去氢骆驼蓬碱体外诱导细粒棘球蚴原头节凋亡过程中caspase-3及抗氧化酶活性检测分析

目的观察不同浓度去氢骆驼蓬碱体外诱导细粒棘球蚴原头节生长凋亡过程中虫体活力、Caspase-3及相关抗氧化酶活性变化。方法将体外培养的细粒棘球蚴原头节分为空白对照组、溶剂组、阿苯达唑(ABZ)阳性对照组及不同浓度去氢骆驼蓬碱(25、50μmol/L)处理组进行体外干预试验,于48、96、144、192、240、288h后取样,经0.1%伊红染色后置于倒置显微镜下观察原头节活力。试验重复验证3次,绘制活力曲线图。用ELISA试剂盒检测作用48h、96h后各浓度组原头节caspase-3及抗氧化酶HO-1和NQO-1的活性变化。结果去氢骆驼蓬碱处理组从作用第48h开始原头节活力开始下降,培养至第240h时25μmol/L组原头节死亡率为97.9%,50μmol/L组原头节均死亡。ELISA法测定25、50μmol/L去氢骆驼蓬碱作用原头节48h后caspase-3活性分别为(32.776±8.437)ng/ml和(52.129±5.949)ng/ml,与空白对照组比较差异有统计学意义(P0.05);ELISA法测定25、50μmol/L去氢骆驼蓬碱作用48、96h后原头节抗氧化酶HO-1和NQO-1活性分别为(0.563±0.031)ng/ml、(1.832±0.10)ng/ml和(0.425±0.011)ng/ml、(1.288±0.05)ng/ml,差异均有统计学意义(P0.05),且呈时间及剂量依赖性。结论去氢骆驼蓬碱能抑制体外培养的细粒棘球蚴原头节的生长,并能降低caspase-3及抗氧化酶活性,具体机制有待进一步研究。     

骨形态发生蛋白Ⅰ型受体抑制剂LDN-212854对多房棘球蚴原头节的体外作用研究北大核心CSCD

目的探讨骨形态发生蛋白Ⅰ型受体(bone morphogenetic protein typeⅠreceptor,BMPRⅠ)新型抑制剂LDN-212854对多房棘球蚴(Echinococcus multilocularis,Em)原头节的体外作用。方法建立体外培养多房棘球蚴体系,随机设置空白对照组(RPMI 1640)、DMSO溶剂对照组(RPMI 1640+DMSO)及药物干预组(RPMI+DMSO+LDN-212854),其中药物干预组又设1、50及100μmol/L LDN-212854三个浓度梯度,分别与原头节共培养3、6、9、12 d。伊红染色与扫描电镜(scanning electron microscope,SEM)观察各干预组虫体存活率,苏木素-伊红(hematoxylin-eosin,HE)染色观察虫体病理形态变化。结果各时间段空白对照组与DMSO对照组原头节存活率比较差异无统计学意义(P>0.05);50μmol/L与100μmol/L LDN-212854组干预6 d原头节无存活,与DMSO组比较差异有统计学意义(P<0.01);1μmol/L LDN-212854组干预3 d和6 d原头节存活率分别为(84.85±2.77)%、(82.92±0.59)%,显著低于以往实验中1μmol/L LDN-193189组的(99.75±0.35)%和(99.11±0.22)%(P<0.01);1、50、100μmol/L LDN-212854组干预12 d原头节存活率分别为(38.05±1.29)%、0和0,与DMSO组存活率(98.31±0.14)%比较差异有统计学意义(P<0.01)。随LDN-212854浓度的增加,药物干预组原头节较空白对照及DMSO组HE染色变深、体积变小;SEM显示虫体体表结构改变,主要表现为顶突变形、头部固缩、内部结构暴露以及微绒毛成簇聚集。结论BMPR I新型抑制剂LDN-212854体外抗多房棘球蚴效应较LDN-193189强,低浓度下即有杀伤作用,为新型药物研发奠定了理论基础。     

BMP抑制剂LDN-193189对多房棘球蚴原头节的作用研究

目的研究骨形态发生蛋白(bone morphogenetic protein, BMP)信号通路抑制剂LDN-193189对体外培养多房棘球蚴原头节活性的影响。方法建立体外培养多房棘球蚴体系并随机分为空白对照组、乙醇组、药物组(BMP抑制剂LDN-193189),其中药物组设3个浓度组(1、50、100μmol/L),以不同作用时间(3、6、9和12 d)对原头节进行分组干预试验,用伊红染色和扫描电镜观察各组干预过程中原头节的活性变化,并绘制原头节-药物浓度生存率曲线。结果 LDN-193189干预3、6、9和12 d,各组间存活率差异有统计学意义(P0.05);100μmol/L LDN-193189组干预3、6 d原头节活性与其余组比较差异有统计学意义(P0.05);50和100μmol/L LDN-193189组干预9 d时与乙醇组相比原头节活力显著下降(P0.05);1、50和100μmol/L LDN-193189组干预12 d时原头节活力分别下降(10.65±3.06)%、(36.89±5.15)%和(74.55±6.34)%,50、100μmol/L组与空白对照组(1.23±0.15)%和乙醇组(1.34±0.40)%比较差异均有统计学意义(P0.01),且原头蚴的死亡率与LDN-193189浓度和干预时间成正比。随着药物浓度的增加,扫描电镜观察原头节顶突变形,小钩脱落,覆盖顶突和体表的微绒毛减少。结论 BMP信号通路抑制剂LDN-193189具有体外抗多房棘球蚴作用,且随浓度的增大和作用时间的延长抑制作用增强。     

塞来昔布对细粒棘球蚴原头节生长及p-ERK2表达的影响

目的探索塞来昔布对细粒棘球蚴原头节体外生长及p-ERK2表达的影响。方法实验分组为1640培养基组、DMSO组、塞来昔布溶液(50、100、150、200μmol/L)中体外孵育,在倒置焦镜下观察原头节的形态变化,同时通过0.1%伊红染色显示原头节活力。运用Western blot检测DMSO、100、150、200μmol/L塞来昔布处理细粒棘球蚴原头节48h后p-ERK2蛋白的表达量。结果体外孵育7d后,DMSO组及空白1640对照组原头节的活力几乎没有改变。塞来昔布作用1d后,100、150、200μmol/L组原头节的活力均下降;作用3d后,200μmol/L组原头节全部被杀死,150μmol/L组的原头节活力为43.9%。100μmol/L、50μmol/L组对原头节的活力也有明显下降,但不及高浓度组显著。Western blot结果显示P-ERK2的表达量随浓度增加而下降趋势明显。结论塞来昔布能够抑制细粒棘球蚴原头节生长,这可能与塞来昔布下调P-ERK2的表达进而抑制ERK2信号传导通路有关。     

氯舒隆和奥硝唑体外抗细粒棘球蚴原头节和多房棘球蚴的效果评价

目的研究氯舒隆和奥硝唑体外抗细粒棘球蚴原头节和多房棘球蚴的效果。方法从感染细粒棘球蚴绵羊肝脏中收集原头节;从感染长爪沙鼠腹腔中分离多房棘球蚴,加入预先接种人肝癌细胞的DMEM培养基中培养2个月后,收集直径为1~5 mm囊泡。实验分氯舒隆组(实验组)、奥硝唑组(实验组)、阿苯达唑组(阳性对照)和0.2%二甲基亚砜(DMSO)组(溶剂对照组)。每种药物设2个平行孔,终浓度均为40μmol/L,重复2次。每孔加细粒棘球蚴原头节约100个或多房棘球蚴囊泡25~35个。药物处理细粒棘球蚴原头节24、48、72、96、120、144和168 h后,显微镜下观察原头节形态,用台盼蓝染色,计算原头节存活率,组间存活率的比较采用方差分析。药物处理多房棘球蚴囊泡36 h和120 h后,显微镜下观察囊泡的形态学改变,测定培养上清液中碱性磷酸酶的活性,组间酶活性的比较采用卡方分析。结果氯舒隆、奥硝唑和阿苯达唑作用于原头节后,原头节颜色变深、钙颗粒减少、头钩脱落、头节外翻并伸长,0.2%DMSO对原头节形态无影响。氯舒隆、臭硝唑和阿苯达唑作用24、48、72、96、120、144和168 h后,原头节存活率分别为79%、70%、56%、42%、33%、16%、15%,86%、67%、63%、48%、32%、28%、21%和85%、71%、45%、36%、21%、15%、8%;0.2%DMSO组原头节存活率为100%。氯舒隆、奥硝唑和阿苯达唑组原头节存活率与0.2% DMSO组相比差异均有统计学意义(χ~2=147.83、130.58、170.37,P0.05)。氯舒隆、奥硝唑和阿苯达唑作用后,多房棘球蚴囊泡均塌陷、皱缩,0.2%DMSO对多房棘球蚴囊泡形态无影响。作用36 h后氯舒隆、奥硝唑、阿苯达唑和0.2% DMSO组培养上清液碱性磷酸酶的吸光度(A405)值分别为0.196±0.030、0.186±0.004、0.244±0.049和0.131±0.020,作用120 h后分别为0.431±0.006、0.271±0.004、0.423±0.007和0.116±0.004。氯舒隆、奥硝唑和阿苯达唑组与0.2%DMSO组相比差异均有统计学意义(t=0.006、0.004、0.007,P0.05)。结论氯舒隆和奥硝唑对体外培养的细粒棘球蚴原头节和多房棘球蚴均具有较强的作用,是潜在的抗棘球蚴药物。     

黄腐酚对体外泡状棘球蚴原头节活性的影响

目的探讨不同浓度黄腐酚在体外对泡状棘球蚴原头节活性及形态学影响。方法将体外培养的泡状棘球蚴原头节随机分为6组:空白对照组,溶剂对照组和黄腐酚10、20、40、80μmol/L组,培养7 d,每24 h用0.1%伊红染色后在倒置显微镜下观察原头节的活性并计算成活率;黄腐酚作用泡状棘球蚴原头节3 d后,应用半胱天冬氨酸蛋白酶-3(caspase-3)检测试剂盒检测caspase-3活性;Western blot检测体外培养3d后的原头节Bcl-2、Bax蛋白表达量;使用活性氧检测试剂盒检测体外作用24 h后6组原头节内活性氧(ROS)变化水平。结果随着药物浓度升高,泡状棘球蚴原头节活力降低,空白对照组、溶剂对照组泡状棘球蚴原头节在第7 d的活力分别为(97.26±0.208)%、(97.33±0.305)%,第7 d 10μmol/L、20μmol/L、40μmol/L黄腐酚组泡状棘球蚴原头节的活力分别为(42.06±0.404)%、(24.10±0.200)%、(11.83±0.416)%,均低于对照组(P均0.05)。80μmol/L黄腐酚组杀伤作用较强,原头蚴的活力为(0.96±0.208)%。不同浓度黄腐酚组作用原头蚴3 d, caspase-3活性与对照组相比显著增高(P0.05)。黄腐酚不同浓度作用原头蚴3 d后,凋亡抑制蛋白Bcl-2表达下降,而凋亡蛋白Bax表达随着药物浓度的增加而显著上调(P0.05)。不同浓度黄腐酚作用24 h后原头节体内活性氧(ROS)水平与对照组相比显著升高(P0.05)。结论黄腐酚在体外具有一定杀灭泡球蚴原头节作用,并表现出时间依赖性和浓度依赖性。其机制可能与caspase-3活性增强、Bax表达水平升高、Bcl-2表达水平降低、ROS水平增高诱导头节细胞的凋亡有关。     

石蒜碱及其与阿苯达唑联合体外抗细粒棘球蚴原头节的作用研究

目的观察比较石蒜碱、阿苯达唑及石蒜碱联合阿苯达唑体外抗细粒棘球蚴原头节的作用。方法从感染羊肝上提取细粒棘球蚴原头节,体外培养3d后,分别用石蒜碱(100、500、1 000μmol/L)、阿苯达唑(50μmol/L)、石蒜碱联合阿苯达唑(100μmol/L+50μmol/L)处理细粒棘球蚴原头节,在处理后的第1、3、5、7、9d,用1%伊红染色后显微镜下观察原头节的活性,使用多因素重复测量方差分析检验各组间原头节活性率的差异。结果经100、500、1 000μmol/L的石蒜碱体外作用9d后,原头节的活性分别为72.70%、14.09%和0。石蒜碱不同剂量组处理后的原头节的活性与对照组比较,差异有统计学意义(P0.05);石蒜碱高、中、低剂量组之间比较,差异有统计学意义(P0.05);在相同浓度石蒜碱处理组内,不同测量时间点之间比较,差异具有统计学意义(P0.05)。石蒜碱联合阿苯达唑(100μmol/L+50μmol/L)、阿苯达唑(50μmol/L)及低剂量石蒜碱(100μmol/L)体外作用9d后,原头节的活性分别为50.20%、90.22%和72.70%,差异有统计学意义(P0.05)。结论石蒜碱具有体外抗细粒棘球蚴原头节的作用,并表现出时间和浓度依赖性,且与阿苯达唑具有协同作用。     

ERK抑制剂PD98059体外抗细粒棘球绦虫原头蚴作用的研究

目的探讨ERK1/2抑制剂PD98059体外抗细粒棘球绦虫原头蚴作用。方法体外培养细粒棘球绦虫原头蚴,分组后分别加入100、50、25、12.5μmol/L的PD98059后继续培养7d,利用伊红染色方法在倒置显微镜下观察原头蚴的活力,实验重复3次,绘制原头蚴活力曲线;扫描电子显微镜(SEM)下观察不同浓度PD98059组原头节表面结构改变。结果 PD98059作用1d对细粒棘球蚴原头节具有杀伤作用,第7d100μmol/L PD98059组原头节的活力仅为(12.4±0.9)%。超微结构显示原头节顶突外翻、变形,顶突界面缺损,吸盘变形,甚至出现虫蛀样损害。结论 PD98059在体外有显著的抗细粒棘球蚴原头节的作用,可认为是一种新型的抗包虫药物。     

IGF-ⅠR抑制剂OSI-906体外抗细粒棘球绦虫原头蚴作用的研究

目的探讨胰岛素样生长因子I受体(insulin-like growth factor I receptor,IGF-ⅠR)抑制剂OSI-906体外抗细粒棘球绦虫原头蚴作用。方法体外培养细粒棘球绦虫原头蚴,用6个浓度梯度(100、50、25、12.5、6.25、3.125μmol/L)的OSI-906进行干预,分别于给药后1、2、3、4d用伊红染色,在倒置荧光显微镜下观察其活力(每组设置3个复孔),绘制原头蚴活力曲线;透射电镜下观察不同浓度OSI-906组原头节超微结构变化。结果 100和50μmol/L OSI-906作用不同时间原头蚴存活率与空白对照组组间和溶剂组相比差异有统计学意义(P<0.05);其余浓度组间比较原头蚴存活率差异无统计学意义(P>0.05)。第3d时100μmol/L的OSI-906组原头节存活率为(42.38±1.05)%;第4d时100μmol/L的OSI-906组原头蚴全部死亡。透射电镜观察OSI-906高浓度组原头蚴微毛结构消失,皮层细胞坏死,细胞膜严重破损,核形不规整,核仁大且边界不清,核基质密度极低,异染色质增多、边集。结论 IGF-ⅠR抑制剂OSI-906体外抗细粒棘球绦虫原头蚴作用显著,是一种潜在的抗包虫药物。     

P38MAPK抑制剂SB202190体外抑制细粒棘球蚴原头节生长的研究*

【摘要】 目的 探讨P38MAPK抑制剂SB202190体外抑制细粒棘球蚴原头节生长的作用。 方法 将体外培养的细粒棘球蚴原头节分别加入12.5、25、50、100μmol/L的 SB202190中体外孵育。利用伊红染色的方法,在光镜下观察原头节的活力变化。实验重复三次;扫描电子显微镜下（SEM）下观察SB202190作用后原头节表面超微结构改变;不同浓度SB202190作用24小时后,半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶-3（caspase-3）活性检测试剂盒检测caspase-3酶活性。结果 50μmol/L和100μmol/L 的SB202190作用1天后,头节活力开始下降。作用14天后,100μmol/LSB202190组无存活的头节,50mol/LSB202190组的头节活力仅为13.8%。超微结构显示100μmol/LSB202190作用6d后,原头节顶突外翻、变形,顶突界面缺损,吸盘变形,体表出现虫蛀样损害。不同浓度SB202190作用24h后,与正常对照组比较,SB202190抑制剂高浓度组原头节的caspase-3表达明显增高。结论 P38MAPK抑制剂SB202190在体外有明显的抑制细粒棘球蚴原头节生长的作用。     

达克罗宁对细粒棘球蚴原头节体外作用及其ROS水平的影响

目的初步探究达克罗宁对细粒棘球蚴原头节体外生长的影响以及原头节内ROS的表达情况。方法用达克罗宁与细粒棘球蚴原头节体外共培养,采用0.1%曙红排斥试验观察原头节的形态,统计存活率并绘制原头节的生存曲线;将DCFH-DA探针加入孵育原头节的培养基以检测其ROS活性;用SOD和Caspase-3试剂盒测定SOD和Caspase-3的活性。结果 40μg/ml达克罗宁可使体外培养的原头节在第4d全部死亡;达克罗宁以剂量依赖的方式使原头节的ROS和Caspase-3表达量增加,同时降低SOD的活性。结论达克罗宁具有体外抗细粒棘球蚴原头节作用,通过激活ROS诱导氧化应激导致Caspase-3被激活从而引起细粒棘球蚴原头节的凋亡。     

siRNA特异性干扰EgTPx基因表达对细粒棘球蚴原头节DNA氧化损伤机制的影响北大核心CSCD

目的研究小干扰RNA(small interfering RNA,siRNA)特异性干扰EgTPx基因表达后对细粒棘球蚴(Echi-nococcus granulosus,Eg)原头节DNA氧化损伤机制的影响。方法利用电穿孔法将EgTPx-siRNA干扰序列转染细粒棘球蚴原头节,实验分为EgTPx-siRNA-60、115、250干扰组,阴性对照组和空白对照组。电转3d后,协同自然状态下原头节体外耐受H_2O_2最大浓度干预1h,综合伊红拒染试验和碱性磷酸酶检测干扰前后原头节活性变化及qRT-PCR检测干扰前后EgTPx-mRNA表达水平变化筛选最佳EgTPx-siRNA干扰序列。采用单细胞凝胶电泳法(彗星试验)检测干扰前后原头节DNA氧化损伤程度变化;采用试剂盒法检测原头节体内活性氧(reactive oxygen species,ROS)含量,分析siRNA干扰对DNA氧化损伤机制的影响。结果自然状态下细粒棘球蚴原头节体外耐受H_2O_2的最大浓度为0.4mmol/L,干预时间为1h;电穿孔法将绿色荧光干扰序列导入原头节体内,实验组和阴性对照组的原头节体内均有绿色荧光斑点,而空白对照组原头节体内无绿色荧光斑点。导入siRNA后通过伊红拒染试验、碱性磷酸酶活性检测及qRT-PCR筛选出最佳干扰序列为EgTPx-siRNA-60;彗星试验显示干扰EgTPx基因表达后EgTPx-siRNA-60干扰组原头节DNA碎片离开核向阳极迁移形成拖尾,EgTPx-siRNA-60干扰组彗星尾距OTM值为12.860 2±2.537 7,与阴性对照组(0.055 8±0.010 3)和空白对照组(0.037 2±0.009 8)相比差异有统计学意义(t值分别为11.251和12.845,均P<0.01);经EgTPx-siRNA-60序列干扰后原头节体内ROS含量(13.978 6±0.233 0)A.U.与阴性对照组(3.281 7±0.052 5)A.U.和空白对照组(3.018 2±0.076 9)A.U.比较差异有统计学意义(t值分别为8.926和9.314,均P<0.01)。结论 EgTPx基因在细粒棘球蚴原头节DNA氧化损伤过程中发挥重要作用,EgTPx-siRNA-60可特异性干扰EgTPx基因的表达,并降低原头节修复DNA氧化损伤的能力。     

siRNA特异性干扰EgTPx基因表达对细粒棘球蚴原头节DNA氧化损伤机制的影响

目的研究小干扰RNA(small interfering RNA,siRNA)特异性干扰EgTPx基因表达后对细粒棘球蚴(Echi-nococcus granulosus,Eg)原头节DNA氧化损伤机制的影响。方法利用电穿孔法将EgTPx-siRNA干扰序列转染细粒棘球蚴原头节,实验分为EgTPx-siRNA-60、115、250干扰组,阴性对照组和空白对照组。电转3d后,协同自然状态下原头节体外耐受H_2O_2最大浓度干预1h,综合伊红拒染试验和碱性磷酸酶检测干扰前后原头节活性变化及qRT-PCR检测干扰前后EgTPx-mRNA表达水平变化筛选最佳EgTPx-siRNA干扰序列。采用单细胞凝胶电泳法(彗星试验)检测干扰前后原头节DNA氧化损伤程度变化;采用试剂盒法检测原头节体内活性氧(reactive oxygen species,ROS)含量,分析siRNA干扰对DNA氧化损伤机制的影响。结果自然状态下细粒棘球蚴原头节体外耐受H_2O_2的最大浓度为0.4mmol/L,干预时间为1h;电穿孔法将绿色荧光干扰序列导入原头节体内,实验组和阴性对照组的原头节体内均有绿色荧光斑点,而空白对照组原头节体内无绿色荧光斑点。导入siRNA后通过伊红拒染试验、碱性磷酸酶活性检测及qRT-PCR筛选出最佳干扰序列为EgTPx-siRNA-60;彗星试验显示干扰EgTPx基因表达后EgTPx-siRNA-60干扰组原头节DNA碎片离开核向阳极迁移形成拖尾,EgTPx-siRNA-60干扰组彗星尾距OTM值为12.860 2±2.537 7,与阴性对照组(0.055 8±0.010 3)和空白对照组(0.037 2±0.009 8)相比差异有统计学意义(t值分别为11.251和12.845,均P0.01);经EgTPx-siRNA-60序列干扰后原头节体内ROS含量(13.978 6±0.233 0)A.U.与阴性对照组(3.281 7±0.052 5)A.U.和空白对照组(3.018 2±0.076 9)A.U.比较差异有统计学意义(t值分别为8.926和9.314,均P0.01)。结论 EgTPx基因在细粒棘球蚴原头节DNA氧化损伤过程中发挥重要作用,EgTPx-siRNA-60可特异性干扰EgTPx基因的表达,并降低原头节修复DNA氧化损伤的能力。     

siRNA特异性干扰EgTPx基因表达对细粒棘球蚴原头节DNA氧化损伤机制的影响北大核心CSCD

目的研究小干扰RNA(small interfering RNA,siRNA)特异性干扰EgTPx基因表达后对细粒棘球蚴(Echi-nococcus granulosus,Eg)原头节DNA氧化损伤机制的影响。方法利用电穿孔法将EgTPx-siRNA干扰序列转染细粒棘球蚴原头节,实验分为EgTPx-siRNA-60、115、250干扰组,阴性对照组和空白对照组。电转3d后,协同自然状态下原头节体外耐受H_2O_2最大浓度干预1h,综合伊红拒染试验和碱性磷酸酶检测干扰前后原头节活性变化及qRT-PCR检测干扰前后EgTPx-mRNA表达水平变化筛选最佳EgTPx-siRNA干扰序列。采用单细胞凝胶电泳法(彗星试验)检测干扰前后原头节DNA氧化损伤程度变化;采用试剂盒法检测原头节体内活性氧(reactive oxygen species,ROS)含量,分析siRNA干扰对DNA氧化损伤机制的影响。结果自然状态下细粒棘球蚴原头节体外耐受H_2O_2的最大浓度为0.4mmol/L,干预时间为1h;电穿孔法将绿色荧光干扰序列导入原头节体内,实验组和阴性对照组的原头节体内均有绿色荧光斑点,而空白对照组原头节体内无绿色荧光斑点。导入siRNA后通过伊红拒染试验、碱性磷酸酶活性检测及qRT-PCR筛选出最佳干扰序列为EgTPx-siRNA-60;彗星试验显示干扰EgTPx基因表达后EgTPx-siRNA-60干扰组原头节DNA碎片离开核向阳极迁移形成拖尾,EgTPx-siRNA-60干扰组彗星尾距OTM值为12.860 2±2.537 7,与阴性对照组(0.055 8±0.010 3)和空白对照组(0.037 2±0.009 8)相比差异有统计学意义(t值分别为11.251和12.845,均P<0.01);经EgTPx-siRNA-60序列干扰后原头节体内ROS含量(13.978 6±0.233 0)A.U.与阴性对照组(3.281 7±0.052 5)A.U.和空白对照组(3.018 2±0.076 9)A.U.比较差异有统计学意义(t值分别为8.926和9.314,均P<0.01)。结论 EgTPx基因在细粒棘球蚴原头节DNA氧化损伤过程中发挥重要作用,EgTPx-siRNA-60可特异性干扰EgTPx基因的表达,并降低原头节修复DNA氧化损伤的能力。     

siRNA特异性干扰EgRad9基因表达对细粒棘球蚴原头节DNA氧化损伤机制的影响

目的研究小干扰RNA(small interfering RNA,si RNA)特异性干扰Eg Rad9基因表达后对细粒棘球蚴原头节DNA氧化损伤机制的影响。方法利用电穿孔法将Eg Rad9-si RNA干扰序列和阴性对照干扰序列转染细粒棘球蚴原头节,实验分为Eg Rad9-si RNA-354、-614、-971干扰组,阴性对照组和空白对照组。电转染3 d后,加入自然状态下原头节最大耐受浓度的H_2O_2处理1 h,伊红染液染色后,倒置荧光显微镜下观察原头节活性并计算存活率。收集各组原头节的培养液,进行碱性磷酸酶活性的检测。电转染3 d后,加入自然状态下原头节耐受H_2O_2的最大耐受浓度处理1 h后,TRIzol法提取总RNA。实时荧光定量PCR(q RT-PCR)检测Eg Rad9m RNA的表达。采用彗星实验检测干扰Eg Rad9基因表达后细粒棘球蚴原头节DNA氧化损伤情况,活性氧(reactive oxygen species,ROS)检测试剂盒检测干扰Eg Rad9基因表达后细粒棘球蚴原头节体内ROS的含量,采用SPSS 22.0统计学软件进行数据分析。结果自然状态下细粒棘球蚴原头节体外耐受H_2O_2的最大浓度为0.4 mmol/L,干预时间为1 h;电穿孔法可将绿色荧光干扰序列有效的导入原头节体内,实验组和阴性对照组的原头节体内均有明亮的绿色荧光斑点;而空白对照组原头节体内无绿色荧光斑点。Eg Rad9-si RNA-354、-614、-971干扰组原头节的存活率分别为(42.99±4.03)%、(29.86±5.87)%和(56.48±4.64)%,初步筛选最有效干扰序列为Eg Rad9-si RNA-614。si RNA-354、-614、-971干扰组碱性磷酸酶活性分别为0.024±0.001、0.004±0.001、0.039±0.002,其中Eg Rad9-si RNA-614组碱性磷酸酶活性与阴性对照组(0.095±0.001)和空白对照组(0.099±0.001)相比,差异均有统计学意义(t=10.227、10.934,均P0.01),表明该组原头节Eg Rad9基因经干扰后对其活性影响最大,最有效干扰序列为Eg Rad9-si RNA-614。Eg Rad9-si RNA-354、614、971干扰组Eg Rad9 m RNA表达量分别为0.432±0.055、0.291±0.079、0.612±0.032,其中经Eg Rad9-si RNA-614序列干扰后,Eg Rad9 m RNA表达量与阴性对照组(1.001±0.020)和空白对照组(1.001±0.012)相比均显著下调(t=7.874、7.663,均P0.01),可确定最有效干扰序列为Eg Rad9-si RNA-614。相同电泳条件下,Eg Rad9-si RNA-614干扰组原头节DNA碎片离开核向阳极迁移,形成拖尾;Eg Rad9-si RNA-614干扰组彗星尾距OTM值为13.901±2.263,与阴性对照组(0.074±0.020)和空白对照组(0.047±0.034)相比,差异有统计学意义(t=12.845、13.251,均P0.01)。经Eg Rad9-si RNA-614序列干扰后,原头节体内ROS含量为13.024±0.154,与阴性对照组(2.728±0.083)和空白对照组(2.555±0.007)相比,差异有统计学意义(t=9.296、10.134,均P0.01)。结论Eg Rad9基因在细粒棘球蚴原头节DNA氧化损伤过程中发挥重要作用,Eg Rad9-si RNA-614干扰片段可特异性干扰Eg Rad9基因的表达,并降低原头节修复DNA氧化损伤的能力。     

甘氨鹅脱氧胆酸对体外细粒棘球蚴原头节活力及ROS影响

目的 研究甘氨鹅脱氧胆酸(glycochenodeoxycholic acid, GCDCA)对体外细粒棘球蚴原头节活力及活性氧(Reactive oxygen species,ROS)水平的影响。方法 将细粒棘球蚴原头节分为对照组及GCDCA处理组(500、1 500、2 500 μ mol/ L),应用体外培养技术,通过伊红染色法每天定时在光学显微镜下观察原头节的活力并记录存活和死亡数目。使用试剂盒检测不同浓度GCDCA处理 24 h后各组原头节体内caspase-3酶活性变化;DCFH- DA染色法荧光显微镜观察 GCDCA作用24 h后原头节内 ROS水平变化。结果 500、1 500、2 500 μ mol/ L GCDCA处理后均可导致原头节活力减弱,且最高浓度组在第7 d时原头节全部死亡。500、1 500、2 500 μ mol/ L GCDCA组作用原头节24 h后 caspase-3酶活性与对照组相比明显升高(F=555.162, P<0.05)。500、1 500、2 500 μ mol/ L GCDCA作用原头节24 h后原头节内 ROS水平与对照组相比明显升高(F=216.901, P<0.05)。结论 GCDCA 能抑制体外原头节生长,促使原头节死亡,可能与活化caspase-3及提高原头节内ROS 水平相关,具体机制有待进一步研究。     

雄黄对细粒棘球蚴原头节体外生长及抗氧化酶活性的影响

目的初步探讨雄黄对体外细粒棘球蚴原头节生长及抗氧化酶的影响。方法在体外培养的基础上,将不同浓度雄黄分别作用细粒棘球蚴原头节2 d,光镜下观察原头节活力及形态变化;扫描电镜(SEM)和透射电镜(TEM)观察原头节表面及内部超微结构改变;采用ELISA法测定SOD、ROS、HO-1和NQO-1表达情况;采用Caspase-3试剂盒检测原头节Caspase-3酶活性。结果250、500、1000、2000μmol/L雄黄体外作用于细粒棘球蚴原头节均能抑制其生长,雄黄作用2 d后光镜下观察原头节形态结构均发生改变,虫体萎缩,伊红染色呈红色(正常虫体为透明无色);SEM下观察原头节虫体皱缩,原头节正常形态被破坏;TEM下观察原头节内部微绒毛减少,合胞体带变薄、结构松散并有少量脂滴。EUSA检测SOD、HO-1和NQO-1活性均呈下降趋势,ROS和caspase-3酶活性均呈升高趋势(均P<0.05)。结论雄黄体外可抑制细粒棘球蚴原头节生长,破坏原头节形态结构,降低抗氧化酶活性,该抑制作用与机体抗氧化防御系统平衡失调有关。     

不同肝癌细胞上清对细粒棘球蚴原头节体外培养活性的影响

目的通过比较3种肝癌细胞上清对体外培养细粒棘球蚴原头节的活性影响,探讨较长时间维持细粒棘球蚴原头节体外活性的新模型。方法收集培养48 h后的Huh7、 Hepa1-6和HepG-2等3种肝癌细胞无血清上清,分别与细粒棘球蚴原头节(每组约5 000个)共培养,对照组采用无血清培养基培养。培养后第1、3、 5、 7天,取各组混悬液50μl,台盼蓝染色后光镜下观察、计数并计算存活率;培养后第7天,于扫描电镜下观察原头节超微结构,并用ELISA测定4组细粒棘球蚴原头节半胱氨酸蛋白酶-3酶的活性。采用SPSS 20.0统计学软件对计量数据进行方差分析。结果台盼蓝染色可见,随原头节培养时间延长,各组存活率均不断下降,无血清组、 Huh7组、 Hepa1-6组和HepG-2组原头节在第5天时存活率分别为(46.54±1.11)%、(46.19±3.60)%、(55.90±2.33)%和(68.73±1.06)%;至第7天,Hepa1-6组和HepG2组原头节存活率分别为(36.09±0.95)%和(45.69±0.40)%,与对照组(17.99±1.52)%差异均有统计学意义(P 0.01), Huh7组(19.04±1.7)%与对照组差异无统计学意义(P 0.05)。培养后第7天,光镜下可见对照组和Huh7组原头节蓝染数目多,透光度差,有较多崩解坏死物质;Hepa1-6组也可见较多蓝染原头节,透光度尚可,镜下崩解坏死物质少;HepG-2组原头节蓝染数目少,透光度较好,镜下崩解坏死物质少。扫描电镜下可见对照组和Huh7组原头节形态大体破坏,微毛、吸盘等超微结构紊乱、崩解,Hepa1-6组、 HepG2组虫体表面较为饱满且平滑,超微结构也较为清晰完整。半胱氨酸蛋白酶-3酶的活性检测结果显示,Hepa1-6组和HepG2组酶活力单位分别为20.51±0.61和17.51±0.59,与对照组(22.15±1.14)比较差异均有统计学差异(P 0.01); Huh7组为22.67±0.96,与对照组比较差异无统计学意义(P 0.05)。结论肝癌细胞上清可改善无血清体外培养条件下细粒棘球蚴原头节活性,并以HepG2细胞上清作用更明显。     

羟基喜树碱对细粒棘球蚴原头节的生长抑制作用及其机制

目的观察羟基喜树碱(HCPT)对体外培养的细粒棘球蚴原头节生存抑制作用及其机制,寻找减少肝脏包虫病术后复发和术中头节外溢的安全高效的可行性药物,并探索其药物作用靶点,为肝脏包虫病的治疗用药提供更多的选择。方法体外培养细粒棘球蚴原头节,分别加入浓度为2.5μmol/L和5μmol/L的HCPT中,37℃恒温孵育2 d和4 d后伊红染色检测原头节生长活力;采用酶标法检测ROS,GSH和caspase-3活性;Western blot检测GRP78和Caspase-12蛋白表达水平。结果 HCPT对细粒棘球蚴生长有抑制作用,HCPT2.5μmol/L和5μmol/L作用4 d,细粒棘球蚴原头节的活力分别为28.2%和7.5%,差异有统计学意义(P0.05)。高浓度HCPT组ROS和caspase-3含量与对照组比较增高,GSH含量降低(P0.05);高浓度HCPT作用组GRP78和Caspase-12表达量与对照组比较增加(P0.05)。结论 HCPT体外可抑制细粒棘球蚴原头节存活,内质网应激机制可能参与其中。     

羟基喜树碱对细粒棘球蚴原头节的生长抑制作用及其机制北大核心CSCD

目的观察羟基喜树碱(HCPT)对体外培养的细粒棘球蚴原头节生存抑制作用及其机制,寻找减少肝脏包虫病术后复发和术中头节外溢的安全高效的可行性药物,并探索其药物作用靶点,为肝脏包虫病的治疗用药提供更多的选择。方法体外培养细粒棘球蚴原头节,分别加入浓度为2.5μmol/L和5μmol/L的HCPT中,37℃恒温孵育2 d和4 d后伊红染色检测原头节生长活力;采用酶标法检测ROS,GSH和caspase-3活性;Western blot检测GRP78和Caspase-12蛋白表达水平。结果 HCPT对细粒棘球蚴生长有抑制作用,HCPT2.5μmol/L和5μmol/L作用4 d,细粒棘球蚴原头节的活力分别为28.2%和7.5%,差异有统计学意义(P<0.05)。高浓度HCPT组ROS和caspase-3含量与对照组比较增高,GSH含量降低(P<0.05);高浓度HCPT作用组GRP78和Caspase-12表达量与对照组比较增加(P<0.05)。结论 HCPT体外可抑制细粒棘球蚴原头节存活,内质网应激机制可能参与其中。