标。结果感染后6周,单抗组肝NK细胞比例为(2.56±0.47)%,低于IgG组的(4.75±0....     

重组小鼠干扰素-γ对感染弓形虫孕鼠T细胞亚群自然杀伤细胞的影响

目的 探讨重组小鼠γ-干扰素（rmu-IFN-γ）对妊娠期感染弓形虫的小鼠脾脏T细胞亚群和自然杀伤细胞（NK细胞）水平的影响。 方法 20只BALB/c孕鼠随机分为空白对照、感染对照及rmu-IFN-γ治疗组。妊娠第7～9 天孕鼠急性感染弓形虫,rmu-IFN-γ分为2个剂量组（按小鼠体重1 U/g和10 U/g）腹腔注射给药,3 d后每组随机处死5只,取脾细胞,流式细胞术检测T细胞亚群和NK细胞水平。 结果 两种剂量rmu-IFN-γ治疗组CD4+ T细胞水平在妊娠第10、12、14 天高于感染对照组,CD8+ T细胞水平在妊娠第10、14天低于感染对照组,CD4+/CD8+ T细胞比值在妊娠第10、12、14 天高于感染对照组（P<0.05）,孕鼠存活时间长于感染对照组。 结论 注射适量rmu-IFN-γ可改善CD4+/CD8+ T细胞比值,促进NK细胞增殖,提高宿主免疫水平。     

约氏疟原虫感染对小鼠黑色素瘤的抑制作用

目的观察约氏疟原虫17XL虫株感染对小鼠黑色素瘤的抑制作用。方法取C57BL/6小鼠20只,腋下注射传代培养的B16F10黑色素瘤细胞;次日,将小鼠随机分为约氏疟原虫(P.y)感染组和对照组2组,10只/组;P.y感染组小鼠每只腹腔注射1×106个含虫红细胞率为20%的小鼠红细胞;对照组小鼠腹腔注射等量的C57BL/6小鼠正常红细胞。观察两组小鼠黑色素瘤出瘤时间并测量肿瘤的体积。结果 P.y感染组小鼠黑色素瘤出瘤时间为注射黑色素瘤细胞后(11.30±0.21)d,晚于对照组[(10.40±0.22)d](P0.05);自可精确测量瘤体起至实验终点,2组小鼠肿瘤均不断增长,P.y感染组瘤体体积均显著小于对照组(P均0.05);P.y感染组瘤体生长速度为(71.10±6.29)mm3/d,明显慢于对照组[(302.80±49.94)mm3/d](P0.05),且P.y感染组肿瘤每日生长速度亦明显慢于对照组(P均0.05)。结论约氏疟原虫感染可以延缓肿瘤出瘤时间,且对小鼠黑色素瘤瘤体的增长具有明显的抑制作用。     

刚地弓形虫排泄-分泌抗原体外诱导的IFN-γ促CD4~+CD25~+调节性T细胞凋亡作用

目的研究刚地弓形虫(Toxoplasma gondii)RH株和Tg Ctwh3株排泄-分泌抗原(ESA)体外诱导小鼠CD4~+CD25~+调节性T细胞凋亡和IFN-γ分泌方面的差异。方法分别制备刚地弓形虫RH株和Tg Ctwh3株的ESA。将分离的野生型C57BL/6小鼠脾单个核细胞随机分为3组(每孔2×10~6细胞),分别加入RH株ESA、Tg Ctwh3株ESA(均为10μg/ml)和鸡卵清蛋白(OVA)进行诱导刺激,流式细胞术检测各组诱导刺激48 h和72 h的CD4~+CD25~+调节性T细胞的早期凋亡情况,ELISA检测各组诱导刺激72 h细胞培养上清中的γ干扰素(IFN-γ)分泌水平。另外,将分离的野生型C57BL/6小鼠脾单个核细胞随机分为2大组(每孔2×10~6细胞),其中一大组在分别加入两株ESA(10μg/ml)和OVA的同时加入抗IFN-γ中和抗体(10μg/ml)进行诱导刺激72 h,流式细胞术检测各组CD4~+CD25~+调节性T细胞早期凋亡情况。用两虫株ESA(10μg/ml)及OVA分别诱导刺激IFN-γ基因敲除型和野生型C57BL/6小鼠的脾单个核细胞(每孔2×10~6细胞)72 h后,流式细胞术检测各组CD4~+CD25~+调节性T细胞早期凋亡情况。结果制备的刚地弓形虫RH株和Tg Ctwh3株ESA抗原蛋白浓度分别为0.54 mg/ml和2.14 mg/ml。流式细胞术检测结果显示,RH株和Tg Ctwh3株ESA组诱导刺激48 h后,CD4~+CD25~+调节性T细胞的早期凋亡率分别为(12.90±1.26)%和(9.71±1.04)%,均显著高于OVA对照组(4.48±0.48)%(P0.01);诱导刺激72 h后,RH株ESA组诱导CD4~+CD25~+调节性T细胞的凋亡率为(15.21±1.11)%,仍明显高于Tg Ctwh3株ESA组(11.02±0.92)%(P0.05)和OVA对照组(10.10±1.49)%(P0.01)。ELISA检测结果显示,RH株和Tg Ctwh3株ESA组诱导刺激脾单个核细胞72 h的培养上清中分泌的IFN-γ水平分别为(4 764.0±118.7)pg/ml和(3 629.0±33.6)pg/ml(P0.01),均显著高于OVA对照组的(679.4±30.6)pg/ml(P0.01)。流式细胞术检测结果显示,RH株ESA加抗IFN-γ中和抗体组诱导CD4~+CD25~+调节性T细胞的早期凋亡率为(10.44±1.44)%,明显低于未加抗IFN-γ中和抗体组(14.96±0.83)%(P0.05);但Tg Ctwh3株ESA加抗IFN-γ中和抗体与否诱导CD4~+CD25~+调节性T细胞的早期凋亡率变化不大(P0.05)。RH株ESA诱导IFN-γ基因敲除小鼠的CD4~+CD25~+调节性T细胞凋亡率为(10.64±0.55)%,明显低于野生型小鼠的(15.21±1.11)%(P0.01);Tg Ctwh3株ESA诱导两组小鼠的CD4~+CD25~+调节性T细胞凋亡率的差异无统计学意义(P0.05)。结论刚地弓形虫RH株ESA在体外诱导CD4~+CD25~+调节性T细胞凋亡及促IFN-γ分泌强于Tg Ctwh3株ESA。弓形虫ESA诱导机体产生IFN-γ可通过介导调节性T细胞凋亡来促进弓形虫感染早期抗感染免疫力的形成。     

斯氏艾美球虫可溶性蛋白对小鼠结肠癌皮下肿瘤模型的影响

目的探讨斯氏艾美球虫(Eimeria stiedai)可溶性蛋白(EsSP)对荷瘤小鼠肿瘤生长、生存率和免疫状态的影响。方法建立小鼠皮下结肠癌(CT26)肿瘤模型,确定最小100%致瘤量肿瘤细胞数。取10~8个斯氏艾美球虫孢子化卵囊,采用超声波间断乳化制备EsSP。105只雄性BALB/c小鼠按随机数表法均分为7组(15只/组),每组小鼠于右侧腋窝皮下接种CT26细胞5×10~5个,其中6个实验组(A~F组)小鼠分别腹腔注射100.00、50.00、10.00、1.00、0.10、0.01μg/d EsSP,1次/d×5 d,对照组腹腔注射等量PBS。于接种后第7、11、13、15、17、19、21、23天测量肿瘤直径,计算相对肿瘤体积和相对肿瘤增殖率(T/C)。接种后第25天每组各处死5只小鼠,称量瘤重,计算抑瘤率。采眼球血,分离小鼠外周血淋巴细胞,MTS比色法检测EsSP对荷瘤小鼠淋巴细胞增殖能力的影响,计算刺激指数(SI);流式细胞术检测外周血CD4~+/CD8~+T淋巴细胞比值变化。记录各组荷瘤小鼠死亡时间和死亡数量,共观察80 d。各组间差异性比较采用单因素方差分析。结果最小100%致瘤量肿瘤细胞数为5×10~5个。接种结肠癌细胞后第23天,A、B、C组的肿瘤体积为(435.2±41.1)、(366.3±29.2)、(460.2±28.5)mm~3,较E、F和对照组的(761.2±33.2)、(810.4±38.4)、(865.2±35.3)mm~3生长缓慢(P0.05);A、B、C组的T/C分别为(39.0±6.7)%、(33.3±8.9)%、(35.0±8.1)%,均40%。B组小鼠瘤重为(1.109±0.432)g,低于对照组的(1.946±0.289)g(P0.05),抑瘤率最高,为(43.0±14.6)%。MTS比色法检测结果显示,B、C组小鼠SI分别为1.75±0.15、1.70±0.32,高于对照组的1.38±0.18(P0.05)。流式细胞术检测结果显示,A、B、C组小鼠外周血中CD4~+/CD8~+T淋巴细胞亚群的比值分别为1.58±0.24、1.74±0.22、1.61±0.16,与对照组的1.34±0.15比较,差异均有统计学意义(P0.01或P0.05)。荷瘤小鼠生存率结果显示,至第80天,B、C组各存活5只小鼠,高于对照组的2只(P0.05)。结论 EsSP能够抑制结肠癌皮下肿瘤的生长,提高荷瘤小鼠生存率,改变肿瘤诱导的免疫抑制状态,增强小鼠抗肿瘤免疫反应。     

肝组织内序贯注射灭活异体淋巴细胞和自体淋巴细胞治疗小鼠肝癌移植瘤的研究

目的探讨用异体淋巴细胞(heterogeneic lymphocyte,HL)和自体淋巴细胞(autogeneic lymphocyte,AL)序贯注射的抗肿瘤方法。方法取供鼠C3H小鼠脾淋巴细胞,用丝裂霉素灭活制备灭活异体淋巴细胞(inactivated HL,IHL)。在受鼠CB6F1小鼠肝组织内接种hepa1-6瘤细胞。用冻融法从小鼠血浆提取冷沉淀,制成纤维蛋白胶(fibrin glue,FG);用FG与IHL或AL组合成FG-IHL或FG-AL。前阶段:用FG-IHL注射到荷瘤受鼠肝内肿瘤接种部位治疗(实验组);用FG-PBS同法注射受鼠肝内肿瘤接种部位作为对照组。而后检测两组受鼠的脾淋巴细胞杀瘤细胞率和脾淋巴细胞、CD8~+T淋巴细胞、NK细胞数量等免疫学指标。后阶段:从实验组、对照组中随机选出部分受鼠,取淋巴细胞制成FGAL,将各组FG-AL分别注射到本组其余受鼠的肝内肿瘤接种部位;治疗后剥出受鼠肝内肿瘤,比较两组的瘤体积和抑瘤率。结果前阶段治疗后,实验组受鼠AL的杀瘤细胞率为(25.7±4.81)%,明显高于对照组AL的相应值(E∶T=60∶1,P0.01);实验组受鼠脾淋巴细胞、CD8~+T细胞和NK细胞数量均明显高于对照组的相应值(均P0.05)。经前、后两阶段治疗后,实验组受鼠的瘤平均体积为(1.15±0.25)cm~3,明显小于对照组的瘤平均体积为(1.91±0.37)cm~3(P0.01);实验组的抑瘤率为39.8%(以对照组作基准)。结论肝组织内肿瘤局部注射IHL,再注射AL的序贯疗法,可明显抑制小鼠移植肝肿瘤生长,有望成为一种抗肿瘤生物疗法。     

弓形虫感染对子一代雄性小鼠脑部多巴胺水平的影响

目的探讨弓形虫感染对子一代雄性小鼠发育期脑部多巴胺水平的影响。方法 36只雌性ICR小鼠随机分为健康对照组和弓形虫感染组,每组18只。感染组每鼠分别经口感染弓形虫PRU弱毒株10个包囊。感染后90 d,与健康雄性ICR小鼠按1∶1交配。每组各取2只交配成功的母鼠于孕20 d时剖腹取胎鼠。其他交配成功的母鼠自然分娩。应用高效液相色谱-电化学法对孕20 d的雄性胎鼠及出生后14 d和63 d的雄性仔鼠(各6只)进行脑皮层、小脑、海马和纹状体多巴胺含量的测定。结果感染组小鼠感染后死亡3只,余15只感染鼠中,仅6只交配成功。2只于孕20 d剖腹取胎鼠12只,其中雄性7只;4只自然分娩,仔鼠存活21只,其中雄性15只。18只对照组小鼠均交配成功,2只于孕20 d时剖腹取胎鼠23只,其中雄性12只;16只自然分娩,仔鼠存活179只,其中雄性92只。感染组和对照组雄性胎鼠小脑区多巴胺含量分别为(413.25±21.78)ng/g和(346.30±51.83)ng/g,感染组显著高于对照组(P0.01),两者皮层区多巴胺含量差异无统计学意义(P0.05)。感染组出生后14 d和63 d,雄性仔鼠皮层区[(462.50±24.80)ng/g和(1 215.77±113.64)ng/g]、小脑区[(271.55±26.19)ng/g和(1 328.82±39.62)ng/g]、海马区[(225.78±24.17)ng/g和(1 322.70±58.34)ng/g]和纹状体区[(455.23±61.53)ng/g和(991.32±54.31)ng/g]的多巴胺含量均显著高于相应对照组(P0.05或P0.01)。结论弓形虫感染能引起子一代雄性小鼠发育期脑部多巴胺水平显著升高。     

伯氏疟原虫对小鼠脾B细胞和自然杀伤细胞及其表面分子的影响

为探讨伯氏疟原虫对小鼠脾B细胞和自然杀伤(NK)细胞及其表面分子的影响,将10只雌性C57BL/6小鼠随机分为健康对照组和感染组,每组5只。感染组小鼠经尾静脉注射伯氏疟原虫(106个/鼠)进行感染,健康对照组注射等量生理盐水。感染后6 d,取小鼠脾,制备单细胞悬液,采用流式细胞术检测小鼠B细胞和NK细胞的含量及其表面分子CD62L、CXCR3、CD69的表达水平。结果显示,感染组小鼠脾B细胞百分比含量为(79.2±3.6)%,高于健康对照组的(54.3±4.4)%(P<0.01);感染组脾NK细胞百分比为(2.2±0.7)%,低于健康对照组的(4.6±0.8)%(P<0.01)。CD62L在感染组B细胞中的百分比为(77.7±4.4)%,高于健康对照组的(72.8±7.1)%,但二者差异无统计学意义(P>0.05);CD62L在感染组NK细胞中的百分比为(61.9±4.8)%,低于健康对照组的(86.6±4.2)%(P<0.01)。CXCR3在感染组B细胞中的百分比为(4.1±0.1)%,高于健康对照组的(3.0±0.2)%(P<0.01);CXCR3在感染组NK细胞中的百分比为(2.1±0.9)%,低于健康对照组的(2.3±0.4)%,但二者差异无统计学意义(P>0.05)。CD69在感染组B细胞和NK细胞中的百分比分别为(54.3±4.7)%、(22.2±1.6)%,均高于健康对照组的(1.9±0.4)%、(1.3±0.3)%(P<0.01)。提示感染疟原虫的小鼠可能通过增加B细胞的数量以及上调其表面分子CXCR3和CD69及NK细胞表面分子CD69的表达水平发挥抗疟作用。     

人蛔虫提取物对Lewis肺癌小鼠的抑瘤作用北大核心CSCD

为探讨人蛔虫提取物对肿瘤的作用及其免疫学机制,将45只C57BL/6小鼠随机分为A、B、C、D和E等5组,每组9只,其中B、D组分别为A、C组的实验对照组,E组为阴性对照组,不做任何处理。A组每鼠隔天腹腔注射0.1 ml蛔虫提取物(BEAL),10 d后每鼠右前肢腋下皮下接种0.1 ml Lewis肺癌细胞(LLC),进行肿瘤造模;B组小鼠注射等量生理盐水,10 d后进行肿瘤造模。C组每鼠注射0.1 ml LLC细胞悬液进行肿瘤造模,2 d后腹腔注射0.1 ml BEAL,隔天1次,共注射5次;D组小鼠肿瘤造模2 d后,注射等量生理盐水,隔天1次。记录各组小鼠成瘤时间,称瘤重,计算抑瘤率。结果显示,A、B、C和D组小鼠的成瘤时间分别为(7.0±1.1)、(6.0±0.7)、(9.0±1.2)和(7.0±0.9)d。BEAL提前干预的A组小鼠肿瘤重量为(722.2±413.5)mg,显著重于其对照组B组[(338.9±282.2)mg](P<0.05)。小鼠荷瘤后BEAL干预的C组抑瘤率最强,为33.3%,其肿瘤重量[(237.8±101.8)mg]明显轻于对照组D组[(356.7±176.9)mg](P<0.05)。提示BEAL可影响肿瘤的形成,在一定条件下具有明显的抑瘤作用。     

弓形虫感染对小鼠和人子宫自然杀伤细胞的影响

目的　观察弓形虫感染对小鼠和人子宫自然杀伤细胞（uterine natural killer cells, uNK cells）比例、数量、分化和功能的影响,探讨uNK细胞在弓形虫感染致早孕流产中的作用。方法　妊娠第6.5天给予孕鼠腹腔注射弓形虫速殖子,建立孕早期弓形虫感染致流产小鼠模型,妊娠第9.5天分离小鼠子宫淋巴细胞。取人正常妊娠孕早期流产新鲜蜕膜组织,分离人子宫淋巴细胞,与弓形虫RH株速殖子体外共培养48 h（弓形虫与子宫淋巴细胞比例分别为0.5∶1、1∶1、2∶1）。采用流式细胞术检测小鼠uNK细胞表型（CD122、NK1.1、DX5）、人uNK细胞表型（CD3、CD56、CD11b、CD27）及胞内细胞因子γ⁃干扰素（interferon⁃γ, IFN⁃γ）和肿瘤坏死因子⁃α（tumor necrosis factor⁃α, TNF⁃α）表达水平。磁珠分选小鼠和人uNK细胞,以小鼠YAC⁃1或人K562细胞作为靶细胞、以小鼠或人uNK细胞作为效应细胞,采用乳酸脱氢酶（lactate dehydrogenase, LDH）释放法检测效应细胞/靶细胞比例分别为1∶1、5∶1、10∶1、20∶1时uNK细胞的杀伤功能。结果　妊娠第9.5天,弓形虫感染组小鼠流产率较对照组显著上升（83.02% vs. 3.51%;[χ2] = 71.359,P < 0.001）。与对照组比较,弓形虫感染组小鼠uNK细胞绝对数量显著降低[（4 547 ± 1 610）个/只 vs.（8 978 ± 3 339）个/只;U = 2.000,P < 0.05]、细胞表面NK1.1表达水平显著下降[（74.53 ± 8.37）% vs.（93.00 ± 1.11）%;U = 0.000,P < 0.05]、NK1.1⁃DX5⁃细胞比例显著上升[（20.10 ± 8.03）% vs.（5.04 ± 0.68）%;U = 0.000,P < 0.05]、NK1.1+DX5+细胞比例显著下降[（21.70 ± 12.48）% vs.（45.75 ± 2.26）%;U = 0.000,P < 0.05]、IFN⁃γ表达水平显著升高[（16.74 ± 1.36）% vs.（8.13 ± 1.90）%;U = 0.000,P < 0.05],但TNF⁃α表达水平无显著改变[（67.98 ± 9.20）% vs.（52.93 ± 10.42）%;U = 2.000,P > 0.05]。弓形虫感染组小鼠uNK细胞表现出较强杀伤能力,且杀伤作用随着效应细胞/靶细胞比例升高逐渐增强;效应细胞/靶细胞比例为1∶1、5∶1、10∶1、20∶1时,感染组uNK细胞对YAC⁃1细胞的杀伤活性分别为2.30%、4.32%、8.12%和12.65%,对照组分别为1.21%、1.63%、2.51%和3.22%。将人子宫淋巴细胞与弓形虫RH株速殖子共培养48 h后,弓形虫感染组人uNK细胞在子宫淋巴细胞中所占比例较对照组显著降低[弓形虫2∶1组 vs. 对照组：（6.61 ± 1.75）% vs.（17.48 ± 4.81）%;F = 7.307,P < 0.01]、绝对数量显著减少[弓形虫2∶1组vs. 对照组：（12 104 ± 5 726）个/孔 vs.（65 285 ± 21 810）个/孔;H =11.540,P < 0.01]。弓形虫感染组uNK细胞中,CD56brightCD16⁃调节型NK细胞亚群比例较对照组减少（弓形虫2∶1组vs. 对照组：（25.25 ± 5.90）% vs.（36.03 ± 4.51）%;F = 3.213,P > 0.05]、CD56dimCD16+杀伤型NK细胞亚群比例增加[弓形虫2∶1组vs. 对照组：（11.15 ± 2.15）% vs.（7.09 ± 2.24）%,F = 2.992,P > 0.05],两者比值显著降低[弓形虫2∶1组vs. 对照组：（2.37 ± 0.92）vs.（5.58 ± 2.39）;H = 8.228,P < 0.05];CD11b+CD27⁃细胞比例显著上升[弓形虫2∶1组vs. 对照组：（30.28 ± 6.91）% vs.（17.48 ± 4.67）%;H = 6.556,P < 0.05],IFN⁃γ [弓形虫2∶1组vs. 对照组：（14.13 ± 1.28）% vs.（15.19 ± 1.64）%;F = 1.639,P > 0.05]、TNF⁃α表达水平无显著改变[弓形虫2∶1组vs. 对照组：（54.76 ± 10.02）% vs.（50.33 ±3.67）%;F = 0.415,P > 0.05]。弓形虫感染组人uNK细胞具有较强杀伤能力,且杀伤作用随着效应细胞/靶细胞比例升高逐渐增强;效应细胞/靶细胞比例为1∶1、5∶1、10∶1、20∶1时,感染组uNK细胞对K562细胞的杀伤活性分别为11.90%、28.11%、49.91%和73.35%,对照组分别为11.21%、21.63%、33.51%和48.22%。结论　弓形虫感染对小鼠和人uNK细胞分化和分泌功能产生了不同影响,但均可引起小鼠和人uNK细胞绝对数量减少、杀伤功能增强。     

弓形虫排泄-分泌抗原含糖组分对小鼠调节性T细胞的影响

目的观察弓形虫排泄-分泌抗原(ESA)含糖组分对小鼠CD4+CD25+Foxp3+Treg细胞的影响。方法采用刀豆蛋白A(ConA)琼脂糖凝胶亲和层析技术提取ESA中的含糖组分,经硫酸-苯酚法测定提取物糖含量,并采用BCA法进行蛋白定量测定。将20只雌性C57BL/6小鼠随机分为5组,分别对各组小鼠腹腔注射ESA、ConA结合ESA、ConA未结合ESA、完全RPMI-1640和甘露糖各100μl。4d后处死,流式细胞仪检测各组脾脏CD4+CD25+Foxp3+Treg细胞占脾细胞的比例。结果采用ConA琼脂糖凝胶亲和层析法成功提取弓形虫ESA中含糖成分。与对照组相比(RPMI-1640组和甘露糖组),ESA、ConA结合ESA、ConA未结合ESA注射组小鼠的CD4+CD25+Foxp3+Treg细胞占脾细胞的比例均明显下降(P均0.01)。结论弓形虫ESA中含糖组分和蛋白组分均能引起小鼠CD4+CD25+Foxp3+Treg细胞占脾细胞的比例下降。     

玉屏风口服液抑制小鼠前列腺癌皮下移植瘤的免疫学机制

目的探讨玉屏风口服液对小鼠前列腺癌皮下移植瘤的抑制作用及其免疫学机制。方法将体外培养的小鼠前列腺癌RM1细胞接种于C57B/L小鼠皮下,构建小鼠前列腺癌皮下移植瘤模型,荷瘤小鼠随机分为4组,分别灌胃给予玉屏风口服液0、0.5、1和2 ml,1次/d,共28 d,末次给药的第2天眼球取血处死小鼠,取瘤测瘤体积,苏木素-伊红(HE)染色检测组织学变化,取脾细胞检测淋巴细胞增殖能力和自然杀伤(NK)细胞杀伤活性,ELISA方法检测血清中白细胞介素(IL)-2、IL-4、干扰素(IFN)-γ及肿瘤坏死因子(TNF)-α水平。结果玉屏风口服液处理后,小鼠前列腺癌皮下移植瘤体积缩小,肿瘤组织出现坏死及炎细胞浸润,淋巴细胞增殖能力和NK细胞杀伤活性增强,血清中IL-2、IFN-γ及TNF-α含量增加。结论玉屏风口服液可抑制小鼠前列腺癌皮下移植瘤的生长,其抑瘤作用与增强小鼠免疫功能有关。     

弓形虫感染小鼠血清对小鼠B16黑色素瘤细胞增殖和凋亡的影响

目的观察RH株弓形虫感染小鼠血清在体外对小鼠B16黑色素瘤细胞增殖以及凋亡的影响。方法B16细胞在含5%、10%和20%RH株弓形虫感染小鼠血清RPM1640中培养24和48 h,四甲基氮噻唑蓝（MTT）法检测B16细胞增殖抑制率;在10%、20%感染小鼠血清中培养24 h,Annexin V/PI染色,流式细胞检测细胞凋亡,HE染色观察细胞形态改变。结果正常血清能促进B16细胞增殖。5%、10%和20%弓形虫感染小鼠血清与B16细胞共孵育24和48 h,细胞生长抑制率分别为（9.06±0.36）%（、14.77±0.94）%（、23.74±0.5）%和（14.82±0.77）%（、24.56±1.04）%、（39.77±2.82）%,与对照组比较差异有统计学意义（P〈0.05）;10%、20%弓形虫感染鼠血清组B16细胞24 h凋亡率分别为（26.01±3.27）%和（44.55±2.87）%,显著高于对照组凋亡率（5.01±2.62）（P〈0.05）。弓形虫感染鼠血清作用的B16细胞生长密度明显降低,细胞核固缩、浓染。结论RH株弓形虫感染血清能够抑制B16细胞增殖并促进其凋亡。     

重组人IL-2对感染弓形虫孕鼠T细胞亚群及NK细胞的影响

目的　研究妊娠期感染弓形虫的小鼠脾脏T细胞亚群和NK细胞水平的变化及IL - 2对二者的影响。方法　BALB/c孕鼠被随机分为 4组 :空白对照、感染对照、两个IL - 2处理组。于妊娠第 8d ,空白对照腹腔注射 0 2ml生理盐水 ,其余组腹腔接种 4 0 0个弓形虫速殖子。在感染的 - 1、0、1d ,IL - 2处理组分别腹腔注射rhuIL - 2 5 0 0u(低剂量组 )和 10 0 0u(高剂量组 )。妊娠第 10、12、14、16d取孕鼠脾 ,流式细胞术检测T细胞亚群和NK细胞水平。结果与空白组相比 ,在妊娠各期感染组的脾CD4 + T细胞水平显著降低 ,而CD8+ T细胞水平显著升高 (第 10、12、14d) ,二者比值明显倒置 ;NK细胞水平明显下降。高剂量IL - 2处理组的CD4 + T细胞水平在妊娠第 10、12d高于感染组 ,CD8+ T细胞水平在妊娠第 10、14d低于感染组 ,CD4 + /CD8+ T细胞比值在妊娠第 10、12、14d高于感染组。低剂量IL - 2处理组CD4 + T细胞与感染组无显著性差异 ,CD8+T细胞水平仅在妊娠第 14d显著性低于感染组。结论　感染弓形虫孕鼠的外周免疫受到一定抑制 ,妊娠各期脾CD4 + /CD8+T细胞比例失衡 ;感染孕鼠NK细胞数量减少 ;注射适量rhuIL - 2可以使倒置的CD4 + /CD8+ T细胞比值逆转 ,促进NK细胞增殖 ,提高母体免疫水平。     

弓形虫抗原与霍乱毒素A2/B亚基复合基因在小鼠体内诱导的免疫反应

目的　观察弓形虫主要表面抗原SAG1、SAG2 与霍乱毒素A2 /B亚基复合基因真核质粒经肌肉免疫小鼠所诱导的免疫反应。方法　将SAG1基因、SAG2 基因及CTXA2 /B基因定向连接插入真核表达质粒pcDNA3.1,经酶切及测序,获得pcDNA3.1 SAG1 SAG2 及pcDNA3.1 SAG1 SAG2 CTXA2 /B的重组子;碱裂解法大量制备经肌肉注射免疫BALB/c鼠,每只鼠经后腿肌肉注射质粒10 0 μg ,每2周免疫1次,共3次,以PcDNA3.1空质粒注射组及PBS组为对照,分别于每次免疫前断尾取血和免疫后4周取小鼠脾脏测定T淋巴细胞增殖活性及NK细胞活性,ELISA法测定IgG抗体。结果　免疫组小鼠的IgG抗体水平明显提高,NK细胞杀伤活性和T细胞增殖活性也明显增强。免疫鼠抗攻击感染的时间延长。结论　含有霍乱毒素的复合基因免疫小鼠后体液免疫和细胞免疫水平均有提高。     

马拉龙和阿托伐醌+阿奇霉素在不同免疫状态小鼠体内的抗田鼠巴贝虫药效评价

目的以免疫状态正常的BALB/c小鼠及非肥胖糖尿病/重症联合免疫缺陷NOD/SCID小鼠为模型,对临床较常用的阿托伐醌(ATQ)+阿奇霉素(AZM)和马拉龙进行抗田鼠巴贝虫体内药效评价。方法取69只BALB/c健康小鼠与15只NOD/SCID健康小鼠,每鼠接种107个感染田鼠巴贝虫的鼠红细胞。2种小鼠感染后均设置3个组,即ATQ+AZM组(195 mg/kg ATQ+32.5 mg/kg AZM)、马拉龙组(62.5 mg/kg ATQ+25 mg/kg氯胍,即1/4片)和对照组(5%可溶性淀粉溶液),每鼠按0.2 ml/10 g灌胃给药。BALB/c小鼠药物抑制试验中(2个用药组各12只,对照组15只),小鼠感染后4 h开始用药,连用10 d,每组于感染后1、 3、 5、 7、 10 d喂药前,随机取3只小鼠尾尖采血,采用薄血膜涂片染色镜检观察红细胞感染情况并计算红细胞染虫率(EIR),qPCR检测18S r RNA基因相对量。BALB/c小鼠药物治疗试验中(3组各10只),于感染后7 d取所有小鼠尾尖血制薄血膜染色镜检,确认感染后开始用药,连用10 d,于感染后7、 10、 11、 12、 13、 15、 17、 19、 24、 27 d均采血镜检并计算EIR;于感染后27 d,每组随机取5只小鼠,采用免疫抑制剂地塞米松磷酸钠注射液(200μl/鼠),连续腹腔注射7 d,自免疫抑制后3 d起,每天采血制薄血膜涂片染色镜检,观察复燃情况;于感染后27 d,每组随机取5只小鼠采眶窦血,将抗凝全血混匀后腹腔注射接种对应的3组健康BALB/c小鼠(每组5只),继代接种感染后7～10 d,制薄血膜涂片染色镜检并计算EIR。NOD/SCID小鼠(3组各5只)于感染后10 d开始用药,连用10 d,于感染后10、 12、 15、 17、 19、 21、 24、 27、 29、 31、 35、 42、 49 d,分别取3组小鼠尾尖血,采用薄血膜涂片染色镜检并计算EIR。应用GraphPad Prism 8对数据进行统计学分析。结果 BALB/c小鼠药物抑制试验结果显示,ATQ+AZM及马拉龙均可有效抑制小鼠虫血症。镜检结果显示,ATQ+AZM组在感染后3 d、5 d,均仅1只小鼠查见虫体,EIR分别为(0.20±0.12)%和(0.30±0.17)%,感染后7 d (用药第8天),EIR降为0;马拉龙组小鼠EIR一直为0;对照组与ATQ+AZM组、马拉龙组EIR的差异均有统计学意义(F=151.6、153.5, P 0.05)。qPCR检测结果显示,感染后7 d,马拉龙组、 ATQ+AZM组的18S r RNA基因相对量分别为0.010 2±0.001 2、 0.007 8±0.006 6,均与对照组(68.143 8±79.122 9)差异有统计学意义(F=7.376、 7.382,P 0.05);感染后10 d (停药第1天),马拉龙组、 ATQ+AZM组的18S r RNA基因相对量分别降为0.001 7±0.000 9、 0.000 8±0.000 6,均与对照组(18.309 9±7.498 6)差异有统计学意义(t=4.229、 4.229, P 0.05)。BALB/c小鼠药物治疗试验中,对照组、 ATQ+AZM组和马拉龙组的EIR均于感染后7 d达峰值,分别为(36.67±10.85)%、(35.30±6.46)%和(33.53±7.37)%;感染后11 d (用药第5天),EIR分别降为(10.47±8.02)%、(1.53±0.31)%和(6.27±1.01)%;感染后15 d,各组EIR逐渐趋于0。免疫抑制剂复燃试验结果显示,免疫抑制后3 d,对照组1只小鼠查见虫体;免疫抑制后5 d起,ATQ+AZM组和马拉龙组小鼠均查见虫体,出现复燃。继代接种试验结果显示,继代接种感染后7 d, ATQ+AZM组和马拉龙组均有3只受血鼠查见虫体;继代接种感染后9 d, ATQ+AZM组和马拉龙组分别有1只、 2只受血鼠查见虫体;继代接种感染后10 d, ATQ+AZM组和马拉龙组受血鼠未查见虫体。ATQ+AZM组和马拉龙组NOD/SCID小鼠用药后,EIR均较快下降,从感染高峰(感染后10 d)的(59.90±0.10)%和(59.37±0.35)%降至感染后24 d的0,但分别于42 d、 29 d又查见虫体;对照组小鼠感染后EIR在(47.20±0.80)%～(66.80±0.80)%波动,于感染后45 d全部死亡,与ATQ+AZM组、马拉龙组差异有统计学意义(F=5 505、 5 984, P 0.05)。结论临床常用的ATQ+AZM和马拉龙对感染小鼠体内的田鼠巴贝虫增殖有一定抑制作用,但均不能完全杀灭虫体;治疗后血液仍具感染性,且在宿主免疫力低下至一定程度时虫体会复燃,呈较高红细胞染虫率。     

TSo联合IFN-γ鼻内免疫小鼠诱导的抗弓形虫脾淋巴细胞免疫应答

目的研究速殖子超声裂解物(TSo)和IFN-γ鼻内免疫小鼠经口感染弓形虫速殖子后,脾T细胞亚群的动态变化。方法将6~7周龄BALB/c小鼠100只随机分为4组,每组25只。分别用10μlPBS、20μgTSo、500UIFN-γ和20μgTSo 500UIFN-γ鼻内免疫小鼠2次,间隔2周。末次免疫后第10天,用RH株弓形虫速殖子4×104个/只灌胃攻击。分别于攻击后第7、10、13、16、19天处死小鼠,制备脾淋巴细胞悬液并涂片,免疫细胞化学法检测脾CD4 、CD8 T细胞亚群。结果攻击后第16、19天TSo IFN-γ组脾CD4 T细胞比率较第10天升高(P<0.05);脾CD8 T细胞第10、13、16、19天呈现较高水平;CD4 /CD8 比值第10、13天出现倒置。结论TSo联合IFN-γ鼻内免疫小鼠可激发系统免疫反应,提高其细胞免疫应答水平,增强脾CD8 T细胞的细胞毒作用,抵抗弓形虫感染。鼻黏膜免疫是一种安全有效的免疫接种途径。