细菌内重组法快速构建血管内皮生长因子165重组腺病毒载体

背景：腺病毒载体具有在哺乳动物及其多种细胞基因转移和蛋白表达的高效性,目前以细菌内重组法构建病毒载体成为常用方法。 目的：观察以细菌内重组法构建血管内皮生长因子165重组腺病毒载体的可行性。 设计、时间及地点：基因转染病毒载体的单一样本实验,于2007-10/2008-02在中山大学分子生物实验室完成。 材料：合成血管内皮生长因子165基因的引物合成和序列测定由上海生工公司提供。pDNR-1r质粒(已含有绿色荧光蛋白基因)、pInt.AV.spaT质粒、pInt.B.B质粒均购自广州拓普基因技术公司。 方法：通过动态模板PCR 基因合成法合成的血管内皮生长因子165基因克隆入pMD18-T载体获得pMD18-T-VEGF165。将pMD18-T-VEGF165和pDNR经EcoRⅠ和BamHⅠ双酶切,构建pDNR-VEGF165载体,酶切鉴定后,pDNR-VEGF165与pInt.AV1.spat共转化BNN菌株的感受态细胞,构建pInt.AV1.spat.VEGF165腺病毒表达载体,将线性化的pInt.AV1.SpaT-VEGF165和pInt.B.B转染293细胞。 主要观察指标：以DNA 测序、酶切及聚合酶链反应法鉴定重组质粒和病毒,并测定重组腺病毒的感染效率。 结果：重组质粒用EcoR Ⅰ酶切后,切成2条片段,大小约为1 kb和6.9 kb,实际的酶切分析结果与理论分析相符,证明转化子中的重组质粒为Cre-LoxP系统介导的含有血管内皮生长因子165基因的重组质粒。荧光显微镜下,8 h后即可见部分细胞发出荧光,24 h发荧光的细胞数及强度达到高峰,转染率超过80%。线性化的pInt.AV1.SpaT-VEGF165和pInt.B.B共转染293细胞,12~14 d后会出现细胞病变效应。分别提取病变293细胞、正常293细胞的DNA,PCR后,1%琼脂糖凝胶电泳,病变的293细胞在约500 bp处出现条带。 结论：以细菌内重组法获得了含有成熟血管内皮生长因子165基因的重组腺病毒。     

人血管生成素1和血管内皮生长因子165重组腺病毒载体构建及目的基因表达*★

目的：拟构建人血管生成素1和血管内皮生长因子165腺病毒载体，观察靶细胞转染后目的基因的表达水平。 方法：通过RT-PCR方法克隆人Ang-1全长编码基因，PCR法以pcDNA3.0-VEGF165质粒为模板扩增VEGF165基因，分别将目的基因酶切连接到带有GFP标记的pTrack-CMV质粒上，构建重组质粒pTrack-CMV-Ang-1和 pTrack-CMV-VEGF165，经PCR、酶切和测序鉴定后将其PmeI线性化与腺病毒质粒pAdeasy-1共转化BJ5183细菌，获得重组腺病毒载体pAdeasy-1-pTrack-CMV-Ang-1/VEGF165，经PacI线性化后转染QBI-293A包装细胞，收获重组腺病毒Ad-Ang-1及Ad-VEGF165。 结果：PCR﹑双酶切和测序鉴定结果证实成功构建pTrack-CMV-Ang-1/VEGF165重组转移质粒，PmeI线性化后重组腺病毒载体获得成功包装。脂质体转染QBI-293A细胞后光镜下可见由腺病毒引起的细胞圆缩、聚集呈菌落状的典型细胞病理性改变；荧光显微镜下可见绿色荧光蛋白的表达，且荧光强度随培养时间延长而逐渐增强；经多轮感染、扩增后，病毒效价可达（2.0~5.0）×1010 pfu/mL。转染48 h后，293A细胞中的血管生成素1与血管内皮生长因子含量均明显提高（F=427.93，17.93，P < 0.05）。 结论：成功构建并获得了Ad-Ang-1及Ad-VEGF165重组腺病毒，血管生成素1与血管内皮生长因子165均能在靶细胞中有效表达。     

人骨形态发生蛋白2和人成纤维细胞生长因子2双基因共表达腺病毒载体的构建及鉴定

背景：内部核糖体进入位点序列载体能将上下游基因共同转录,故通过此载体可使连接在一起的人骨形态发生蛋白2和人成纤维细胞生长因子2同时高表达,可为骨缺损的治疗提供新方法。 目的：实验通过引入内部核糖体进入位点序列,采用基于attLXattR的λ噬茵体位点特异性重组系统的GatewayTM技术构建带有人骨形态发生蛋白2和人成纤维细胞生长因子2双基因重组腺病毒载体并进行鉴定。 方法：用聚合酶链反应方法扩增人骨形态发生蛋白2和人成纤维细胞生长因子2目的基因,将两个基因亚克隆至pIRES2-EGFP载体中,构建phBMP2-IRES-hFGF2载体,通过BP反应将hBMP2-IRES-hFGF2重组到载体pDONR221中,再通过LR反应将其转移到腺病毒载体pAd/CMV/V5-DEST中,线性化后转染293细胞进行包装获得重组腺病毒Ad-hBMP2-IRES-hFGF2。 结果与结论：phBMP2-IRES-hFGF2经酶切及测序鉴定正确,带hBMP2-IRES-hFGF2的载体在293细胞中包装成功,获得成熟的病毒颗粒,病毒滴度为2.82×1010 ifu/mL,证实成功构建了带有人骨形态发生蛋白2和人成纤维细胞生长因子2双基因重组腺病毒载体。     

构建携带VEGF121-FLAG和hrGFP-1基因腺病毒表达载体在骨髓基质干细胞中的表达

血管内皮生长因子具有促进血管生成的作用,在骨缺损的治疗研究中运用较多,但其异构体VEGF121的研究较少。 目的：构建携带VEGF121-FLAG和hrGFP-1基因的腺病毒表达载体并观测其在骨髓基质干细胞中的表达。 方法：以pTG19T-VEGF121为模板利用PCR技术突变VEGF121基因以去除VEGF121基因中终止密码子,之后在基因序列前后分别加入NotⅠ和XhoⅠ酶切位点,并将得到的基因亚克隆至pMD19-T质粒上,双酶切pMD19-T-VEGF121和pShuttle-CMV-IRES- hrGFP-1质粒,凝胶回收小片段和大片段,后进行连接反应,完成穿梭质粒的构建。重组病毒物理滴度测定后感染骨髓基质干细胞,在荧光显微镜下观察荧光强度。 结果与结论：经酶切鉴定及基因测序证实重组腺病毒质粒构建成功, 荧光显微镜下观察表明, 感染重组腺病毒的骨髓基质干细胞有明显的绿色荧光表达。可见构建的携带VEGF121-FLAG和hrGFP-1基因的腺病毒表达载体可在真核细胞表达, 有可能用于缺血性疾患的基因治疗。     

携带人内皮抑素基因的重组腺病毒构建及表达*☆

目的：内皮抑素是目前发现的作用最强的内皮细胞抑制因子，但内皮抑素蛋白极不稳定，难以制备及应用，故需要借助基因治疗发挥其抑制血管生成的作用。实验利用AdEasy-1系统构建并鉴定人内皮抑素重组腺病毒，并在人血脐静脉内皮细胞中表达出内皮抑素蛋白。 方法：实验于2006-03/10在中山大学生命科学院完成。以Pshuttle-Endostatin质粒为模板，应用特异引物，通过聚合酶链反应扩增纯化得到Endostatin基因片断，经测序鉴定后，酶切插入穿梭质粒pAdTrack-CMV中，再与骨架质粒AdEasy-1在大肠杆菌BJ5183中进行同源重组，重组质粒经筛选、提取、纯化后，经酶切及测序鉴定正确，再大量扩增为腺病毒载体，线性化后利用脂质体2000转染AAV293细胞包装并扩增，得到的病毒液纯化扩增后，感染人脐静脉内皮细胞，反转录-聚合酶链反应检测感染细胞中目的基因的表达，蛋白免疫印迹检测感染细胞中蛋白的表达。 结果：获得的Endostatin基因片段经酶切及测序鉴定正确，重组腺病毒质粒经酶切及测序鉴定正确，成功转染AAV293细胞，包装并扩增出病毒液，纯化后测滴度为2.06×1010 pfu/mL，进一步感染人脐静脉内皮细胞，在其中检测到目的基因及蛋白表达。 结论：人内皮抑素重组腺病毒pAd-Endo构建成功，且可在人脐静脉内皮细胞中表达出相应的目的基因及蛋白。     

动脉内皮细胞中TIE2启动CREG真核表达质粒pTIE2-CREG-EGFP-N1的表达

背景：血管内皮发生的分子机制是细胞及基因替代治疗的首要前提。 目的：构建一种通过血管内皮细胞特异蛋白TIE2启动子来启动表达的E1A激活基因阻遏子(cellular repressor of E1A-stimulated genes, CREG)和增强绿色荧光蛋白(enhanced green fluorescence protein, EGFP)融合的真核表达质粒。 方法：根据GenBank中公布的TIE2基因的启动子序列,人工合成TIE2启动子DNA序列,经AseⅠ和NheⅠ双酶切后,亚克隆入表达质粒pEGFP-N1中构建pTIE2-EGFP-N1。同时,用BamHⅠ和EcoRⅠ 双酶切pcDNA3.1 myc-His/hCREG质粒得到CREG基因,亚克隆入质粒pTIE2-EGFP-N1中构建pTIE2-CREG-EGFP-N1,酶切鉴定。应用脂质体法将该质粒转染至体外培养的小鼠动脉内皮细胞,荧光显微镜下观察EGFP的表达;Western blot检测CREG蛋白的表达。 结果与结论：经酶切鉴定证实实验构建的pTIE2-CREG-EGFP-N1质粒正确;体外转染48 h,荧光显微镜下可见EGFP的表达,Western blot检测到CREG蛋白的表达。说明实验成功构建了pTIE2-CREG-EGFP-N1重组质粒,其可携带目的基因在小鼠动脉内皮细胞中有效表达。     

靶向胆囊癌血管内皮生长因子基因短发夹样RNA表达质粒的构建与筛选

背景：已有研究通过RNA干扰技术,抑制结肠癌、前列腺癌和视网膜母细胞瘤细胞的血管内皮细胞生长因子基因的表达。尚未见关于RNA干扰血管内皮生长因子抑制胆囊癌肿瘤的相关研究。 目的：创新性构建编码胆囊癌血管内皮生长因子基因的短发夹样RNA 质粒表达载体,筛选出沉默血管内皮生长因子基因效果最明显的短发夹样RNA表达质粒。 设计、时间及地点：基因工程观察实验,于2008/2009在中南大学湘雅医院卫生部肝胆肠外科研究中心实验室完成。 材料：人胆囊癌细胞株GBC-SD购于同济大学肿瘤研究所。 方法：设计4对针对血管内皮生长因子基因不同位点的短发夹样RNA片段, 构建携带此短发夹样RNA片段的表达质粒(短发夹样RNA1~4)并行酶切鉴定分析。然后通过脂质体将重组质粒转染到胆囊癌细胞株GBC-SD中,48 h后测定转染率。 主要观察指标：重组质粒酶切鉴定结果。转染效率。采用及荧光PCR检测血管内皮生长因子mRNA表达。 结果：成功构建了靶向血管内皮生长因子基因的短发夹样RNA 质粒表达载体, 其中抑制效果最为明显的短发夹样RNA 质粒表达载体为pDC316-EGFP-U6-shRNA2 质粒。重组质粒经酶切鉴定证实构建成功。质粒在GBC-SD细胞中的转染率约为58.6%。短发夹样RNA抑制血管内皮生长因子基因的mRNA表达,短发夹样RNA2抑制率最高,可达86%。 结论：成功构建并筛选出的靶向血管内皮生长因子的短发夹样RNA表达质粒,其对胆囊癌GBC-SD细胞内的血管内皮生长因子表达具有明显抑制作用。短发夹样RNA2表达质粒抑制作用最明显。     

人骨形成蛋白2真核表达载体的构建和体外表达

背景：骨形态发生蛋白2(bone morphogenetic protein 2,BMP-2) 是已知的所有生长因子中对骨的形成作用最强的生长因子，被认为是最具有前途的骨诱导物质。 目的：构建人骨形成蛋白2真核表达载体并观察其体外表达情况。 设计、时间及地点：自身对照实验，于2005-07/2006-05在华中科技大学同济医学院分子生物中心实验室完成。 材料：pcDNA3.1(+)载体由华中科技大学同济医学院左石博士惠赠；成骨肉瘤组织由华中科技大学同济医学院附属协和医院骨科提供。 方法：从人成骨肉瘤细胞中提取细胞总RNA，利用反转录-聚合酶链反应方法扩增获得人BMP-2基因cDNA，将基因片断重组到pGEM-T质粒中构建pGEM-T- hBMP-2重组质粒载体，转化到大肠杆菌DH5α后筛选阳性克隆，利用限制性酶切和DNA序列分析鉴定重组质粒。分别用RcoRI和NotI双酶切pGEM-T- hBMP-2质粒和pcDNA3.1真核表达载体，将克隆载体中人骨形成蛋白2基因重组到pcDNA3.1真核表达载体，提取质粒作酶切电泳、聚合酶链反应鉴定及DNA测序后，用脂质体体外转染小鼠骨髓基质细胞，反转录-聚合酶链反应检测BMP-2的表达。 主要观察指标：①人骨肉瘤细胞总RNA 反转录-聚合酶链反应结果。②重组质粒pGEM-T-hBMP-2 和pcDNA3.1-hBMP-2的构建和酶切鉴定。③BMP-2在小鼠骨髓基质细胞内的表达。 结果：人骨肉瘤细胞总RNA经反转录-聚合酶链反应扩增后，获得1.2 kb条带。经酶切电泳、聚合酶链反应鉴定及DNA测序证实实验成功克隆BMP-2基因，重组质粒pcDNA3.1- hBMP-2构建正确;该重组质粒能在体外培养的小鼠骨髓基质细胞中有效表达BMP-2。 结论：实验成功克隆人骨形成蛋白2基因并构建了此基因的真核表达载体。     

构建人HCN4基因重组腺病毒载体及其对大鼠骨髓间充质干细胞的感染效率

背景：超极化激活及环化核苷酸门控阳离子通道(hyperpolarization-activated cyclic nucleotide-gated cation channel, HCN)基因由于具有不增加诱发心律失常的风险、能够接受自主神经系统调节等优势,成为目前最受关注的生物起搏备选基因。 目的：构建携带人HCN4基因的重组腺病毒载体,并测定其对大鼠骨髓间充质干细胞的感染效率。 设计、时间及地点：细胞-基因学体外实验,于2008-02/09在中山大学附属第二医院林百欣实验中心完成。 材料：SD大鼠10只,由中山大学实验动物中心提供。携带目的基因人HCN4 cDNA的质粒pcDNA3.1-HCN4、人胚肾293细胞、大肠杆菌DH5α由中山大学附属第二医院林百欣实验中心保存。腺病毒穿梭质粒pShuttle-CMV、骨架质粒pAdxsi购自北京诺赛基因组研究中心有限公司。 方法：质粒pcDNA3.1-HCN4用Hind Ⅲ+Xba Ⅰ双酶切后回收HCN4片段,亚克隆至pShuttle-CMV中,得到重组穿梭质粒;I-Ceu Ⅰ+I-Sce Ⅰ双酶切处理pShuttle-CMV-HCN4,回收CMV-HCN4片段,亚克隆至腺病毒骨架载体pAdxsi,得到重组腺病毒质粒;重组腺病毒质粒酶切线性化后,应用脂质体法转染293细胞进行包装扩增,得到重组腺病毒AdHCN4;应用AdHCN4转染大鼠骨髓间充质干细胞。 主要观察指标：重组腺病毒质粒载体的鉴定,重组腺病毒的鉴定及滴度测定,重组腺病毒的感染效率。 结果：构建的重组穿梭质粒pShuttle-CMV-HCN4用Hind Ⅲ+Xho Ⅰ双酶切,得到大小为3 600 bp(HCN4)和5 100 bp (pShuttle-CMV)两个片段,DNA测序结果证实人HCN4基因的全长序列已正确插入到pShuttle-CMV穿梭质粒中;重组腺病毒质粒pAdxsi-CMV-HCN4用XhoⅠ酶切得到7个片段,而作为对照的空腺病毒质粒只得到6个片段;重组腺病毒质粒在293细胞中包装后产生的重组腺病毒对293细胞有致病作用;重组腺病毒AdHCN4 PCR鉴定可见657 bp的阳性扩增条带;经多次重复感染后,病毒滴度检测达2.5×1011PFU/mL。成功转染AdHCN4的大鼠骨髓间充质干细胞可表达绿色荧光蛋白,当病毒感染复数值为800,转染效率最高,达90%。 结论：实验成功构建携带人HCN4基因的重组腺病毒载体,并可在体外有效转染大鼠骨髓间充质干细胞。     

重组人骨形态发生蛋白2晚期自体骨痂成骨对血管内皮生长因子表达的影响

背景：重组人骨形态发生蛋白2和重组人骨形态发生蛋白7治疗骨缺损已经应用于多种实验动物模型。作者前期实验在兔自体髂骨与骨痂骨等长骨骨折治疗中应用，已取得满意效果。 目的：验证采用骨折断端周围晚期自体骨痂复合重组人骨形态发生蛋白2移植治疗骨缺损效果，并观察血管内皮生长因子对骨折愈合的影响。 设计、时间及地点：随机对照实验，于2008-08/2009-01在本溪市中心医院科研实验室和中国医科大学附属二院实验动物中心完成。 材料：2.0~2.5 kg的成年健康日本大耳白兔20只。 方法：将兔行双侧桡骨中段模拟骨折，12周后观察至明显骨痂生长随机分配实验Ⅰ组10只，实验Ⅱ组10只。在原骨折部位手术，切除骨痂备用，同时切除骨折端使之缺损1.5 cm，实验Ⅰ组，左桡骨移植复合重组人骨形态发生蛋白2骨痂为为骨形态发生蛋白2骨痂组，右桡骨移植髂骨为移植自体髂骨组，实验Ⅱ组，左桡骨移植晚期自体骨痂为移植晚期自体骨痂组，右桡骨空白对照为空白对照组。 主要观察指标：于术后14 d取标本检测各组兔血管内皮生长因子基因mRNA表达水平的。 结果：骨形态发生蛋白2骨痂组、移植髂骨组的血管内皮生长因子mRNA及蛋白表达水平差异无显著性意义(P > 0.05)；移植晚期自体骨痂组、空白对照组血管内皮生长因子未见明显表达。骨形态发生蛋白2骨痂组、移植髂骨组的血管内皮生长因子蛋白表达及基因表达明显高于移植晚期自体骨痂组、空白对照组(P < 0.05)。 结论：骨折断端周围晚期自体骨痂复合重组人骨形态发生蛋白2明显促进血管内皮生长因子的合成分泌，对促进骨缺损愈合有积极意义。     

重组腺病毒载体pAdeasy-1/pAdtrack-CMV-GFP-β-NGF的构建和鉴定

目的构建携带绿色荧光蛋白(GFP)标记的小鼠β-NGF重组腺病毒载体。 方法利用RT-PCR法从小鼠颌下腺总mRNA中扩增β-NGF全长cDNA片断,定向克隆于腺病毒穿梭质粒pAdtrack-CMV(已标记绿色荧光蛋白)中;在细菌中与缺陷型腺病毒基因组pAdeasy-1进行同源重组,构建Adeasy- 1/pAdtrack-CMV-GFP-β-NGF载体,并进行酶切鉴定。 结果成功获得小鼠-NGF全长扩增片段;pAdTrack-CMV-β-NGF测序验证含有目的基因;双酶切鉴定成功构建重组pAdTrack-CMV-β-NGF质粒;限制性内切酶的酶切分析结果证明成功构建同源重组的Adeasy-1/pAdtrack-CMV-GFP-β-NGF载体。 结论本实验所用方法可高效、安全构建腺病毒载体pAdeasy- 1/pAdtrack-CMV-GFP-β-NGF。     

重组共表达质粒pIRES-hVEGF121cDNA/hBMP-4转染骨髓间充质干细胞对其成骨分化的影响

背景：在许多情况下,人体组织修复是多因子共同协调作用的结果,因而共表达多基因载体的构建能够满足多因子基因治疗的需要,是近年来基因治疗的新思路。 目的：观察重组pIRES-hVEGF121cDNA/hBMP-4共表达质粒转染大鼠骨髓间充质干细胞后的表达及其对大鼠骨髓间充质干细胞向成骨细胞分化的影响,为骨缺损的联合基因治疗奠定基础。 方法：使用全骨髓培养法分离、培养大鼠骨髓间充质干细胞;流式细胞仪检测骨髓间充质干细胞表面标志抗原的表达;重组pIRES-hVEGF121cDNA/hBMP-4共表达质粒经酶切鉴定后,在脂质体介导下将其转入大鼠骨髓间充质干细胞,提取总RNA和总蛋白,进行RT-PCR和Western blot检测;茜素红染色检测转染后大鼠骨髓间充质干细胞的成骨分化能力。 结果与结论：流式细胞仪检测显示CD90表达强阳性,CD45表达阴性;重组pIRES-hVEGF121cDNA/hBMP-4共表达质粒成功转染至大鼠骨髓间充质干细胞中,并获得有效共表达;转染后第14天,茜素红染色阳性,能够诱导大鼠骨髓间充质干细胞向成骨细胞分化,为骨缺损的联合基因治疗奠定了基础。     

腺病毒表达载体pAdEasy-1/pAdTrack-CMV-Shh-N的构建及表达

目的构建携带Son ic hedgehog氨基端(Shh-N)基因的腺病毒表达系统并在包装细胞中制备相关病毒颗粒,以用于中枢神经系统疾病的基因治疗。方法应用多聚酶链式反应(PCR)技术扩增Shh-N,然后克隆至含巨细胞病毒(CMV)启动子的真核表达载体pAdTrack-CMV,在细菌中与缺陷型腺病毒基因组pAdEasy-1进行重组,构建pAdEasy-1/pAdTrack-CMV-Shh-N,然后转染包装细胞293细胞系。结果成功获得Shh-N片段并构建了缺陷型腺病毒表达载体pAdEasy-1/pAdTrack-CMV-Shh-N,经限制性酶切后证实该表达载体含Shh-N基因,在293细胞中小规模扩增病毒后,经PCR检测证实病毒颗粒中存在Shh-N基因。结论获得了携带Shh-N的腺病毒颗粒,可将之用于基因修饰神经细胞,进行促细胞存活和定向分化诱导研究,为自身干细胞和外源性细胞移植治疗中枢神经系统疾病的临床应用提供理论和实验基础。     

重组腺病毒Ad5-mHes1的构建及其在小鼠海马组织中的表达

目的 构建含小鼠Hes1基因的重组腺病毒(rAd)并观察其在小鼠海马组织中的表达情况,为进一步研究Hes1基因在成年小鼠神经再生中的作用奠定基础。 方法 利用限制酶对pEGFP-mHes1质粒和pDC316质粒进行酶切,将获得的mHes1目的基因片段和pDC316质粒酶切产物回收,在T4 DNA连接酶作用下连接,形成pDC316-mHes1穿梭质粒,并用PCR法及EcoR Ⅰ+HindⅢ双酶切法对pDC316-mH-Hes1进行鉴定。利用AdMax包装系统,穿梭质粒pDC316-mHes1与骨架质粒pBHGlox_E1,3Cre共转染293细胞,同源重组产生复制缺陷型腺病毒Ad5-mHes1,其报告病毒是包含高强度绿色荧光蛋白(EGFP)的腺病毒Ad5 -EGFP。向成年C57BL/6小鼠海马中立体定向注射Ad5 -mHes1及Ad5-EGFP,Western blotting检测注射后7 d Hes1蛋白在海马中的表达情况,荧光显微镜观察EGFP在海马中的表达情况。 结果 用PCR法及EcoR Ⅰ+HindⅢ双酶切法对pDC316-mHes1鉴定的实验结果与预期结果相符,经测序后其序列与mHes1 CDS序列一致。注射后7d,Hes1蛋白在PBS注射组和Ad5-mHes1注射组海马组织中均有表达,其Hes1蛋白与GAPDH的比值分别为0.363±0.053和0.705±0.128,差异有统计学意义(P＜.05)。荧光显微镜下在海马齿状回颗粒细胞层中观察到Ad5-EGFP表达的绿色荧光。 结论 本研究成功构建了Ad5-mHes1表达载体系统,并在C57BL/6成年小鼠海马组织中表达了Hes1基因。     

人pre—mir181a腺病毒载体的构建与鉴定

目的探讨构建携带人pre—mir181a基因的重组腺病毒载体,为基因治疗研究提供一种新的方法,并观察其在神经胶质瘤细胞U251细胞中的表达。方法以从Genesil公司购买的含有mir181a的质粒为模板扩增pre—mir181a基因,将回收的PCR产物片段克隆入pGenesil载体,获得重组质粒pGenesil—pre—mir181a。从pGenesil—pre—mir181a上通过LR体外同源重组将mir181a microRNA表达框转移至pGSadeno腺病毒表达载体上。在体外用不同感染复数（M·O·I）值rAd5-mir181ab分别转染神经胶质瘤细胞U251细胞。采用流式细胞仪、RT—PCR方法检测目的基因的转染效率和表达。结果PCR、酶切鉴定以及序列测定与比对分析表明,重组腺病毒rAd5-mir181a构建正确。神经胶质瘤细胞U251细胞转染rAd5-mir181a的最高效率可达99％,转染后的神经胶质瘤细胞U251细胞表达相应的mir181a。结论本实验成功构建了含mir181a基因的重组腺病毒rAd5-mir181a载体,在体外能高效转染神经胶质瘤细胞U251细胞。     

携带人血红素加氧酶-1基因重组腺病毒的构建及其在大脑皮层神经元中的表达

目的构建人血红素加氧合酶-1（hHO-1）基因的重组腺病毒,并研究其感染大脑皮层神经元的效率。方法采用基因克隆技术,将hHO-1基因克隆到腺病毒穿梭质粒pShuttle—IRES—hrGFP中,构建pShuttle-hHO-1-IRES—hrGFP质粒,利用细菌BJ5183将穿梭质粒与pAdEasy-1进行重组,获得重组的腺病毒质粒。线性化的腺病毒质粒经脂质体转染AD293细胞,进行重组腺病毒的包装和扩增。采用CsCl梯度离心进行病毒纯化。获得的腺病毒感染大脑皮层神经元,观察其感染效率和hHO-1表达水平。结果通过酶切鉴定证明腺病毒载体构建成功,包装出携带hHO-1基因的腺病毒,病毒滴度为2．0×10^10pfu／ml,获得的腺病毒对大脑皮层神经元的感染效率高于95％以上。结论成功地利用细菌内同源重组方法构建了携带hHO-1基因的腺病毒,并能够在大脑皮层神经元中高效地表达,为利用HO—1进行基因治疗提供了材料。