mTLR-2基因的克隆及其在毕赤酵母中的表达

目的 :克隆mTLR 2基因 ,并在毕赤酵母中的表达其融合蛋白。方法 :采用RT PCR从鼠肝脏中扩增mTLR 2全基因 ,并将其克隆到T载体中 ,测序验证。将目的基因编码序列插入毕赤酵母表达载体pPICZαC中 ,构建重组质粒 ,并转化毕赤酵母。重组酵母以PCR、RT PCR验证 ,表达的重组蛋白用SDS PAGE和Westernblot进行分析。结果 :克隆了mTLR 2全基因(AY179346 ) ,与已发表的mTLR 2基因的同源性为 99.84 %。构建了重组表达质粒pPICZ mTLR 2。SDS PAGE和Westernblot分析显示 ,在相对分子质量 (Mr)为约 970 0 0处出现 1条特异性蛋白带 ,且能与兔抗mTLR 2抗体发生反应。结论 :克隆了mTLR 2全基因 ,并在毕赤酵母中获得表达。     

人ZP3 186S突变蛋白在毕赤酵母X33细胞中的表达

目的:利用毕赤酵母表达人ZP3186S蛋白(23～348氨基酸),为临床相关疾病的诊断提供实验材料。方法:经PCR获得编码人ZP3(23～348氨基酸)的基因,构建表达载体pPICZα-hZP3。将ZP3186位点精氨酸突变为丝氨酸构建pPICZα-hZP3186S质粒。转染毕赤酵母X33细胞,用高浓度Zeocin筛选转染细胞,甲醇诱导目的蛋白分泌,通过SDS-PAGE和Western blot鉴定人ZP3186S蛋白。结果:pPICZα-hZP3186S表达质粒经测序正确,并在毕赤酵母X33中能够高效表达。结论:毕赤酵母能够分泌性表达重组人ZP3186S蛋白(23～348氨基酸),进一步研究其生物学活性为研制不孕症诊断试剂和免疫避孕疫苗提供实验材料。     

小鼠sIL-13Rα2在毕赤酵母菌中的表达及初步活性分析

目的:克隆并在毕赤酵母中表达小鼠sIL-13Rα2基因.方法:从小鼠脾脏细胞中提取总RNA,逆转录为cDNA,应用分段PCR的方法将sIL-13Rα2基因定向克隆至酵母表达质粒pPICZα-A,并转染至毕赤酵母菌表达系统进行目的蛋白表达.目的蛋白行SDS-PAGE和Western分析.结果:克隆出可溶性IL-13Rα2目的基因片段,构建重组pPICZα-A/sIL-13 Rα2表达载体,成功转染至毕氏酵母菌,诱导表达出可溶性IL-13Rα2目的蛋白.结论:已成功克隆并在毕赤酵母中表达了小鼠可溶性IL-13Rα2目的基因,为应用sIL-13Rα2蛋白治疗哮喘及其他过敏性疾病奠定了基础.     

融合基因EGFRi-IL-24真核表达载体的构建与表达

人工合成表皮生长因子受体干扰序列(epithelial growth factor receptor interference,EGFRi),应用重叠延伸PCR(Overlapping PCR)技术将其与白细胞介素-24(IL-24)连接,并在其间引入一段柔软短肽(Gly4Ser3)。进行序列分析后,将融合基因EGFRi-IL-24重组到表达质粒pPIC9k中,Sal I酶切线性化重组质粒EGFRi-IL-24/pPIC9k,电击转化毕赤酵母GS115,经G418抗性和PCR筛选得到阳性重组菌株。重组菌株用甲醇进行诱导表达后,通过SDS-PAGE和MTT法分析鉴定蛋白表达产物。结果证实EGFRi-IL-24在毕赤酵母中获得了分泌性表达的活性蛋白,为进一步研究其生物学功能及临床应用奠定了基础。     

人防御素-5基因的克隆和真核表达载体的构建

目的对人防御素5(HD-5)基因进行克隆,构建真核表达载体HD5-pPICZαA。方法从人cDNA文库中PCR扩增HD-5基因片段,用EcoRⅠ和XbaⅠ分别双酶切HD-5基因扩增产物和毕赤酵母表达载体pPICZαA,用T4DNA连接酶连接目的基因片段和pPICZαA,然后转化到E.coli Top10中,Zeocin筛选转化子并进行PCR、酶切和序列鉴定。结果提取阳性克隆的重组质粒,EcoR Ⅰ和Xba Ⅰ双酶切后跑电泳获得预期条带;同时重组质粒经序列测定,证实HD-5基因正确插入pPICZαA中,插入位置、方向均正确。结论成功构建人防御素5基因的真核表达载体HD5-pPICZαA,为HD-5蛋白的真核真核表达奠定基础。     

人Delta-like1ext-Fc融合蛋白毕赤酵母表达载体的构建及表达

目的:构建人Delta-like1ext-Fc融合蛋白毕赤酵母表达载体PIC-hDll1ext -Fc,并在毕赤酵母GS115中表达.方法:以pEF-BOSneo-hdll1ext-Fc为模板PCR扩增人Delta-like1胞外段.通过DNA重组构建毕赤酵母表达载体PIC-hDll1ext.-Fc.用MD平板筛选重组子,G418筛选高拷贝转化子,经甲醇诱导表达后,SDS-PAGE、Western blot分析表达蛋白.结果:hDll1基因的胞外段被有效地扩增.序列分析表明,所构建的含hDll1ext-Fc融合基因的质粒与设计相同,融合蛋白hDll1extFc得到正确表达.结论:成功地扩增了人Delta-likel胞外段,构建了hDll1ext-Fc融合基因的毕赤酵母表达载体PIC-hDll1extFc,并在毕赤酵母中正确表达,为进一步研究奠定了实验基础.     

人GPC3基因真核表达载体的构建及重组蛋白表达纯化

目的:人磷脂酰肌醇蛋白3是肝癌的诊断标志物和潜在治疗靶点。本研究目的在于获得足量的GPC3蛋白用于结构、功能及应用研究。方法:通过RT-PCR从人胎肝中克隆GPC3编码cDNA,利用Xho I和Xba I酶切位点,将GPC3ORF编码基因插入毕赤酵母表达载体pPICZ A中,构建真核表达质粒pPICZ A-GPC3。以该表达质粒转染毕赤酵母菌株GS115,在含有Zeocin的YPD平板上进行筛选。然后使用HRP标记的山羊抗人IgG在醋酸-硝酸纤维素双层膜上进行Dot blot筛选。对筛选获得的菌株进行诱导表达,表达上清经SDS-PAGE和Western blot检测。结果:筛选获得的阳性菌株诱导表达上清SDS-PAGE结果表明在预期位置观察到GPC3重组蛋白条带,且该蛋白条带与抗GPC3单克隆抗体(mAb)孵育后呈现特异性反应。工程菌株经高密度培养后,发酵上清中重组GPC3表达量约5 mg/L,进而通过阳离子交换层析从发酵上清中纯化了重组蛋白。结论:利用毕赤酵母表达并纯化了重组人GPC3蛋白,为进一步研究GPC3的结构和功能奠定了基础。     

鸡IL-18在毕赤酵母中的表达与活性分析

目的:在毕赤酵母中表达鸡白介素18,并鉴定其活性.方法:应用PCR技术从重组质粒pMD18-T-ChIL-18中扩增出鸡IL-18成熟肽基因,亚克隆于毕赤酵母表达载体pPICZαA上,构建重组质粒pPICZαA-ChIL-18.经酶切、PCR和测序鉴定正确后,电转化入毕赤酵母菌X-33,筛选多拷贝单克隆进行诱导表达.表达产物纯化后用Western blot、ELISA和淋巴细胞转化试验分析其生物学活性.结果:重组菌正确表达了具有免疫原性的鸡IL-18,经分析该rchIL-18具有诱导淋巴细胞分泌γ干扰素和刺激淋巴细胞增殖的活性.结论:成功的在毕赤酵母中表达了具有生物活性的鸡IL-18.     

pPICZα-LL37-Fcγ1重组质粒的构建及其在毕赤酵母GS115中的表达

目的:构建pPICZα-LL37-Fcγ1重组表达载体,实现LL37-Fcγ1重组融合蛋白在巴斯德毕赤酵母中的高效分泌表达,获得功能性抗菌蛋白。方法:通过合成LL37全基因,将其与人IgG1Fc(Fcγ1)基因相连后,插入到毕赤酵母菌表达载体pPICZα中。电转化毕赤酵母菌GS115后,经Zeocin抗性筛选阳性菌株。用RT-PCR和斑点杂交鉴定目的基因的表达。通过亲和层析法纯化目的蛋白,并以SDS-PAGE和Western blot进行鉴定。用BCA法测定目的蛋白的浓度,鲎试剂鉴定其中和内毒素的能力。结果:成功地构建了pPICZα-LL37-Fcγ1重组质粒,并证明目的基因已整合于毕赤酵母菌的基因组中。通过亲和层析获得具有结合蛋白A及中和内毒素能力的重组融合蛋白LL37-Fcγ1。结论:在毕赤酵母菌GS115中高效表达功能性的LL37-Fcγ1融合蛋白,为进一步研究奠定了基础。     

异亮氨酸拉链修饰的可溶性CD40L在巴斯德毕赤酵母中的表达

为了获得异亮氨酸拉链修饰的可溶性CD40L（IZ—sCD40L）在巴斯德毕赤酵母中的分泌表达。首先用PCR和重叠PCR的方法得到了IZ—sCD40L基因片段。然后构建了巴斯德毕赤酵母表达质粒pPICZaA—IZ—sCD40L．核酸测序分析表明IZ—sCD40L的基因片段正确克隆到pPICZaA质粒中。将其线性化后。电转化到巴斯德毕赤酵母GS115中，PCR筛选阳性重组菌株，经表型鉴定后，用甲醇进行诱导表达。经SDS—PAGE和Western blot印迹杂交结果证实了表达产物为重组IZ—sCD40L的融合蛋白。     

人补体受体1型SCR1-3功能域基因的克隆表达及生物活性鉴定

目的实现人补体受体1型功能域SCR1-3基因的克隆、表达及生物学活性鉴定。方法从人外周血中提取总RNA,通过逆转录获得cDNA,PCR扩增获得编码CR1-SCR1-3基因序列;克隆到毕赤酵母分泌表达质粒pPIC9K,构建重组质粒pPIC9K-CR1-SCR1-3,菌落PCR、双酶切鉴定后测序;线性化重组质粒电转化毕赤酵母KM71基因组中,经菌落PCR技术筛选在G418平板上生长的多拷贝阳性转化子;摇瓶发酵和甲醇诱导,SDS-PAGE和Western-blot鉴定目的蛋白表达;镍柱亲和层析纯化目的蛋白;用体外抑制补体溶血反应实验测定目的蛋白的生物活性。结果获得了人CR1-SCR1-3编码区序列,测序结果与与GenBank中的相应序列一致;SDS-PAGE和Western-blot表明目的基因在毕赤酵母中实现了分泌表达;体外实验证实经纯化后的CR1-SCR1-3能够明显抑制补体溶血。结论成功构建重组表达质粒pPIC9K-CR1-SCR1-3,在毕赤酵母中实现了CR1-SCR1-3的分泌表达,该蛋白具有较高的抑制补体生物活性。     

重组人sCR1真核表达载体的构建、表达及其生物学活性

目的:采用酵母细胞分泌型载体pPIC9k表达人可溶性补体受体(sCR1),研究重组人sCR1融合蛋白的体外生物学活性.方法:从人外周血中提取总RNA,应用RT-PCR获得人sCR1全长cDNA,然后将其克隆入毕赤酵母细胞分泌型表达载体pPICgk中,构建含人sCR1的重组质粒(pPIC9ksCR1),经测序鉴定正确,电转化入毕赤酵母细胞SMD1168中,将经G418抗性筛选出的重组sCR1酵母细胞株进行PCR鉴定,经甲醇诱导,表达产物经SDS-PAGE分析和Westernblot鉴定,通过Ni2 -NTA agarose亲和层析纯化后进行生物学活性鉴定.结果:获得毕赤酵母细胞分泌型表达载体pPIC9k-sCRI,经G418筛选及PCR鉴定得到高拷贝整合的重组酵母细胞株,经甲醇诱导含pPIC9k-sCR1的酵母SMD1168细胞表达出重组sCR1融合蛋白.此蛋白在SDS-PAGE上表现为Mr,约31 1300的蛋白区带,在Western blot分析中可被sCR1的CD35单克隆抗体(mAb)识别.经Ni2 -NTA agarose亲和层析纯化后得到较纯的sCR1融合蛋白及较高的生物学活性.结论:人sCR1融合蛋白在酵母细胞表达系统中的高水平表达,并且有与人体天然蛋白相同的抗原性及其生物学活性.     

乙型脑炎病毒E蛋白在巴斯德毕赤酵母中的表达

目的：用巴斯德毕赤酵母系统表达乙型脑炎病毒(JEV)E蛋白。方法：将JEV E蛋白基因亚克隆人真核表达载体pPIC9K，以电穿孔法转化酵母SMD1168。用MD平板筛选重组子、G418筛选高拷贝转化子，经甲醇诱导表达后，SDS—PAGE和免疫印迹分析表达产物。结果：由于糖基化不同，所表达产物的相对分子质量(Mr)约为113000和78000，表达量约为50mg/L。结论：在巴斯德比赤酵母中成功地表达了JEVE蛋白，为制备JEV的诊断抗原和基因工程重组疫苗打下基础。     

口蹄疫病毒 VP1 蛋白在酵母中的表达及免疫原性分析

目的 :利用毕赤酵母表达系统表达牛O型口蹄疫外壳蛋白(FMDVVP1) ,并对表达的蛋白进行免疫原性鉴定。方法 :将FMDVvp1基因克隆到毕赤酵母Pichiapastoris分泌性表达载体pSuperY中 ,构建重组表达载体pSuperY/vp1,经测序证明vp1基因序列的正确性。将纯化的重组质粒经线性化酶切后 ,用电转化法将pSuperY/vp1导入毕赤酵母菌种SMD116 8H中。对表达产物用SDS PAGE和Westernblot进行分析 ,并用酵母表达的FMDVVP1蛋白免疫小鼠。结果 :以重组质粒pSuperY/vp1转化毕赤酵母菌后 ,能表达相对分子量 (Mr)为 6 6 0 0 0和4 30 0 0的FMDVVP1蛋白。动物免疫结果表明 ,FMDVVP1蛋白能诱导小鼠产生特异性的体液和细胞免疫应答。结论 :在毕赤酵母中成功地表达FMDVVP1蛋白 ,为研制新型FMDVVP1的基因工程疫苗奠定了基础     

中国株HIV-1结构蛋白基因gag与gp120在巴斯德毕赤酵母中的融合表达

目的：将中国流行株B亚型HIV－1结构蛋白基因gag和gp120的巴斯德毕赤酵母中进行融合表达。方法：以酵母分泌型表达质粒pPIC9为载体，构建含HIV－1 gag和gp120嵌合基因的重组酵母表达质粒pPICGP。用Sac I将pPICGP线性化后，电转化巴斯德毕赤酵母GS115，用PCR的方法鉴定阳性酵母转化子。阳性转化子在巴斯德毕赤酵母中用甲醇进行诱导表达，表达产物以SDS－PAGE和Western blot进行分析，并对阳性菌株的遗传稳定性进行研究。结果：12个酵母转化子中共筛选到了8个阳性酵母转化子，其整合率为66．7％。SDS－PAGE和Western blot分析显示，在相对分子质量（Mr）为57000处有1条特异蛋白带，且能与抗p24单抗（mAb)和抗gp120mAb发生反应。酵母转化子在YPD培养基上传代10次后，其外源基因未丢失。结论：在巴斯德毕赤酵母中成功地表达了HIV－1 gag-gp120嵌合基因，且表达蛋白具有特异性，但其Mr较预计计算的值要小，说明嵌合基因中的gp120基因只有部分进行了表达。     

复合干扰素在毕赤酵母中的分泌表达、纯化及活性分析

目的 在毕赤酵母中高效分泌表达复合干扰素。方法 根据毕赤酵母密码子偏性合成了复合干扰素基因，克隆至分泌型酵母表达载体pMKX9K，线性化后转化毕赤酵母GS115，筛选高表达菌株。诱导后的培养上清经过离子交换，疏水层析，凝胶过滤三步层析纯化，用细胞病变抑制法测定其活性，并结合Iowry法蛋白定量计算其比活性。结果 SDS-PAGE分析显示，重组蛋白以可溶性分子的形式存在于上清液中，经纯化后纯度达到96％，其N端氨基酸序列与理论值一致，比活与干复津相当。结论 复合干扰素在毕赤酵母中获得高效分泌表达，为获得大量基因工程产品奠定了基础。     

人源性抗角蛋白单链抗体在巴氏毕赤酵母的分泌表达

目的：用巴氏毕赤酵母表达人源性抗角蛋白单链抗体。方法：从已构建好的质粒p3MH／ScFv中亚克隆目的片段ScFv并插入酵母表达载体p^PIC9K，构建成重组质粒p^PIC9K／ScFv，并测序鉴定。通过电转将重组质粒p^PIC9K／ScFv整合到巴氏毕赤酵母菌GS115的染色体上。经G418筛选得到高拷贝转化子及Mut表型鉴定后，用含0．5％甲醇的培养基诱导其分泌表达。结果：通过6天的诱导，该系统成功表达了抗角蛋白单链抗体，Western blot实验证实表达产物具有特异性。结论：获得了真核表达的抗角蛋白单链抗体，为其应用研究打下了基础。     

人免疫缺陷病毒Ⅱ型(HIV-2)gag蛋白基因在毕赤酵母中的克隆表达

目的：实现HIV-2HCOgag重组蛋白的分泌表达，为研究HIV—2HCO gag蛋白结构与功能及亚单位蛋白疫苗研究打下基础。方法：将HIV-2HCOgag蛋白基因片段，与分泌型毕赤酵母表达载体pPIC9重组，构建了相应的重组表达质粒pPIC9-gag，转化GS115酵母菌，经MD／MM表型筛选、PCR扩增筛选阳性克隆，以甲醇诱导表达后进行SDS-PAGE分析及Wgtem blot证实。结果：获得了HIV—2HCOgag重组蛋白在巴斯德毕赤酵母系统中的分泌表达，表达产物可被HIV—2抗血清识别，分子量约为57kD。结论：pPIC9—gag重组质粒在甲醇营养型酵母菌中可经甲醇诱导产生HIV—2HCOgag蛋白，该蛋白具有强免疫学活性。