Tat-LK15运载siRNA沉默RGC-5神经细胞nNOS基因的实验研究

目的探讨离体条件下细胞穿透肽Tat-LK15运载小干扰RNA(small interference RNA,siRNA)沉默RGC-5视神经节细胞(retinal ganglion cell line,RGC-5)神经元型一氧化氮合酶(neuronal nitric oxide synthase,n NOS)基因的可行性,为在体条件下研究Tat-LK15运载siRNA沉默n NOS表达治疗神经病理性疼痛提供理论依据。方法 1通过凝胶阻滞分析测定Tat-LK15与siRNA的最佳交联比。流式细胞术检测Tat-LK15/FAM-siRNA以最佳交联比转染RGC-5细胞的转染效率;不同剂量Tat-LK15(1、2.5、5、10和20μg)孵育RGC-5细胞24 h,流式细胞术检测细胞凋亡率。2制备n NOS高表达的RGC-5细胞模型。3将RGC-5细胞随机分为5组:对照组、模型组、Tat-S组(Tat-LK15运载n NOS/siRNA转染模型细胞)、Lipo-S组(LipofectamineTMRNAi MAX运载n NOS/siRNA转染模型细胞)及Tat-N组(Tat-LK15运载NCsiRNA转染模型细胞),通过Q-PCR及Western blot检测各组nN OS表达水平。结果 Tat-LK15与siRNA质量比为2∶1时可完全包裹siRNA,达到最佳交联,此时其转染效率为(84.4±3.9)%。当Tat-LK15剂量为20μg(6.1μmol·L-1)时才出现一定细胞毒性,细胞凋亡率高于对照组[(10.3±1.1)%vs(7.4±0.9)%,P<0.05]。造模后RGC-5细胞nN OS表达水平明显升高(P<0.05)。与模型组相比,Tat-S组nN OS mRNA及蛋白表达水平降低(P<0.05),Tat-S组与Lipo-S组相比无差异(P>0.05)。结论Tat-LK15能高效转染siRNA,细胞毒性低,离体条件下可有效运载siRNA沉默nN OS的基因表达。     

2006—102 多聚赖氨酸淀粉纳米颗粒基因载体的研制及应用

以可溶性淀粉为原料，利用反向微乳液法，加入交联剂三氯氧磷，制备了直径为50nm左右带负电荷的交联淀粉纳米颗粒。以该纳米颗粒为内核，经多聚赖氨酸修饰，得到了多聚赖氨酸淀粉纳米颗粒（PLI—StNP）。对PLI—StNP进行了颗粒粒度、稳定性和电性的表征，并通过颗粒的体外细胞毒性检测、颗粒与DNA结合能力及细胞转染等方面的分析，发现多聚赖氨酸淀粉纳米颗粒（PLL—StNP）有可能作为基因载体，在此基础上发展了多聚赖氨酸淀粉纳米颗粒基因载体的构建与基因转染技术。作为非病毒基因载体，赖氨酸淀粉纳米颗粒具有基因装载量大、转染率高、细胞毒性低以及可生物降解等优点。     

siRNA转染试剂的全面对比研究（英文）

siRNA已经成为生物研究的常用工具,也是目前最具潜力的下一代基因治疗药物。将siRNA成功转染进入细胞,仍然是限制siRNA广泛应用的关键技术,对于难转染细胞尤其如此。siRNA转染效率是摄取、细胞利用率及细胞毒性的综合作用结果,更高的转染效率通常需要高摄取、高细胞利用率和低细胞毒性。本研究旨在比较不同的转染试剂递送siRNA的摄取、siRNA敲低效率和毒性情况。新开发的CALNP RNAi转染试剂与传统转染试剂的摄取行为不同,转染效率显著高于传统转染试剂,同时毒性最低。CALNP RNAi转染试剂为难转染细胞的RNA干扰带来了新的选择。     

卵清蛋白壳聚糖纳米粒的制备及其体外性质

目的 制备包载卵清蛋白(OVA)的壳聚糖(CS)纳米粒,考察影响其粒径的因素并进行体外释放及细胞摄取效率的研究.方法 采用离子交联法,以三聚磷酸钠(TPP)为交联剂制备包载OVA的CS纳米粒,以粒径为考察指标,采用单因素实验法,对CS溶液浓度、pH、TPP浓度、CS与OVA质量比、CS与TPP质量比进行考察,确定最佳处...     

透明质酸键合分枝状聚乙烯亚胺作为siRNA载体的研究

目的构建以透明质酸为骨架材料键合分枝状聚乙烯亚胺(polyethylenimine,PEI,相对分子质量为25 000)的新型转siRNA载体,研究其对肿瘤细胞siRNA的转染。方法透明质酸(hyaluronicacid,HA)作为骨架材料,利用1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐[1-ethyl-3-(3-dimethyl-laminopropyl)carbodiimide hydrochloride,EDC.HCl]交联剂,与PEI嫁接,形成HA-PEI聚合载体材料。用核磁共振氢谱(1H-NMR)对载体材料进行化学表征,以确定其结构。用凝胶电泳阻滞实验观察HA-PEI与小干扰siRNA的结合能力,MTT法检测siRNA/PEI-HA复合体的细胞毒性,用原子力显微镜观察siRNA/PEI-HA复合体的大小。用B16F1细胞株进行基因沉默效率实验。结果质量分数为24%的PEI偶联到HA上,HA-PEI与siRNA在体积比为3∶1时可以完全缩合siRNA,其大小约20 nm,在相同浓度下HA-PEI的毒性低于PEI。体外转染实验显示,在含高血清条件下,siRNA/PEI-HA对B16F1细胞的基因沉默效率比PEI高。结论以透明质酸为骨架材料键合聚乙烯亚胺形成转基因载体是一种有潜在研究价值的新型靶向非病毒载体。     

结肠癌细胞株HT-29中针对Survivin基因的RNAi实验

目的：转染Survivin基因的siRNA对结肠癌HT-29细胞的影响。方法：设计2条针对Survivin基因CDS区不同位点的siRNA片段并构建shRNA表达载体,重组质粒使用阳离子脂质体法转染结肠癌细胞株HT-29。以空白质粒组作为阴性对照,Western blot法检测转染后Survivin基因的蛋白表达。结果：成功构建含有siRNA片段的shRNA重组质粒,转染HT-29细胞后,Survivin基因的蛋白含量明显下降。结论：构建Survivin基因的shRNA,脂质体瞬时转染结肠癌HT-29细胞,成功的沉默了Survivin基因。     

靶向Akt1小干扰RNA对人喉癌细胞增殖和凋亡的影响

目的：研究Akt1基因沉默对人喉癌细胞系（Hep-2）增殖和凋亡的影响。方法：设计并合成针对Akt1的特异性小干扰RNA（siRNA）序列,利用转染试剂转入体外培养人Hep-2细胞,48h后收集细胞,RT-PCR和Westernblot验证siRNA的沉默效应,MTT法检测细胞增殖活性、台盼蓝细胞染色法计数细胞存活率、AnnexinV/PI检测细胞凋亡和坏死。结果：设计的Akt1siRNA能够有效抑制体外培养Hep-2细胞内Akt1表达实现其基因沉默效应;Akt1siRNA干扰组Akt1mRNA转录和蛋白表达水平均低于空白和阴性对照组;Akt1siRNA干扰组细胞增殖活性下降,细胞存活率下降,Akt1siRNA干扰后细胞凋亡率和坏死率增加。结论：RNA干扰Akt1基因沉默具有抑制喉癌细胞增殖,促进细胞凋亡的作用,Akt1可作为喉癌基因治疗的后选新靶点。     

siRNA 靶向沉默 Lipocalin-2基因下调 MMP-9表达对降低人肺癌 A549细胞的侵袭、迁移能力的影响

目的：利用针对 Lipocalin-2的小干扰 RNA（siRNA）,观察 Lipocalin-2基因沉默对人肺癌 A549细胞MMP-9表达及侵袭、迁移能力的影响。方法采用 Real-time PCR 和 Western blot 检测 Lipocalin-2在3种肺癌细胞株（A549、NCI-H661、NCI-H446）及正常人支气管上皮细胞（HBE）的表达情况。设计并构建靶向 Lipocalin-2的 siRNA 转染 A549细胞,采用 Real-time PCR 和 Western blot 检测转染效率及 Lipocalin-2基因沉默对 MMP-9 mRNA 和蛋白表达的影响。Transwell 小室检测细胞侵袭能力。细胞划痕实验检测细胞迁移能力。结果 Lipocalin-2 mRNA 和蛋白在肺癌A549、NCI-H661、NCI-H446细胞株中的表达水平均显著高于 HBE 细胞,差异有统计学意义（ P ＜0.05）。siRNA-Li-pocalin-2转染组 Lipocalin-2 mRNA 和蛋白表达水平与阴性对照组和空载体对照组比较,差异有统计学意义（ P ＜0.05）;siRNA-Lipocalin-2转染组 MMP-9 mRNA 和蛋白表达水平与阴性对照组和空载体对照组比较,差异有统计学意义（ P ＜0.05）;siRNA-Lipocalin-2转染组穿膜细胞数、平均迁移距离与阴性对照组和空载体对照组比较,差异有统计学意义（ P ＜0.05）。结论 Lipocalin-2基因沉默通过下调 MMP-9表达降低了人肺癌 A549细胞的侵袭和迁移能力。     

共载阿霉素和siRNA的还原敏感型前药纳米粒的制备及体外评价

目的：构建共载阿霉素（DOX）和siRNA的还原敏感型前药纳米粒（PSCSD NPs）,并对其理化性质、细胞摄取和体外细胞毒性进行考察。方法：采用核磁共振氢谱（1H NMR）和傅里叶红外光谱（FT-IR）对羧甲基壳聚糖-二硫键-DOX(CMCSS-DOX)进行结构表征;超声法制备PSCSD NPs,考察其粒径、载药量、包封率、血清稳定性、溶血率和体外释药特性等;采用荧光显微镜和流式细胞术考察4T1细胞对PSCSD NPs的摄取;通过MTT实验测定PSCSD NPs的体外细胞毒性。结果：1H NMR和FT-IR结果表明CMC-SS-DOX成功合成;PSCSD NPs的粒径为（155.1±4.0） nm(PDI=0.144±0.028),Zeta电位为（–29.9±1.0） mV,载药量为（8.25±0.47）%,包封率为（78.41±4.52）%;透射电镜观察PSCSD NPs为球形,且具有良好的血液相容性和血清稳定性。PSCSD NPs具有还原响应释药特性,可在肿瘤部位快速释药。细胞摄取和MTT实验结果表明PSCSD NPs可以有效共载DOX和siRNA进入肿瘤细胞内以发挥抗肿瘤作用。...     

聚乙烯亚胺介导siRNA分子体内外基因沉默VEGFR2表达

应用阳离子聚合物聚乙烯亚胺(polyethyleneimine,PEI)包裹靶向小鼠VEGFR2基因的siRNA分子,以研究其体外基因沉默作用及不同给药途径的肿瘤生长抑制作用。采用共聚焦显微镜观察荧光染料CY3标记的siRNA分子的细胞内定位,RT-PCR和Western blotting检测VEGFR2mRNA和蛋白表达水平基因沉默效果,建立裸鼠皮下肿瘤模型比较经瘤内和尾静脉给予siVEGFR2/PEI抑制肿瘤生长的作用。共聚焦显微镜观察证实PEI能成功转染siRNA分子进入细胞质,siVEGFR2/PEI转染的MS1细胞中VEGFR2mRNA和蛋白表达水平明显下降,沉默效率分别为28.2%和23.6%。瘤内给与siVEGFR2/PEI组裸鼠肿瘤体积[(189.429±17.562)mm3]明显小于空白组[(365.844±20.713)mm3]和PEI静脉给药组[(315.507±20.491)mm3]。结果表明,PEI能有效介导siRNA分子转染进入细胞质并能特异性沉默靶基因的表达。未经组织靶向性修饰的PEI不具有肿瘤靶向作用,瘤内注射的抗肿瘤效应优于静脉给药途径,这为进一步研究PEI介导的siRNA分...     

RNA干扰致FRAT1基因沉默结肠癌HT29细胞模型的建立

目的 利用shRNA表达载体建立FRAT1基因沉默结肠癌HT29细胞模型.方法 将化学方法合成的特异性FRAT1基因siRNA,以人类结肠癌HT29细胞为实验对象,采用Lipofectamine将FRAT1基因的shRNA表达载体导入细胞后,用RT-PCR和Western blot检测目标基因FRAT1的表达水平.结果 稳定转染FRAT1 shRNA表达载体（pSINsi-FRAT1）后,FRAT1基因在mRNA和蛋白质表达水平分别下降92.63％、55.72％ （P＜0.05）.结论 成功地建立了FRAT1基因沉默HT29细胞模型,为研究FRAT1生物学功能打下坚实的实验基础.     

慢病毒介导的siRNA沉默结肠癌HCT116细胞中Slug基因表达的影响

目的探讨慢病毒载体介导RNA干扰(RNA interference,RNAi)慢病毒载体在结肠癌HCT116细胞中的沉默效应。方法构建Slug基因特异性siRNA慢病毒载体,感染结肠癌HCT116细胞,设立空白对照组、阴性对照组及Slug siRNA三组,应用qRT-PRC和Western blot方法分别从基因和蛋白水平检测各组干扰质粒对Slug基因的干扰效果。结果转染Slug siRNA后,结肠癌HCT116细胞中Slug基因mRNA和蛋白表达明显受到抑制(P<0.05)。结论 Slug siRNA能明显沉默靶基因Slug的表达,并且可能成为潜在治疗肿瘤的新靶点。     

沉默PTTG1基因对弥漫大B淋巴瘤细胞增殖和凋亡的影响

目的 探讨小干扰RNA(siRNA)靶向沉默PTTG1基因对弥漫大B淋巴瘤细胞株OCI-LY-19增殖和凋亡的影响。方法 实验分3组：siRNA-PTTG1组细胞分别转染siPTTG1-415和siPTTG1-686,siNC组细胞转染阴性siRNA,空白组细胞不转染。采用qRT-PCR和Western blotting法检测m RNA和蛋白质水平并评估PTTG1沉默效率,CCK-8法检测细胞增殖活力,Annexin V-FITC/PI双染流式细胞术检测细胞凋亡率。结果 siPTTG1-415和siPTTG1-686组OCI-LY-19细胞中PTTG1mRNA和蛋白表达水平与空白组和siNC组相比较明显降低（P<0.05）,细胞增殖活力下降（P<0.05）,细胞凋亡率增加（P<0.05）。结论 siRNA能靶向沉默弥漫大B淋巴瘤细胞PTTG1基因的表达,并抑制细胞增殖,促进凋亡。     

RAR β沉默对4-氨基-2-三氟甲基苯基维甲酸酯抗SGC-7901细胞增殖作用的影响

目的制备并筛选有效沉默SGC-7901细胞维甲酸受体β(RARβ)基因的最佳siRNA序列,观察RARβ靶向沉默对4-氨基-2-三氟甲基苯基维甲酸酯(ATPR)抑制SGC-7901细胞增殖作用的影响。方法针对人RARβ全序列设计合成3条siRNA,以lipofectamine 2000(Lipo)为载体转染至SGC-7901细胞。转染后24、48 h应用RT-PCR和Western blot技术分别检测SGC-7901细胞内RARβ的mRNA和蛋白表达。选用最佳siRNA序列靶向沉默SGC-7901细胞RARβ后6 h加入AT-PR(终浓度为10-5mol.L-1),72 h后MTT法检测细胞增殖,流式细胞仪测定细胞周期动力学,分光光度法检测细胞裂解液中碱性磷酸酶(ALP)和乳酸脱氢酶(LDH)活力的变化。结果靶向沉默SGC-7901细胞中RARβ基因的最佳序列为siRNA-RARβ-homo-466且在浓度为100 pm.L-1、与Lipo的比例为1∶0.05时沉默效果最佳。与未沉默的ATPR给药组比较,RARβ-homo-466序列转染沉默后ATPR(10-5mol.L-1)给药组SGC-7901细胞增殖活性升高,G0/G1期细胞减少,S期细胞增多(P0.01),ALP和LDH活力显著增强(P0.05)。结论 siRNA-RARβ-homo-466可有效沉默RARβ基因的表达;RARβ沉默后,对ATPR敏感的SGC-7901细胞表现出ATPR抗性,提示RARβ可能是介导ATPR作用于SGC-7901细胞的主要环节。     

壳聚糖衍生物作为siRNA纳米递送系统材料的研究进展

小干扰RNA(small interfering RNA,siRNA)在治疗疾病方面具有高效性、特异性、瞬时性等优良特性,是目前药物研发关注的焦点。但裸露的siRNA稳定性差、细胞摄取率低,难以发挥其基因沉默作用,因此需要一种优质的递送系统将其递送至靶细胞中,使其发挥作用。大部分纳米递送系统因毒性、载药问题不利于siRNA的转运,而壳聚糖衍生物具有较高的水溶性、安全性、稳定性,已受到广泛关注。本文综述了壳聚糖衍生物应用于siRNA纳米递送系统的研究进展,为正在进行纳米递送系统研究的科研工作者提供参考。     

纳米粒载体传输Bcl-xl siRNA的抗肿瘤活性的研究

目的:制备纳米粒载体DMP,对其进行表征的测定,研究DMP介导的Bcl-xl siRNA的抗肿瘤活性。方法:采用MTT法对纳米粒的细胞毒性进行测定;通过Q-PCR法检测mRNA的含量,检测DMP递送Bcl-xlsiRNA入C26细胞的基因沉默效果;通过MTT法研究DMP/si RNA对C26细胞的抗肿瘤效果,测定其对C26细胞的肿瘤抑制作用;用克隆形成实验进一步证明DMP/siRNA能够抑制C26细胞生长,具有显著的抗肿瘤活性;采用碘化丙啶(PI)染色法流式细胞术来分析经过DMP/siBcl-xl治疗的C26细胞的凋亡率。结果:纳米粒具有良好的粒径和电位以及较低的细胞毒性,其IC50为3.7μg﹒mL~(-1)。Q-PCR结果显示DMP/siBcl-xl有效地降低了Bcl-xl信使RNA的水平;MTT结果显示DMP/siBcl-xl(50 n M和100 n M)的生存率分别为69.6%±3.3%,56.3%±1.9%,低于DMP组;克隆形成实验表明DMP/siBcl-xl能够抑制C26细胞的增殖,具有显著的抗肿瘤活性;凋亡实验结果显示DMP/siBcl-xl的细胞凋亡率为33.0%±3.8%,与对照组、DMP组、DMP/Scramble siRNA组比较,细胞凋亡率显著地增加了。结论:纳米粒DMP具有良好的粒径和电位,并且具有较低的细胞毒性。DMP/siBcl-xl能够沉默Bcl-xl基因,引发C26细胞的凋亡,进一步实现抑制C26细胞生长的治疗作用。实验表明纳米粒DMP能够作为有效的载体递送siRNA用于结肠癌的治疗。     

微小RNA传递载体聚乙二醇-b-聚赖氨酸的合成及细胞毒性研究

目的制备微小RNA（miRNA）传递载体聚乙二醇-b-聚赖氨酸（PEG-b-PLL）,并且选用模型细胞对其进行毒性考察。方法通过核磁谱测定聚赖氨酸的聚合度,用4%琼脂糖凝胶电泳检测聚复合物对miRNA的包封,用动态光散射法测定制备所得聚复合物粒径、多分散性指数（PDI）,Zeta电位,用荧光标记的FAM-hsa-miR-15a进行包封率的测定,采用CKK-8试剂盒测定K562细胞（人慢性淋巴白血病细胞）活力考察PEG-b-PLL的细胞毒性。结果用PEG-b-PLL制备的聚阳离子胶束/miRNA复合物特性符合应用要求,并且细胞毒性显著低于聚乙烯亚胺（PEI）,lipo2000。结论离子聚合物载体PEG-bPLL符合应用要求,同时毒性较低,有望成为基因转染的有效载体。     

藻酸盐/PEI/DNA复合载体作为一种新型基因递送系统

目的克服多聚乙烯亚胺(PEI，polyethlenimine)/DNA载体对细胞的毒性以及在含血清培养基里对癌细胞基因的转移率低的问题。方法利用具有水溶性、可生物降解的、并带有负电的藻酸盐(alginate)对PEI/DNA载体进行包衣，制备出复合载体，并在体外含50%血清培养基里，与PEI/DNA载体比较对C3癌细胞转染率。结果 在含50%血清的培养基里，藻酸盐包衣制备的复合体载体［alginate:DNA，0.15 (w/w);PEI:DNA，N:P=10］与PEI/DNA载体相比，对C3癌细胞基因转染率高出10～30倍，而且其表面正电荷数比PEI/DNA载体减少了一半，颗粒较小，并降低对细胞毒性和红血球集聚反应。结论作为新型的藻酸盐包衣制备的复合载体能提高在体外含高浓度血清培养基里对C3癌细胞的转染率，并能减少其对细胞毒性。     

siRNA沉默DNA聚合酶β基因表达对食管癌EC9706细胞放疗敏感性的影响

目的探讨siRNA沉默DNA聚合酶β（polβ）基因表达对食管癌EC9706细胞放疗敏感性的影响。方法利用脂质体将siRNA转染至EC9706细胞,采用实时荧光定量PCR检测3组不同转染的细胞中polβ mRNA的表达变化;不同剂量（0、2、4、6、8 Gy）照射3组细胞,CCK8方法检测各组细胞的存活率;用3 Gy照射,流式细胞术检测每组细胞的凋亡率。结果转染沉默polβ组polβ基因表达水平显著降低（P〈0.01）;CCK8检测结果显示,随着照射剂量的增加,细胞存活率呈下降趋势,其中沉默polβ组细胞存活率显著低于两个对照（P〈0.05）;沉默polβ组细胞凋亡率显著高于无关siRNA组或空白对照组（P〈0.01）,照射后沉默polβ组细胞的凋亡率增加量显著高于无关siRNA组和空白对照组（P〈0.01）。结论沉默食管癌细胞polβ基因表达可增加其对放疗的敏感性。     

ZHX3 基因沉默对BMSCs 中成骨相关因子表达的影响

目的探讨锌指蛋白和同源框3（ZHX3）基因沉默对骨髓间充质干细胞（BMSCs）中smad3、smad4、RUNX2 表达的影响。方法构建ZHX3 低表达慢病毒载体并转染大鼠BMSCs（ZHX3 沉默组）,同时设空载病毒转染BMSCs （载体对照组）及不做任何处理的BMSCs（空白对照组）。荧光显微镜下测定细胞转染率并采用免疫印迹技术鉴定转染是否成功;采用免疫荧光化学和免疫印迹技术定性定量检测ZHX3 沉默时smad3、smad4、RUNX2 表达情况。结果（1）复苏培养的细胞具有BMSCs 表型。（2）转染后,ZHX3 沉默组和载体对照组均表达绿色荧光,空白对照组不表达荧光,且沉默组ZHX3 基因表达显著低于载体对照组。（3）免疫荧光结果显示,smad3、smad4 的阳性表达位于细胞核和细胞质,RUNX2 的阳性表达主要定位于细胞核。3 组细胞均可见阳性表达细胞,且空白对照组与载体对照组之间荧光强度未见显著差异,但ZHX3 基因沉默组的荧光强度显著低于2 个对照组。（4）免疫印迹检测smad3、 smad4、RUNX2 的条带于空白对照组和载体对照组中无显著差异,但均显著高于ZHX3 沉默组（P＜0.05）。结论 ZHX3 基因沉默后BMSCs 体外成骨能力延迟,可能通过下调smad3、smad4、RUNX2 来发挥作用。