结核分支杆菌利福平耐药基因突变的研究

目的了解我国结核分支杆菌耐利福平（ＲＦＰ）分离株ｒｐｏＢ基因突变情况，建立快速检测结核分支杆菌耐药基因型的分子药敏试验方法。方法通过聚合酶链反应－单链构象多态性（ＰＣＲ－ＳＳＣＰ）和ＰＣＲ－直接测序法（ＰＣＲ－ＤＳ）分析５０株结核分支杆菌临床分离株的ｒｐｏＢ基因。结果３株结核分支杆菌药物敏感株和２株非ＲＦＰ耐药株中，仅１株ｒｐｏＢＳＳＣＰ图谱异常的药物敏感株出现５３１位密码子ＴＣＧ→ＴＴＧ突变。４５株ＲＦＰ耐药株中，１０株ＳＳＣＰ和ＤＳ分析均未见ｒｐｏＢ突变，３５株ＳＳＣＰ和ＤＳ分析异常，其中１４株为５３１位密码子ＴＣＧ→ＴＴＧ或ＴＧＧ或ＴＡＣ突变，１４株为５２６位ＣＡＣ→ＴＡＣ或ＧＡＣ或ＣＣＣ或ＣＴＣ或ＧＴＣ突变，２株为５１６位ＧＡＣ→ＧＴＣ或ＴＡＣ突变，２株为５１６位和５２６位及５１５位和５１６位密码子双点突变，３株ｒｐｏＢ序列与结核分支杆菌不同。结论大多数结核分支杆菌耐ＲＦＰ是由于其ｒｐｏＢ基因突变所致，采用ＰＣＲ－ＳＳＣＰ和ＰＣＲ－ＤＳ方法可快速测定结核分支杆菌ＲＦＰ耐药基因型     

结核分支杆菌耐异烟肼分子机制的研究

目的了解结核分支杆菌耐异烟肼（ＩＮH）分离株ＫａtG基因完全缺失或突变的情况，探讨其在ＩＮＨ耐药性中的可能作用。方法应用ＰＣＲ和ＰＣＲ－ＳＳＣＰ方法对５８株结核分支杆菌临床分离株的ＫａｔＧ基因进行分析。结果以Ｈ３７，ＲＶ标准株为对照，１２株敏感株的ＫａｔＧ基因扩增产物，１１株SSCP泳动正常，1株（８．３％）异常；２４株耐ＩＮＨ株中，３株（ｌ．５％）PCR扩增阴性，ＺＩ株ＫａtG扩增阳性，其中１６株（７６．２％）SSCP泳动异常；２２株耐其它抗结核药物株中，也有７株（３１．８％）SSCP异常。结论某些结核分支杆菌ＩＮＨ耐药性产生可能是由于其ＫａｔＧ基因完全缺失或ＫａｔＧ基因突变所致，但某些菌株也可能与ＫａｔＧ基因无关，是其它耐药基因所致或存在多种机制，尚需进一步探讨。     

ahpC基因突变与结核分支杆菌耐异烟肼的研究

目的了解我国结核分支杆菌耐异烟肼（ＩＮＨ）分离株ａｈｐＣ编码基因及其启动子突变情况，研究其与ＩＮＨ耐药关系。方法通过聚合酶链反应（ＰＣＲ）单链构象多态性（ＳＳＣＰ）方法分析６２株结核分支杆菌临床分离株ａｈｐＣ及其启动子基因。以Ｈ３７ＲＶ标准株为对照。结果３２株结核分支杆菌药物敏感株ａｈｐＣ及其启动子基因ＳＳＣＰ均泳动正常；３０株耐ＩＮＨ分离株ａｈｐＣ编码基因ＳＳＣＰ也未见异常；１２株高度耐ＩＮＨ分离株中，５株ａｈｐＣ启动子ＳＳＣＰ泳动异常；１８株低度耐ＩＮＨ分离株的ａｈｐＣ启动子泳动正常。结论结核分支杆菌ａｈｐＣ编码基因与耐ＩＮＨ无关；ａｈｐＣ启动子突变是结核分支杆菌ｋａｔＧ改变、过氧化氢酶缺乏的代偿性变化，也许能作为结核分支杆菌高度耐ＩＮＨ的间接指标。     

DNA序列分析与PCR—SSCP分析结核分支杆菌利福平敏感性的比较

目的 了解DNA序列分析与PCR—SSCP法分析利福平敏感性的价值。方法 应用DNA序列分析与PCR—SSCP法检测利福平敏感的结核分支杆菌临床分离株25株、耐药株41株的利福平耐药相关基因rpoB基因核心区域的突变情况。结果 25株利福平敏感株DNA序列分析未检测到rpoB基因突变，41株耐利福平株中38株发生突变，突变率为92．7％(38／41)；25株利福平敏感的结核分支杆菌菌株PCR—SSCP带型与对照H37Rv株相同，41株耐利福平结核分支杆菌菌株中38株SSCP带型不同于对照株，提示有突变存在。与DNA序列分析相比，PCR—SSCP检测准确率为93．9％(62／66)，敏感度为92．1％(35／38)；特异度是96．4％(27／28)。结论 DNA序列分析对判断结核分支杆菌耐利福平非常有价值；PCR—SSCP可用于利福平耐药结核分支杆菌的初步筛选。     

三种结核分支杆菌耐药基因的检测方法

目的：建立3种结核分支杆菌耐药基因的检测方法，了解耐药基因突变和耐药水平的关系。方法：108例临床痰标本分离株均做聚合酶链反应-单链构象多态性（PCR-SSCP）和传统梯度药敏试验。结果：耐SM(rpsL)、RFP(rpoB)、INH(KatG)基因突变率分别为78.5％，68.2％，70.5％，其中，高耐SM，RFP，INH分离株分别为86.5％，89.3％，84.3％；低耐分离株分别为28.5％，16.5％，7.1％。结论：结核分支杆菌耐药基因突变与耐药水平有密切联系，绝大多数结核分支杆菌耐药基因突变发生在高耐药株，少部分在低耐药株发生基因突变。     

DNA序列分析与PCR—SSCP分析结核分支杆菌利福平敏感性的比较

目的 了解DNA序列分析与PCR－SSCP两种方法分析利福平敏感性的价值。方法 应用DNA序列分析与PCR－SSCP法检测利福平敏感的结核分支杆菌临床分离株25株，耐药株41株的利福平耐药相关基因rpoB基因核心区域的突变情况。结果 25株利福平敏感株DNA序列分析未检测到rpoB基因突变，41株耐利福平株中38株发生突变，突变率为92.7%(38/41)；25株利平敏感的结核分支杆菌菌株PCR－SSCP带型与对照H37Rv相同，41株耐利福平结核分支杆菌菌株中38株SSCP型带不同对照株，提示有突变存在。与DNA序列分析相比，PCR－SSCP检测准确率为93.9%（62／66），敏感度为92.1%(35/38)，特异度是96.4%(27/28)。结论 DNA序列分析对判断结核分支杆菌耐利福平非常有价值。PCR－SSCP可用于初步筛选对利福平耐药的结核分支杆菌。     

聚合酶链反应－单链构象多态性用于耐利福平结核分支杆菌rpoB基因突变的研究

目的研究结核分支杆菌ｒｐｏＢ基因突变及其与利福平（ＲＦＰ）耐药性的关系。方法以参考菌株结核分支杆菌Ｈ３７Ｒｖ为对照，用聚合酶链反应－单链构象多态性（ＰＣＲ－ＳＳＣＰ）方法分析了４０株结核分支杆菌临床分离株。ＰＣＲ－ＳＳＣＰ方法由ＰＣＲ扩增和扩增产物ＤＮＡ单链多态性分析组成。结果两对引物ＰＣＲ扩增产物分别为４１１和２５８ｂｐ，其敏感性分别为５ｐｇ／μｌ、５００个菌／ｍｌ和１ｐｇ／μｌ、５００个菌／ｍｌ；均为属特异性。４０株结核分支杆菌临床分离株２５８ｂｐ扩增片段ＳＳＣＰ图谱的特点：以参考菌株结核分支杆菌Ｈ３７Ｒｖ为对照，１０株敏感株均无区别；单耐ＲＦＰ或包括ＲＦＰ多种抗结核药３０株，除３株外，其余２７株ＳＳＣＰ图谱有明显的区别；检测阳性率为９０％，特异性为１００％。结论ＰＣＲ－ＳＳＣＰ方法可检测出耐ＲＦＰ结核分支杆菌ｒｐｏＢ基因突变；该基因是ＲＦＰ的药物靶编码基因，它的突变与ＲＦＰ耐药性有密切关系，这有助于结核分支杆菌耐药性的快速检测和研究     

中国耐利福平结核分支杆菌rpoB基因突变特点

目的 为了阐明中国结核分支杆菌耐利福平析rpoB基因突变特点。方法 对242株结核分支杆菌临床分离包括rpoB基因核心区域81个碱基在内的588个碱基进行序列测定,其中耐利福平株193株,利福平敏感株46株,人工诱导的耐利福平株3株。结果 89．1％（172．193）的临床分离耐药株存在rpoB基因突变,而46株敏感株无突变。531位氨基酸突变率为46．1％;526位氨基酸突变率为17．1％;联合突变发生率为12．4％;还有4株细菌发生同义突变;未检测到发生缺失或插入突变的菌株。高耐药组（耐250μg/ml利福平）531位氨基酸的突变率显著高于低耐药组（耐50μg/ml利福平）,P＜0．05。结论 中国结核分支杆菌耐利福平株的rpoB基因突变的发生率约为90％,其中最常见的突变位点是531位丝氨酸和526位组氨酸,两者突变率之和约为63％;利福平高耐药组531位氨基酸发生突变的几率高于低耐药组;受度蓖株未发现搬运入或缺失突变;DNA序列分析对临床用药有指导意义。     

三种结核分支杆菌耐药基因的检测方法

目的　建立3种结核分支杆菌耐药基因的检测方法,了解耐药基因突变和耐药水平的关系。方法 108例临床痰标本分离株均做聚合酶链反应-单链构象多态性 (PCR-SSCP)和传统梯度药敏试验。结果 耐SM (rpsL)、RFP (rpoB)、INH (KatG)基因突变率分别为78.5%,68.2%,70.5%,其中,高耐SM,RFP,INH分离株分别为86.5%,89.3%,84.3%;低耐分离株分别为28.5%,16.5%,7.1%。结论 结核分支杆菌耐药基因突变与耐药水平有密切联系,绝大多数结核分支杆菌耐药基因突变发生在高耐药株,少部分在低耐药株发生基因突变。     

套式PCR及测序方法用于痰标本中结核分枝杆菌rpoB耐药基因突变检测

目的应用套式PCR—DNA测序方法直接检测痰标本中结核分枝杆菌相关的rpoB基因突变，以期建立一种直接检测分枝杆菌耐利福平的快速方法，并评价其临床应用价值。方法采用套武PCR—DNA测序方法直接检测112例活动性肺结核患者和20例非结核性肺部疾病患者痰、标本中结核分枝杆菌rpoB基因突变情况。同份痰标本同时做涂片抗酸染色，罗氏培养及菌型鉴定。结果112例活动性肺结核患者痰标本套式PCR扩增87例呈阳性，产物DNA测序31例有rpoB基因突变。其中分离出耐利福平株的32例痰中29例发生了基因突变，耐药突变率90．6％（29／32），39例菌阴（涂阴培阴）痰中有2例发生突变。分离出对利福平敏感株的37例痰中未发生突变，20例非结核性肺部疾病患者痰标本套式PCR扩增均为阴性，特异性100％。结论套式PCR—DNA测序可望为直接检测临床痰标本中结核分枝杆菌耐利福平的准确、特异、快速的方法。     

逆向点杂交方法检测耐利福平结核分支杆菌rpoB基因突变

目的 建立一种灵敏、特异、快速检测结核分支杆菌耐药相关基因突变的方法，用于临床对利福平耐药的快速诊断。方法 将14条特异性探针固定在尼龙膜上，通过在下游引物标记生物素的方法得到生物素标记的结核分支杆菌DNA PCR扩增产物，与固定在尼龙膜上的特异性探针杂交，杂交物通过链酶亲和素标记辣根过氧化物酶及底物（四甲基联苯胺）显色判定结果。将杂交结果与基因测序结果及药敏试验结果进行对比分析。结果 采用逆向点杂交法共检测23株耐利福平及11株敏感型菌株，与药敏试验结果、测序结果符合率分别为28／34和30／34。所发现突变类型依次为：第531位突变11株，第526位突变7株，第533位突变3株。未检测到第516位、第513位碱基突变。结论 该方法可用于临床结核分支杆菌对利福平耐药性的快速检测。     

对利福平耐药的结核分枝杆菌rpoB基因突变与耐药程度关系的探讨

目的　探讨对利福平耐药结核分枝杆菌的rpoB基因的突变位置与耐药程度的关系。方法　 32株对5 0 μg·mL-1的利福平耐药 (R5 0 )、2 2株对 2 5 0 μg·mL-1的利福平耐药 (R2 5 0 )、10株对利福平、异烟肼、乙胺丁醇及链霉素敏感的结核分枝杆菌株 (R0 )和 1株H3 7Rv结核分枝杆菌株包括核心区域在内的rpoB基因片段进行了DNA序列分析。结果　 (1) 10株 (R0 )对利福平、异烟肼、乙胺丁醇及链霉素敏感的结核分枝杆菌株和 1株H3 7Rv结核分枝杆菌株未检测到rpoB基因易突变区的改变 ;(2 )耐利福平的低耐药 (R5 0 )结核分枝杆菌突变 2 5株 (78 1% ) ;耐利福平的高耐药 (R2 5 0 )结核分枝杆菌突变 2 1株 (95 5 % ) ,两者差异无显著性 (P =0 170 ) ;(3)耐利福平的低耐药 (R5 0 )结核分枝杆菌突变点呈散在分布 ;(4 )耐利福平的高耐药 (R2 5 0 )结核分枝杆菌突变以 5 31位氨基酸突变为主 (5 7 1% )以及联合突变较多见 (2 3 8% ) ,与R5 0相比两者差异有显著性。结论　大部分对利福平耐药的结核分枝杆菌均有rpoB基因突变。在对利福平低耐药结核分枝杆菌的rpoB基因中 ,其突变位置呈散在分布。在对利福平高耐药结核分枝杆菌的rpoB基因中 ,5 31位密码子突变及多个密码子联合突变是其主要突变特征。     

应用反向斑点杂交法检测耐利福平结核分支杆菌rpoB基因突变

目的　探讨快速检测rpoB基因突变的敏感方法 ,以期建立适合我国国情的结核分支杆菌耐药株的快速检测手段。方法　根据结核分支杆菌野生株序列 ,自行设计覆盖rpoB基因核心突变区的系列寡核苷酸探针并将其固定在尼龙膜上 ,然后应用生物素标记的特异性引物扩增包含核心突变区的rpoB基因片段 ,与固定在膜上的寡核苷酸探针杂交 ,对突变位点进行快速检测 ,并与药敏试验及DNA测序结果进行比较。结果　应用反向斑点杂交法检测 36株耐药株和 2 2株敏感株rpoB基因的突变位点 ,并据此判断其对利福平的药敏特性 ,结果敏感性为 88.9% ,特异性为 86 .4 % ,药敏结果符合率为 87.9% ,与测序结果的符合率为 89.7%。结论　反向斑点杂交法可以快速、敏感地检测rpoB基因突变 ,进而早期判断结核分支杆菌对利福平的药敏特性。     

套式PCR及测序方法用于痰标本中结核分枝杆菌rpoB耐药基因突变检测

目的应用套式PCR-DNA测序方法直接检测痰标本中结核分枝杆菌相关的rpoB基因突变,以期建立一种直接检测分枝杆菌耐利福平的快速方法,并评价其临床应用价值。方法采用套式PCR-DNA测序方法直接检测112例活动性肺结核患者和20例非结核性肺部疾病患者痰标本中结核分枝杆菌rpoB基因突变情况。同份痰标本同时做涂片抗酸染色,罗氏培养及菌型鉴定。结果112例活动性肺结核患者痰标本套式PCR扩增87例呈阳性,产物DNA测序31例有rpoB基因突变,其中分离出耐利福平株的32例痰中29例发生了基因突变,耐药突变率90.6%(29/32),39例菌阴(涂阴培阴)痰中有2例发生突变。分离出对利福平敏感株的37例痰中未发生突变,20例非结核性肺部疾病患者痰标本套式PCR扩增均为阴性,特异性100%。结论套式PCR-DNA测序可望为直接检测临床痰标本中结核分枝杆菌耐利福平的准确、特异、快速的方法。     

应用基因阵列法快速检测结核分枝杆菌rpoB基因突变

目的　研制一种新型的基因阵列 ,用于结核分枝杆菌耐利福平分离株rpoB基因突变的快速检测。方法　根据结核分枝杆菌rpoB基因序列设计寡核苷酸探针并制作基因阵列 ,用生物素标记的引物扩增结核分枝杆菌rpoB基因突变热点的目的片断 ,与基因阵列杂交 ,同时以聚合酶链反应 单链构象多态性 (PCR SSCP)技术及DNA测序法为对照。结果　 111株结核分枝杆菌临床分离株经PCR SSCP分析 ,4 1株RFP敏感株SSCP图谱与结核分枝杆菌标准株相同 ;70株耐RFP菌株中 ,6 3株(90 % )SSCP图谱与结核分枝杆菌标准株不同 ,其余 7株SSCP图谱与结核分枝杆菌标准株相同。基因阵列检测结果 4 1株RFP敏感株杂交图谱与标准株完全相同 ,70株耐RFP临床分离株中 ,6 3株检测到rpoB基因突变 ,检出率为 90 % ;其中 37株 (5 3% ) 5 31位丝氨酸 (Ser)置换 ,15株 (2 1% ) 5 2 6位组氨酸(His)置换 ,11株 (16 % )其他位置的氨基酸置换。基因阵列检测结果与PCR SSCP及测序结果一致。结论　用基因阵列法可简便、快速、准确地检测出大多数结核分枝杆菌耐利福平分离株的rpoB基因突变。     

三种方法检测结核分枝杆菌吡嗪酰胺耐药性的比较

目的 探讨绝对浓度法、液体培养基最低抑菌浓度（MIC）法和噬菌体生物扩增（PhaB）法检测结核分枝杆菌（MTB）吡嗪酰胺（PZA）耐药性的临床应用价值。方法 应用3种方法同时检测90株MTB临床分离株PZA耐药性，并比较检测结果的敏感度、特异度、阳性和阴性预测值及准确度。结果 90株MTB临床分离株用绝对浓度法、液体培养基MIC法和PhaB法3种方法分别测得21株、33株、22株敏感株和69株、57株、68株耐药株。若以绝对浓度法测定结果为判断标准，则PhaB法检测PZA耐药性的敏感度、特异度、阳性和阴性预测值及准确度分别为94．2％、85，7％、95．6％、81．8％、92．2％；若以液体培养基MIC法测定结果为判断标准，则PhaB法检测的敏感度、特异度、阳性和阴性预测值及准确度分别为98．2％、63．6％、82．4％、95．5％、85．6％；若以绝对浓度法和液体培养基MIC法测定结果为判断标准，则PhaB法检测的敏感度、特异度、阳性和阴性预测值及准确度分别为96．4％、90．0％、96．4％、90．0％、94．7％。结论 绝对浓度法尽管是目前国内常用的方法，但影响因素较多；液体培养基MIC法测定虽能提早报告药物敏感结果，但检测条件尚需优化；PhaB法检测快速、简便、安全，有一定的应用价值。     

结核分支杆菌耐吡嗪酰胺分离株pncA基因突变的研究

目的 了解我国结核分支杆菌耐吡嗪酰胺（ＰＺＡ）分离株ｐｎｃＡ基因突变情况,研究其与耐ＰＺＡ之间的关系。方法 通过聚合酶链反应（ＰＣＲ）－单链构象多态性（ＳＳＣＰ）和ＰＣＲ－循环测序法（ＡＳ）分析７４株结核分支杆菌临床分离株的ｐｎｃＡ基因。以结核分支杆菌Ｈ３７ＲＶ标准株为对照。结果３２株药物敏感株ｐｎｃＡ基因ＳＳＣＰ分析未发现异常。２０株耐非ＰＺＡ药物的分离株中,１６株ｐｎｃＡ基因ＳＳＣＰ泳动正常;