DNA序列分析与PCR—SSCP分析结核分支杆菌利福平敏感性的比较

目的 了解DNA序列分析与PCR－SSCP两种方法分析利福平敏感性的价值。方法 应用DNA序列分析与PCR－SSCP法检测利福平敏感的结核分支杆菌临床分离株25株，耐药株41株的利福平耐药相关基因rpoB基因核心区域的突变情况。结果 25株利福平敏感株DNA序列分析未检测到rpoB基因突变，41株耐利福平株中38株发生突变，突变率为92.7%(38/41)；25株利平敏感的结核分支杆菌菌株PCR－SSCP带型与对照H37Rv相同，41株耐利福平结核分支杆菌菌株中38株SSCP型带不同对照株，提示有突变存在。与DNA序列分析相比，PCR－SSCP检测准确率为93.9%（62／66），敏感度为92.1%(35/38)，特异度是96.4%(27/28)。结论 DNA序列分析对判断结核分支杆菌耐利福平非常有价值。PCR－SSCP可用于初步筛选对利福平耐药的结核分支杆菌。     

DNA序列分析与PCR—SSCP分析结核分支杆菌利福平敏感性的比较

目的 了解DNA序列分析与PCR—SSCP法分析利福平敏感性的价值。方法 应用DNA序列分析与PCR—SSCP法检测利福平敏感的结核分支杆菌临床分离株25株、耐药株41株的利福平耐药相关基因rpoB基因核心区域的突变情况。结果 25株利福平敏感株DNA序列分析未检测到rpoB基因突变，41株耐利福平株中38株发生突变，突变率为92．7％(38／41)；25株利福平敏感的结核分支杆菌菌株PCR—SSCP带型与对照H37Rv株相同，41株耐利福平结核分支杆菌菌株中38株SSCP带型不同于对照株，提示有突变存在。与DNA序列分析相比，PCR—SSCP检测准确率为93．9％(62／66)，敏感度为92．1％(35／38)；特异度是96．4％(27／28)。结论 DNA序列分析对判断结核分支杆菌耐利福平非常有价值；PCR—SSCP可用于利福平耐药结核分支杆菌的初步筛选。     

聚合酶链反应-单链构象多态性技术检测耐多药结核分支杆菌rpoB、KatG、rpsL突变的研究

目的　应用PCRSSCP技术快速检测耐INH,RFP,SM结核分支杆菌分离株KatG、rpoB、rpsL基因突变,评价其在检测结核分支杆菌耐药性方面的价值。方法 32株耐INH、RFP、SM结核分支杆菌临床分离株及25株结核分支杆菌敏感分离株用PCRSSCP方法分别检测,rpoB、KatG、rpsL基因突变。结果 32株耐多药结核分支杆菌分离株中,rpoB、KatG、rpsL PCR扩增产物PCR-SSCP分别有28株(87.5%)rpoB基因,19株(59.3%)KatG基因和23株(71.9%)rpsL基因电泳条带与结核分支杆菌标准株H₃₇Rv电泳条带相比有明显差异,而25株结核分支杆菌敏感株的PCR-SSCP条带与结核分支杆菌H₃₇Rv相似,特异性为100%。结论 PCR-SSCP方法敏感、特异,可快速检测结核分支杆菌rpoB、KatG、rpsL耐药基因突变,有利于耐多药结核分支杆菌耐药性的快速检测。     

结核分枝杆菌rpoB基因突变特征与利福平耐药水平关系的研究

目的 了解结核分枝杆菌rpoB基因突变特征与利福平耐药水平的关系。方法 测定266株(109株利福平耐药株,157株利福平敏感株)结核分枝杆菌利福平MIC值及其rpoB基因序列,分析不同突变特征的菌株其利福平MIC值的差异。结果 109株利福平耐药株rpoB基因皆发生错义突变,常见突变密码子531与526的突变频率分别为69.7%与17.4%。利福平耐药株中单密码子突变株占82.6%,多重密码子突变株占17.4%。531单密码子突变株与526单密码子突变株之间平均利福平MIC值差异无统计学意义(P=0.87),但两独立样本T检验分析显示,多重密码子突变株平均利福平MIC值(115.8 μg/mL)显著高于单密码子突变株平均利福平MIC值(48.4 μg/mL)(t=2.659,P=0.016)。利福平敏感株未发生错义突变。5.5%(6/109)的利福平耐药株仅在rpoB基因起始端发生突变,突变密码子分别是247,251和253。结论 531与526是最常见突变密码子,且以单密码子突变为主;531与526单密码子突变株之间利福平耐药水平差异无统计学意义,但多重密码子突变株利福平耐药水平显著高于单密码子突变株利福平耐药水平;rpoB基因起始端突变可能是除利福平耐药决定区域之外导致利福平耐药的第2个耐药决定区;rpoB基因DNA序列分析有助于结核分枝杆菌利福平耐药表型和耐药水平的预测。     

210株结核分枝杆菌利福平耐药基因rpoB突变特征研究

目的了解结核分枝杆菌利福平耐药株rpoB基因突变特点。方法对结核分枝杆菌临床分离株包括rpoB基因利福平耐药决定区(RRDR)81个碱基在内的286bp的片段进行PCR-SSCP分析,并对经检测显示有突变的结核分枝杆菌的rpoB基因此扩增区域进行序列测定。结果共对210株结核分枝杆菌临床分离菌株进行了研究,其中利福平耐药株110株,非利福平耐药株40株,敏感株60株。PCR-SSCP检测显示110株利福平耐药株中有75株有突变存在,经测序分析,77.3%(58/75)的菌株发生rpoB基因的单位点突变,主要集中在456位60.3%(35/58)和451位25.9%(15/58);22.7%(25/110)的菌株发生了联合突变。此外,经PCR-SSCP检测,40株非利福平耐药株中有3株发生突变,60株敏感株中有2株发生突变。经直接测序分析突变涉及位点为436位、451位和460位。结论结核分枝杆菌利福平耐药的主要原因是rpoB基因耐药决定区发生突变,其中456位丝氨酸和451位组氨酸是最常见的突变位点。     

三种结核分支杆菌耐药基因的检测方法

目的　建立3种结核分支杆菌耐药基因的检测方法,了解耐药基因突变和耐药水平的关系。方法 108例临床痰标本分离株均做聚合酶链反应-单链构象多态性 (PCR-SSCP)和传统梯度药敏试验。结果 耐SM (rpsL)、RFP (rpoB)、INH (KatG)基因突变率分别为78.5%,68.2%,70.5%,其中,高耐SM,RFP,INH分离株分别为86.5%,89.3%,84.3%;低耐分离株分别为28.5%,16.5%,7.1%。结论 结核分支杆菌耐药基因突变与耐药水平有密切联系,绝大多数结核分支杆菌耐药基因突变发生在高耐药株,少部分在低耐药株发生基因突变。     

PCR-SSCP技术快速检测结核分枝杆菌rpoB基因突变的研究

目的 应用PCR-SSCP技术直接快速检测痰标本中结核分枝杆菌rpoB基因突变,评价此方法用于结核分枝杆菌利福平 (RFP)耐药性的意义。方法 以结核分枝杆菌H37Rv为对照、50例耐RFP(单耐和多耐)结核分枝杆菌临床分离株、12例RFP敏感菌株、35例耐RFP肺结核患者痰标本,采用PCR-SSCP检测痰标本和菌株中结核杆菌rpoB基因突变。结果 50例耐RFP菌株中有45例PCR-SSCP条带与结核分枝杆菌H37Rv条带有明显差别,与药敏试验结果做对比,PCR-SSCP检测敏感性为90%,特异性为100%;12例敏感菌株与H37Rv条带一致,35份肺结核病人痰标本,21份痰PCR扩增阳性,15份SSCP图谱与H37Rv图谱有差别,而且PCR-SSCP28份图谱与H37Rv有差别,阳性率为80%。结论 PCR-SSCP检测结核分枝杆菌rpoB基因突变快速、简便、易行,有望用于结核分枝杆菌RFP耐药性的快速测定,并将成为直接检测临床标本中结核分枝杆菌耐RFP快速方法。     

中国耐利福平结核分支杆菌rpoB基因突变特点

目的 为了阐明中国结核分支杆菌耐利福平析rpoB基因突变特点。方法 对242株结核分支杆菌临床分离包括rpoB基因核心区域81个碱基在内的588个碱基进行序列测定,其中耐利福平株193株,利福平敏感株46株,人工诱导的耐利福平株3株。结果 89．1％（172．193）的临床分离耐药株存在rpoB基因突变,而46株敏感株无突变。531位氨基酸突变率为46．1％;526位氨基酸突变率为17．1％;联合突变发生率为12．4％;还有4株细菌发生同义突变;未检测到发生缺失或插入突变的菌株。高耐药组（耐250μg/ml利福平）531位氨基酸的突变率显著高于低耐药组（耐50μg/ml利福平）,P＜0．05。结论 中国结核分支杆菌耐利福平株的rpoB基因突变的发生率约为90％,其中最常见的突变位点是531位丝氨酸和526位组氨酸,两者突变率之和约为63％;利福平高耐药组531位氨基酸发生突变的几率高于低耐药组;受度蓖株未发现搬运入或缺失突变;DNA序列分析对临床用药有指导意义。     

PCR－SSCP技术快速检测结核分枝杆菌 rpoB基因突变的研究

目的 应用PCR-SSCP技术直接快速检测痰标本中结核分枝杆菌rpoB基因突变,评价此方法用于结核分枝杆菌利福平 (RFP)耐药性的意义。方法 以结核分枝杆菌H37Rv为对照、50例耐RFP(单耐和多耐)结核分枝杆菌临床分离株、12例RFP敏感菌株、35例耐RFP肺结核患者痰标本,采用PCR-SSCP检测痰标本和菌株中结核杆菌rpoB基因突变。结果 50例耐RFP菌株中有45例PCR-SSCP条带与结核分枝杆菌H37Rv条带有明显差别,与药敏试验结果做对比,PCR-SSCP检测敏感性为90%,特异性为100%;12例敏感菌株与H37Rv条带一致,35份肺结核病人痰标本,21份痰PCR扩增阳性,15份SSCP图谱与H37Rv图谱有差别,而且PCR-SSCP28份图谱与H37Rv有差别,阳性率为80%。结论 PCR-SSCP检测结核分枝杆菌rpoB基因突变快速、简便、易行,有望用于结核分枝杆菌RFP耐药性的快速测定,并将成为直接检测临床标本中结核分枝杆菌耐RFP快速方法。     

应用线性探针分析快速检测耐利福平结核分支杆菌的rpoB基因突变

目的：检测上海地区耐利福平结核分支杆菌的rpoB基因突变,评估线性探针分析（LiPA)法快速检测突变位点的意义。方法：对58株结核分支杆菌rpoB基因片段进行PCR扩增及DNA测序,从中选取18株耐药株和10株敏感株并应用LiPA法检测其突变位点,结果：LiPA法准确地检测出18株耐药株中17株的rpoB基因突变,10株敏感株均无突变;LiPA法检测耐药菌的敏感性为94．4％,与药敏结果的符合率为96．4％,结论：LiPA法可用于耐利福平结核分支杆菌rpoB基因的快速检测,而且具有较高的敏感性。     

套式PCR及测序方法用于痰标本中结核分枝杆菌rpoB耐药基因突变检测

目的应用套式PCR-DNA测序方法直接检测痰标本中结核分枝杆菌相关的rpoB基因突变,以期建立一种直接检测分枝杆菌耐利福平的快速方法,并评价其临床应用价值。方法采用套式PCR-DNA测序方法直接检测112例活动性肺结核患者和20例非结核性肺部疾病患者痰标本中结核分枝杆菌rpoB基因突变情况。同份痰标本同时做涂片抗酸染色,罗氏培养及菌型鉴定。结果112例活动性肺结核患者痰标本套式PCR扩增87例呈阳性,产物DNA测序31例有rpoB基因突变,其中分离出耐利福平株的32例痰中29例发生了基因突变,耐药突变率90.6%(29/32),39例菌阴(涂阴培阴)痰中有2例发生突变。分离出对利福平敏感株的37例痰中未发生突变,20例非结核性肺部疾病患者痰标本套式PCR扩增均为阴性,特异性100%。结论套式PCR-DNA测序可望为直接检测临床痰标本中结核分枝杆菌耐利福平的准确、特异、快速的方法。     

等位基因特异性多重聚合酶链反应方法用于快速检测结核分枝杆菌利福平耐药株

目的建立检测耐利福平(RFP)结核分枝杆菌的等位基因特异性多重聚合酶链反应(multiplex allele specific polymerase chain reaction,MAS-PCR)方法,快速、特异地检测rpoB基因核心突变区的主要突变,用于快速诊断结核分枝杆菌对利福平的耐药性。方法根据结核分枝杆菌的rpoB序列,分别设计出3对特异性寡聚核苷酸引物,采用MAS-PCR技术,分别检测rpoB基因上531、526、516这3个最常见的突变位点的突变。结果对临床分离的利福平敏感株(15株)及利福平突变株(81株)进行检测,以直接测序结果为参照,对利福平耐药株的总检出率为81.5%(66/81)。结论MAS-PCR方法敏感、特异,可快速、简便地检测结核分枝杆菌rpoB基因突变,有利于耐药结核分枝杆菌的快速检测。     

rpoB mutations as an epidemiologic marker in rifampin-resistant Mycobacterium tuberculosis.

SETTING: Cases of rifampin-resistant Mycobacterium tuberculosis from the prison population in Madrid and from the general population in Spain. OBJECTIVE: To identify the rpoB mutations associated with resistance to rifampin and to investigate rpoB genotyping as an epidemiological marker in rifampin-resistant M. tuberculosis. DESIGN: Twenty-nine rifampin-resistant clinical isolates of M. tuberculosis, 15 obtained from the prison population in Madrid and 14 from the general population in Spain, were characterized by sequence analysis of the 81-bp core region of the rpoB gene and IS6110 DNA fingerprinting. RESULTS: All the isolates had mutations in rpoB, with those in codon 531 accounting for 41% of the total. Twenty-three (79%) isolates were highly resistant to rifampin (minimum inhibitory concentration > or = 64 mg/L). Nineteen different IS6110 fingerprints were observed: one was shared by seven isolates, one by three, two by two, and 15 were unique. Two IS6110 clusters could be divided into subclusters on the basis of rpoB analysis. Epidemiologic links were identified among patients whose isolates had identical IS6110 patterns and rpoB genotypes, but not between those with identical IS6110 patterns and different rpoB genotypes. CONCLUSION: Characterization of rpoB mutations can provide information about susceptibility to rifampin and be a useful epidemiological tool for discrimination of rifampin-resistant strains of M. tuberculosis with identical IS6110 fingerprints.     

依赖利福平结核分枝杆菌相关蛋白的氨基酸及其编码基因序列研究

目的 研究临床依赖利福平结核分枝杆菌（依R菌）相关蛋白的氨基酸及其编码基因序列。方法以罗氏绝对浓度法药敏实验鉴定临床依R菌株（49株）、耐R菌株（54株）和R敏感菌株（30株），用十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺电泳（SDS-PAGE）法对不同临床菌株及H37Rv标准株共计134株菌株的菌体蛋白质图谱进行比较分析，通过Q-TOF2型毛细管液相色谱-电喷雾-四极杆-飞行时间串联质谱仪（LC-ESI-MS-MS）对其差异表达蛋白的氨基酸序列进行鉴定，并用对其蛋白的编码基因进行DNA序列分析。结果不同菌株的SDS-PAGE菌体蛋白图谱基本相似。49株依R菌有4l株（84％）在含R管中的菌体蛋白图谱有一条相同的高表达蛋白带（相对于标准物分子质量43000的下端），约占总菌体蛋白的30％～50％，H37Rv标准株、28株R敏感菌（28／30）及44株耐R菌（44／54）的含R管和对照管的蛋白图谱相似，且无相应的高表达现象；该高表达蛋白经氨基酸序列鉴定为结核分枝杆菌H37Rv假设蛋白Rv0341，相对分子质量为43894，等电点（PI）5．25，得分183。不同菌株的Rv0341编码基因1440bp扩增片段，经DNA测序分析均未发现突变。结论利福平对Rv0341在依R菌中的表达有上调作用，Rv0341与依R菌相关，可视为依R菌的相关蛋白或标志物；Rv0341与依R菌的毒力及细胞壁的合成是否相关有进一步的研究价值。     

结核分支杆菌利用福平药物敏感性的直接快速检测

探讨利用分子生物 学方法直接快速检测临床标本结核分支杆菌利福平（ＲＦＰ）药物敏感性的可行性。方法自行设计针对ｒｐｏＢ基因特异扩增的引物（扩增产物为１８３ｂｐ片段）,运用聚合酶链反应－单链构象多态性（ＰＣＲ－ＳＳＣＰ）银染色法,检测４５株结核分支杆菌临床分离株,对其中部分菌株进行ｒｐｏＢ基因ＤＮＡ序列分析,运用ＰＣＲ－ＳＳＣＰ银染色法对７０份结核病患痰标本进行直接快速检测,并与药敏试验结果做对照分     

应用基因阵列法快速检测结核分枝杆菌rpoB基因突变

目的　研制一种新型的基因阵列 ,用于结核分枝杆菌耐利福平分离株rpoB基因突变的快速检测。方法　根据结核分枝杆菌rpoB基因序列设计寡核苷酸探针并制作基因阵列 ,用生物素标记的引物扩增结核分枝杆菌rpoB基因突变热点的目的片断 ,与基因阵列杂交 ,同时以聚合酶链反应 单链构象多态性 (PCR SSCP)技术及DNA测序法为对照。结果　 111株结核分枝杆菌临床分离株经PCR SSCP分析 ,4 1株RFP敏感株SSCP图谱与结核分枝杆菌标准株相同 ;70株耐RFP菌株中 ,6 3株(90 % )SSCP图谱与结核分枝杆菌标准株不同 ,其余 7株SSCP图谱与结核分枝杆菌标准株相同。基因阵列检测结果 4 1株RFP敏感株杂交图谱与标准株完全相同 ,70株耐RFP临床分离株中 ,6 3株检测到rpoB基因突变 ,检出率为 90 % ;其中 37株 (5 3% ) 5 31位丝氨酸 (Ser)置换 ,15株 (2 1% ) 5 2 6位组氨酸(His)置换 ,11株 (16 % )其他位置的氨基酸置换。基因阵列检测结果与PCR SSCP及测序结果一致。结论　用基因阵列法可简便、快速、准确地检测出大多数结核分枝杆菌耐利福平分离株的rpoB基因突变。