细粒棘球绦虫重组Bb-Eg95-EgA31疫苗诱导BALB/c小鼠的保护力观察

目的探讨细粒棘球绦虫(Eg)重组双歧杆菌(Bb)-Eg95-EgA31疫苗免疫和Eg原头节攻击后小鼠的囊重抑制率、抗体及其亚类的变化。方法将细粒棘球绦虫重组Bb-Eg95-EgA31疫苗分别采用皮下注射、肌肉注射、鼻腔内接种和口服灌胃4种途径免疫BALB/c小鼠,免疫后8周每鼠用50个Eg原头节攻击感染,感染后25周剖杀小鼠,分离细粒棘球蚴包囊并称重,计算囊重抑制率;收集血清,常规ELISA测定血清IgG及其亚类和IgE水平,试验设有空载体、Bb和MRS对照。结果皮下注射组、肌肉注射组、鼻腔内接种组和口服灌胃组免疫小鼠的囊重抑制率分别为45.33%、41.33%、70.67%和62.67%,血清IgGI、gG2aI、gG2b和IgG1水平显著升高,IgG3和IgE水平显著降低。结论接种Bb-Eg95-EgA31疫苗能诱导小鼠产生保护力,IgGI、gG2aI、gG2b和IgG1起重要作用。     

细粒棘球绦虫转Eg95-EgA31融合基因苜蓿疫苗诱导小鼠脾细胞亚群的变化

目的 探讨细粒棘球绦虫(Eg)转Eg95-EgA31融合基因苜蓿疫苗免疫和Eg原头节攻击后小鼠脾CD4+和CD8+T淋巴细胞亚群的变化.方法 热絮凝法提取转基因苜蓿叶蛋白,用无菌双蒸水将叶蛋白提取液配成20 g/L,同时提取转空质粒(pBI121)苜蓿叶蛋白及正常苜蓿叶蛋白作对照.32只雌性Balb/c小鼠按体质量随机分为4组,每组8只.口服灌胃组:灌胃接种100 μl转基因苜蓿叶蛋白提取液;鼻腔黏膜接种组:滴鼻接种10 μl转基因苜蓿叶蛋白提取液;空质粒对照组:滴鼻接种10μl转空质粒苜蓿叶蛋白提取液;正常蛋白对照组:灌胃接种100μl正常苜蓿叶蛋白提取液.小鼠每3天免疫1次,连续免疫2个月.末次免疫后第8周,各组小鼠用Eg原头节腹腔注射攻击感染(50个/只),感染后第24周剖杀小鼠,分离脾细胞,用流式细胞仪检测脾CD4+和CD8+T淋巴细胞亚群百分比.结果 口服灌胃组小鼠脾CD4+T细胞亚群百分比(0.286±0.009)、CD8+ T细胞亚群百分比(0.102±0.004)和CD4+/CD8+比值(2.814±0.014)均显著高于正常蛋白对照组(0.166±0.018、0.083±0.006、2.019±0.369,P<0.01或<0.05);鼻腔黏膜接种组小鼠脾CD4+T细胞亚群百分比(0.269±0.016)和CD4+/CD8+比值(2.955±0.986)与正常蛋白对照组比较明显升高(P均<0.01);口服灌胃组小鼠脾CD4+T细胞亚群百分比高于鼻腔黏膜接种组(P<0.05);空质粒对照组小鼠脾CD4+、CD8+T细胞百分比和CD4+/CD8+比值(0.169±0.018、0.093±0.019、1.852±0.188)与正常蛋白对照组比较,差异无统计学意义(P均>0.05).结论 CD4+T细胞亚群可能与细粒棘球绦虫转Eg95-Eg31融合基因苜蓿疫苗诱导的小鼠抗Eg原头节攻击感染的保护力有关.疫苗灌胃接种可能是一种较好的免疫途径.     

细粒棘球绦虫转Eg95-EgA31融合基因苜蓿疫苗免疫BALB/c小鼠后脾T淋巴细胞亚群的动态观察

目的动态观察细粒棘球绦虫转Eg95-EgA31融合基因苜蓿疫苗免疫小鼠后诱导的脾T淋巴细胞亚群的变化。方法热絮凝法提取转基因苜蓿疫苗叶蛋白,将其浓度配制成20μg/μL,132只BALB/c小鼠随机分为3组,用100μL(约含1μg融合抗原)灌胃接种和10μL(约含0.1μg融合抗原)滴鼻接种分别免疫小鼠,每3 d 1次,连续免疫2个月,同时设非转基因苜蓿叶蛋白滴鼻免疫对照组。在末次免疫后0、2、4、6、8、10、12、14、16、18和20周各组随机剖杀4只小鼠,取脾,分离脾细胞,流式细胞仪(FCM)检测脾CD4+和CD8+T淋巴细胞亚群的百分比。结果灌胃接种组小鼠脾CD4+和CD8+T细胞亚群分别在免疫后6~10周和4~12周升高,分别在免疫后6周和8周达高峰,百分比分别为0.294±0.002和0.168±0.027;滴鼻接种组小鼠脾CD4+和CD8+T细胞亚群分别在免疫后4~6周和4~10周升高,分别在免疫后6周和8周达高峰,百分比分别为0.318±0.051和0.197±0.008。结论CD4+和CD8+T细胞亚群在细粒棘球绦虫转Eg95-EgA31融合基因苜蓿疫苗诱导的保护性免疫机制中起重要作用。     

转Eg95-EgA31融合基因苜蓿疫苗诱导小鼠脾T淋巴细胞增殖的研究

目的探讨细粒棘球绦虫(Eg)转Eg95-EgA31融合基因苜蓿疫苗免疫小鼠用Eg原头节攻击后脾T淋巴细胞增殖的变化。方法热絮凝法提取转基因苜蓿的叶蛋白,配成浓度为20μg/μl。分别用100μl(约含1μg融合抗原)口服灌胃和10μl(约含0.1μg融合抗原)滴鼻接种免疫BALB/c小鼠,每3 d 1次,连续免疫2个月。同时设转空质粒(pBI121)苜蓿叶蛋白及正常苜蓿叶蛋白对照组。末次免疫后8周,每只小鼠用50个Eg原头节腹腔注射感染。感染后24周杀鼠,检获包囊并称重,计算囊重减少率;分离脾细胞,体外经Eg粗抗原(EgAg)或刀豆素A(ConA)刺激培养,四甲基偶氮唑盐比色法(MTT法)检测免疫小鼠脾T淋巴细胞增殖情况。结果与正常蛋白对照组相比,疫苗口服灌胃组小鼠检获包囊质量明显降低,囊重减少率为64.1%。两免疫组小鼠的脾T细胞增殖水平显著高于正常蛋白对照组(P0.01);口服灌胃组小鼠的脾T细胞增殖水平高于滴鼻接种组(P0.01)。结论细粒棘球绦虫转Eg95-EgA31融合基因苜蓿疫苗接种可诱导小鼠脾脏T淋巴细胞增殖,口服接种是一种较好的免疫途径。     

细粒棘球绦虫重组BCG-Eg95疫苗免疫小鼠后脾细胞亚群的动态观察

目的 动态观察细粒棘球绦虫重组BCG-Eg95疫苗免疫小鼠后脾细胞亚群的变化.方法 将120只Balb/c小鼠按体质量随机分为3组:鼻腔内接种组、口服灌胃组、对照组.将疫苗分别采用鼻腔内接种和口服灌胃免疫实验组小鼠,对照组单次接种10μl磷酸盐缓冲液(PBS)于小鼠鼻腔黏膜.在免疫后0、2、4、6、8、10、12、14、16、18周各剖杀4只小鼠,取脾脏,分离脾细胞,流式细胞仪检测脾CD4+、CD8+T淋巴细胞亚群的百分比.结果 不同组的小鼠脾细胞CD4+、CD8+亚群百分比比较差异有统计学意义(F值分别为21.56、22.08,P＜0.05),不同周数的小鼠脾细胞CD4+、CD8+亚群百分比比较差异有统计学意义(F值分别为5.75、6.29.P＜0.01).鼻腔内接种组的脾CD4+、CD8+T细胞亚群分别在免疫后6-18、12周升高,在免疫后10、12周达最高水平,其值分别为0.348±0.013、0.090±0.003.与0周(0.230±0.022、0.069±0.015)比较差异有统计学意义(q值分别为7.32、5.32,P＜0.01或＜0.05);口服灌胃组脾细胞CD4+、CD8+T细胞亚群分别在免疫后6～16、8-18周增加,分别在免疫后10、16周达最高水平,其值分别为0.405±0.006、0.096±0.004,与0周(0.230±0.022、0.069±0.015)比较差异有统计学意义(q值分别为7.53、5.35,P＜0.01或＜0.05).结论 CD4+、CD8+T细胞亚群在细粒棘球绦虫重组BCG-Eg95疫苗诱导的小鼠免疫应答中起重要作用.     

多房棘球绦虫重组BCG-Em14-3-3疫苗免疫和Em原头节攻击后诱导小鼠脾细胞亚群变化的研究

目的探讨多房棘球绦虫重组BCG-Em14—3—3疫苗免疫和Em原头节攻击后小鼠脾CD4^＋和CD8^＋T淋巴细胞亚群数量和比值的变化。方法将疫苗采用皮下注射和鼻腔内接种分别免疫BALB／c鼠．免疫后8w用多房棘球绦虫原头节进行攻击感染，感染后18w杀鼠取脾，分离脾细胞。流式细胞仪检测脾CD4^＋和CD8^＋T淋巴细胞亚群的百分比．同时设有空载体、BCG和PBS对照。结果疫苗接种组的脾CD8^＋T细胞亚群显著增加．CD8^＋T细胞亚群无明显变化．CD4^＋／CD8^＋亚群比值明显升高；鼻腔内接种组的CD4^＋和CD4^＋／CD8^＋亚群比值显著高于皮下注射组。结论CD8^＋T细胞亚群在多房棘球绦虫重组BCG-Em14—3—3疫苗诱导的小鼠抗Em原头节攻击感染的保护性免疫机制中起关键作用，疫苗鼻腔内接种是一种较好的免疫途径。     

细粒棘球绦虫重组BCG-Eg95疫苗诱导小鼠脾细胞淋巴因子变化的研究

目的 探讨细粒棘球绦虫（Eg）重组BCG-Eg95疫苗免疫后对受攻击小鼠的包囊减重率及脾细胞淋巴因子的影响。方法 细粒棘球绦虫重组BCG-Eg95疫苗分别采用皮下注射、鼻腔内接种、口服灌胃和肌肉注射4种途径免疫BALB/C小鼠，免疫后8周用Eg原头节攻击感染，50个Eg原头节/每只小鼠，感染后18周剖杀小鼠，分离并称重细粒棘球蚴，计算包囊减重率；取脾，分离脾细胞，用Eg粗抗原（EgAg）或伴刀豆球蛋白A（ConA）刺激培养，收集脾细胞培养上清液，检测脾细胞培养上清液的白介素-2（IL-2）、γ干扰素（IFN-γ）、肿瘤坏死因子α（TNF-α）和白介素-4（IL-4）水平。同时设卡介苗（BCG）和磷酸盐缓冲液（PBS）对照。 结果 以上4种疫苗接种组的包囊减重率分别为45.77%、18.20%、88.05%和92.46%；疫苗肌肉接种组的IL-2、IFN-γ和TNF-α均较PBS对照为高，分别为（30.0±0）pg/ml、（65.0±0）pg/ml和（425.0±10.7） pg/ml， IL-4低于PBS对照组， 为（10.0±0） pg/ml。 结论 细粒棘球绦虫重组BCG-Eg95疫苗诱导小鼠产生辅助性T细胞1型（Th1）反应，从而对抗Eg原头节攻击感染。     

多房棘球绦虫重组BCG-Em14-3-3疫苗免疫小鼠后脾T细胞亚群的动态观察

目的动态观察多房棘球绦虫重组BCG-Em14-3-3疫苗免疫小鼠后脾T细胞亚群的变化。方法将疫苗采用鼻腔内接种方法免疫BALB/c鼠,在免疫后0、2、4、6、8、10、12、14、16和18周各剖杀4只小鼠,取脾,分离脾细胞,流式细胞仪检测脾CD4+和CD8+T淋巴细胞亚群的百分比,同时设PBS对照。结果疫苗接种组小鼠脾CD4+和CD8+T细胞亚群分别在免疫后2～12周和2～18周开始升高,分别在免疫后6和10周达最高水平,百分比分别为32.0%±1.6%和8.4%±0.8%。结论CD4+和CD8+T细胞亚群在多房棘球绦虫重组BCG-Em14-3-3疫苗诱导的小鼠抗Em原头节攻击感染的保护性免疫机制中起关键作用。     

细粒棘球绦虫重组Bb-Eg95-EgA31融合基因疫苗构建及鉴定

目的构建和鉴定细粒棘球绦虫(Eg)重组双歧杆菌(Bb)-Eg95-EgA31融合基因疫苗。方法自行设计引物,从细粒棘球蚴包囊中分离原头节,超声粉碎后提取总RNA为模板,通过RT-PCR分别扩增Eg95和EgA31抗原编码基因,然后采用基因拼接法(gene SOEing)剪接Eg95和EgA31,得到Eg95-EgA31融合基因,经BamHⅠ和EcoRⅠ双酶切,定向克隆到大肠杆菌-双歧杆菌穿梭表达载体pGEX-1λT中,转化大肠杆菌BL21(DE3)感受态细胞,构建重组质粒pGEX-Eg95-EgA31,抽提质粒进行双酶切鉴定,电穿孔法转化两歧双歧杆菌(Bifidobacteria bifidum,Bb),构建细粒棘球绦虫重组Bb-Eg95-EgA31融合基因疫苗,抽提质粒进行PCR扩增鉴定。结果RT-PCR扩增出约1 016bp的Eg95-EgA31融合基因;重组质粒用双酶切鉴定可切出预期大小片段,以具有氨苄青霉素抗性的rBb中抽提的质粒为模板进行PCR扩增可得到约1016bp的Eg95-EgA31融合基因片段。结论成功构建了细粒棘球绦虫重组Bb-Eg95-EgA31融合基因疫苗,为该疫苗的开发利用奠定了实验基础。     

pIL-12质粒DNA对细粒棘球蚴感染小鼠免疫应答的影响

目的探讨pIL-12质粒DNA免疫对细粒棘球蚴感染小鼠免疫应答的影响。方法将pIL-12质粒DNA肌肉注射免疫BALB/c鼠,免疫后8w用Eg原头节进行攻击感染,感染后18w剖杀小鼠,计算减蚴率;取脾并分离脾细胞,流式细胞仪检测脾CD4+和CD8+T淋巴细胞亚群的百分比;用EgAg或ConA刺激培养脾细胞,收集脾细胞培养上清液,用试剂盒检测脾细胞培养上清液的IL-2、IFN-γ、TNF-α和IL-4水平;流式细胞仪检测脾细胞的凋亡发生率,同时设有BCG和PBS对照。结果pIL-12质粒DNA免疫组的减蚴率为44.85%,脾CD4+和CD8+T细胞亚群显著增加,IL-2、IFN-γ和TNF-α水平升高,IL-4水平降低,脾细胞凋亡发生率明显低于PBS对照组。结论pIL-12质粒DNA可诱导细粒棘球蚴感染小鼠产生一个保护性的免疫反应。     

细粒棘球绦虫Eg95-EgA31融合基因苜蓿叶蛋白提取液诱导小鼠细胞因子的变化

目的探讨细粒棘球绦虫(Eg)Eg95-EgA31融合基因苜蓿叶蛋白提取液免疫小鼠被Eg原头节攻击感染后体内棘球蚴囊重减少率及细胞因子的变化。方法热絮凝法提取转基因苜蓿叶蛋白,同时提取转空质粒(pBI121)苜蓿叶蛋白和正常苜蓿叶蛋白作对照。32只雌性BALB/c小鼠随机均分4组,A和B组分别用转基因苜蓿叶蛋白提取液100μl灌胃和10μl滴鼻免疫小鼠,C组用转空质粒苜蓿叶蛋白提取液10μl滴鼻免疫小鼠,D组用正常苜蓿叶蛋白提取液100μl灌胃免疫小鼠。各组小鼠每3d免疫1次,连续免疫2个月。末次免疫后第8周,各组小鼠用Eg原头节腹腔注射攻击感染(50个/只),感染后第24周剖杀小鼠,分离并称重细粒棘球蚴囊,计算囊重减少率;取脾,分离脾细胞,用Eg粗抗原(EgAg)、伴刀豆球蛋白A(ConA)或脂多糖(LPS)刺激培养,收集脾细胞培养上清液,常规ELISA法检测脾细胞培养上清液中白介素-12(IL-12)、白介素-10(IL-10)、干扰素-γ(IFN-γ)和肿瘤坏死因子-α(TNF-α)水平。结果A、B、C和D组小鼠的棘球蚴囊重分别为(28.0±36.0)、(41.0±33.0)、(72.0±36.0)和(78.0±57.0)mg,A组低于D组(P0.05),囊重减少率为64.1%。A组的IFN-γ、1L-12和TNF-α水平高于D组(P0.01),分别为(925.0±88.6)、(22.5±2.7)和(82.5±11.7)pg/ml,IL-10水平低于D组(P0.01),为(125.0±26.7)pg/ml;B组小鼠脾的IFN-γ和TNF-α水平高于D组(P0.01),分别为(750.0±100.0)和(80.0±13.1)pg/ml,IL-12和IL-10水平与D组相比差异无统计学意义(P0.05);C组小鼠脾细胞因子水平与D组相比,差异无统计学意义(P0.05)。当用EgAg、ConA或LPS刺激时,刺激组的细胞因子水平高于相应的未刺激组(P0.05或P0.01),ConA或LPS刺激组的细胞因子水平高于EgAg刺激组(P0.05或P0.01)。结论转细粒棘球绦虫Eg95-EgA31融合基因苜蓿叶蛋白提取液可诱导免疫鼠产生Th1型细胞免疫应答以对抗Eg原头节的攻击感染。     

细粒棘球绦虫(中国大陆株)亲肌肉抗原重组蛋白的免疫保护性研究

目的探讨细粒棘球蚴(Echinococcus granulosus,Eg)亲肌肉抗原重组蛋白的免疫保护性及其作为候选疫苗的潜在价值。方法ICR小鼠随机分为蛋白免疫组和佐剂对照组,每隔2w皮下免疫1次,在第3次免疫后2周,用Eg原头蚴进行攻击感染,感染后20w剖杀小鼠,检获棘球蚴包囊,计算免疫保护力,并用ELISA法测定血清中IgG及其亚型和IgE水平。结果与佐剂对照组比较,蛋白免疫组小鼠的免疫保护力为94.46%;与免疫前比较,免疫后和攻击感染后蛋白免疫组小鼠血清IgG、IgG1、IgG3和IgE水平均明显升高(P<0.05),IgG2b降低(P<0.05)。结论细粒棘球绦虫亲肌肉抗原重组蛋白能诱导小鼠产生一定的保护性免疫,是潜在的疫苗候选抗原分子。     

微囊法棘球蚴继发感染小鼠动物模型的建立

目的 通过体外培养原头蚴发育成微囊,经腹腔注射建立稳定的细粒棘球蚴和多房棘球蚴继发感染小鼠动物模型。方法 无菌条件下采集羊源细粒棘球绦虫原头蚴和鼠源多房棘球绦虫原头蚴,经胃蛋白酶消化后检测虫体活力并计数,于37℃、5%CO₂条件下进行体外培养至发育成微囊,以每鼠50个微囊的剂量经腹腔注射的途径分别接种BALB/c小鼠。接种6个月后,通过腹部解剖大体观察和病理检测分析各组小鼠的感染情况及包虫囊的生长情况。结果 原头蚴在体外培养60d时发育成微囊,显微镜下观察Eg具有明显的透明角质层结构,而Em微囊角质层较薄。小鼠细粒棘球蚴和多房棘球蚴的感染率均为100%,Eg包虫囊为游离单囊,成囊率达70%,囊内无原头蚴;Em包虫囊为类似肿瘤的团块状组织,病灶内有生发囊及原头蚴。结论 采用微囊法可建立稳定的棘球蚴继发感染小鼠动物模型,为疫苗研制、药物筛选和疗效判定提供研究动物模型。     

细粒棘球蚴亲肌肉抗原在小鼠中的免疫保护力研究

目的 对细粒棘球蚴亲肌肉抗原(myophilin antigen)进行原核表达、纯化并用小鼠实验评价其免疫学特性. 方法 提取总RNA,构建克隆质粒Eg myophilin/pGEM-T,然后将亲肌肉抗原基因亚克隆于表达载体pET28a,进行诱导表达;纯化重组蛋白并免疫小鼠.利用Western blot、ELISA鉴定其免疫学特性,并通过包囊计数,评价其免疫保护力. 结果 成功构建原核重组表达载体Eg myophilin/pET28a,并表达、纯化出浓度较高的亲肌肉抗原.ELISA检测显示,用纯化的亲肌肉抗原免疫小鼠,诱导产生了特异性抗体;Western blot鉴定该抗体能识别重组抗原及原头蚴.攻击感染实验表明亲肌肉抗原免疫小鼠的包囊数为0.93±2.1,对照组为7.13±10.21,两者差异有统计学意义,获得的保护力约为94.4%. 结论 成功表达细粒棘球蚴亲肌肉抗原,纯化后的重组蛋白具有抗原性和免疫原性,有望作为棘球蚴病疫苗候选分子.     

细粒棘球蚴重组抗原rEgferritin诱导宿主抗感染免疫应答的初步研究

目的 初步探讨细粒棘球蚴重组铁蛋白rEgferritin免疫小鼠产生的抗细粒棘球蚴感染的免疫机制.方法 rEgferritin免疫ICR小鼠3次、同时设立佐剂组和对照组,第12w用细粒棘球蚴原头蚴对3组小鼠进行攻击感染,5个月后剖杀小鼠,检查各组小鼠腹腔内包囊个数,根据公式计算保护力.分别于0w,12w,32w取血,制...     

多房棘球绦虫重组Bb-EmⅡ/3-Em14-3-3疫苗对小鼠脾细胞凋亡的影响

目的检测多房棘球绦虫重组双歧杆菌(Bb)-EmⅡ/3-Em14-3-3疫苗对原头蚴攻击小鼠脾细胞凋亡的影响。方法用重组Bb-EmⅡ/3-Em14-3-3疫苗分别通过皮下注射、肌肉注射、鼻腔粘膜接种以及口服接种免疫BALB/c小鼠12周后,用50个多房棘球绦虫原头蚴腹腔注射进行攻击,攻击感染后18周剖杀小鼠,检获泡球蚴组织,称取重量,计算减蚴率;分离脾细胞,用ConA刺激培养16~18h,然后用流式细胞仪检测脾细胞凋亡。结果疫苗免疫组小鼠检获泡球蚴质量均明显低于PBS对照组;小鼠脾细胞原液组和ConA刺激组细胞凋亡发生率均显著低于PBS对照组(P<0.05或P<0.01),每个ConA刺激组脾细胞凋亡发生率显著高于相应的原液组(P<0.05或P<0.01),皮下注射组脾细胞凋亡发生率最低。结论多房棘球绦虫重组Bb-EmⅡ/3-Em14-3-3疫苗可抑制感染小鼠脾细胞发生凋亡,增加CD4+T细胞亚群的数量,诱导宿主产生一定的保护力,对抗Em原头节攻击。