新城疫病毒HN基因对肝癌细胞SMMC7721的细胞毒性研究

目的:探讨新城疫病毒HN基因对肝癌细胞SMNC7721的杀伤作用及其机制.方法:以脂质体介导方法在体外转染含新城疫病毒HN基因的质粒pVHN于细胞SMMC7721 24 h后,采用MTT法检测细胞活性;3,5-二羟基甲苯测定其唾液酸含量的变化;丫啶橙/溴化乙锭(AO/EB)染色,荧光显微镜观察细胞形态学改变;以及FCM检测病毒HN基因和HLA-A,B,C的表达.结果:体外转染pVHN能显著地降低细胞表面唾液酸含量(P＜0.05),有效地杀伤肿瘤细胞SMMC7721;荧光显微镜观察可见典型的细胞死亡形态学改变;实验组细胞与对照组比较HN表达差异显著,HLA-A,B,C表达上调.结论:HN基因在体外能够显著降低肿瘤细胞表面唾液酸含量,同时,使其高表达HN抗原,上调HLA-A,B,C表达,从而,可能增强了肿瘤细胞的抗原性和免疫识别,诱导了细胞SMMC7721死亡.     

表达新城疫病毒HN基因重组鸡痘病毒的构建及其抑瘤作用

目的〖HT5”SS〗： 构建表达新城疫病毒（newcastle disease virus, NDV）HN基因的重组鸡痘病毒vFVHN,探讨vFVHN对体外培养人肝癌细胞 SMMC7721的抑制作用和对小鼠荷肝癌模型的体内抑瘤效果。〖HT5W〗方法〖HT5"SS〗： 以野生型鸡痘病毒（fowl poxvirus, FPV）282 E4株为载体,构建表达新城疫病毒HN基因的重组鸡痘病毒vFVHN。采用5溴2脱氧尿苷（5bromo2deoxyribouridine,BrdU）加压法筛选重组体,并通过RTPCR和Western blot等方法对其进行鉴定。采用噻唑蓝（methylthiazoletetrazolium,MTT）染色法检测vFVHN对人肝癌细胞SMMC7721的杀伤率,并通过检测抑瘤率观察其在C57BL/6小鼠荷肝癌模型的抑瘤效果。〖HT5W〗结果〖HT5"SS〗： 成功构建重组鸡痘病毒vFVHN,其对SMMC7721细胞的杀伤率为43.37%,对C57BL/6小鼠肝癌模型的抑瘤率为20.65%。〖HT5W〗结论〖HT5"SS〗： 重组鸡痘病毒vFVHN可有效杀伤体外培养的人肝癌细胞SMMC7721,并对C57BL/6小鼠荷肝癌模型体内的实体肿瘤有一定抑制作用。     

艰难梭菌A毒素诱导SMMC7721细胞和Vero细胞凋亡的比较研究

背景与目的:艰难梭菌是假膜性大肠炎及抗生素诱发性腹泻的主要致病菌之一,它产生的毒素具有不同的生物学活性.本实验拟研究艰难梭菌 A毒素诱导人肝癌细胞株( SMMC7721)和非洲绿猴肾细胞( Vero细胞)凋亡的作用. 方法:由脑心浸液对艰难梭菌 VPI 10463菌株培养产毒 , 经甲状腺球蛋白亲合层析和 Q Sephrose层析提纯得到精制 A毒素.对 SMMC7721细胞的研究以 Vero细胞为对照.抑制细胞增殖的检测采用 MTT法;用荧光显微镜、电子显微镜、流式细胞仪观察细胞形态和细胞周期的改变;采用琼脂糖凝胶电泳法观测 DNA碎片.结果:不同浓度 A毒素 (0.293～ 4.690 mg@ L- 1)明显抑制了 SMMC7721及 Vero细胞的增殖,并且呈时间和浓度依赖性;两种细胞与 A毒素共同培养 48 h,荧光显微镜和透射电镜都观察到典型的凋亡形态变化; SMMC7721细胞与 A毒素共同培养 48 h后,琼脂糖凝胶电泳显示梯形条带.结论: A毒素明显诱导了两种细胞的凋亡 ; A毒素对 SMMC7721细胞具有更强的诱导凋亡作用.     

新城疫病毒HN基因构建的核酸疫苗抗肿瘤作用研究

目的 :探讨HN基因在NDV抗肿瘤上发挥的作用。方法 :以pVAX1为表达载体构建了含NDVHN基因的pVHN核酸疫苗 ,以脂质体介导方法在体外转染OS732细胞 72h后 ,用 3,5 二羟基甲苯法测定OS732细胞膜唾液酸含量的变化。 6周龄BALB/c鼠左后肢皮下接种 2× 10 6个S180肿瘤细胞 ,分别于肿瘤接种后的第 7天 (肿瘤直径为 2～ 3mm)和第 17天瘤内注射 10 0 μg核酸重组体 ,同时设pVAX1对照组和单纯荷瘤对照组。荷瘤鼠经治疗后框窦采血 ,分离血清 ,测定血清唾液酸含量。取脾 ,采用FACS方法测定淋巴细胞亚群数量的变化。结果 :pVHN体外转染OS732细胞后 ,能显著降低细胞表面唾液酸含量 (P <0 .0 5 )。pVHN应用于荷瘤鼠显著降低血清中唾液酸含量 (P <0 .0 5 ) ,引起CD8+ T淋巴细胞亚群数量的增加 (P <0 0 5 )。结论 :单独HN基因在体外转染能够降低肿瘤细胞表面唾液酸含量 ,体内表达后引起T淋巴细胞亚群数量改变。     

过表达PRRX1 通过p53 介导的线粒体凋亡途径诱导肝癌SMMC7721 细胞凋亡

[摘要] 目的：探讨配对相关同源框1 蛋白（PRRX1）过表达对肝癌SMMC7721 细胞凋亡的影响及其分子机制。方法：分别用慢病毒介导PRRX1 过表达载体（pGMLV-PRRX1）、空载质粒（Vector）感染人肝癌SMMC7721 细胞,用qPCR和WB实验检测慢病毒感染后细胞中PRRX1 mRNA和蛋白的表达变化,用CCK-8 法、Annexin-V FITC/PI 染色流式细胞术分别检测PRRX1 过表达对SMMC7721 细胞增殖、凋亡的影响,用线粒体膜电位检测试剂盒（JC-10 染色法）检测细胞线粒体膜电位变化,用caspase 活性检测试剂盒（分光光度法）测定细胞中caspase-8 和caspase-9 酶活性,用WB实验检测细胞中p53、Bcl-2、Bax、Fas、Cleaved-caspase-3以及线粒体和细胞质中细胞色素C（Cty C）蛋白的表达。结果：成功构建PRRX1 过表达的SMMC7721 细胞株,感染细胞中PRRX1 mRNA和蛋白的表达水平显著升高（均P<0.01）。与对照组和空载组比较,PRRX1 过表达组SMMC7721 细胞的增殖能力显著下降、细胞凋亡率显著增高、Cleaved-caspase-3 剪切水平显著升高、线粒体膜电位显著下降、线粒体中Cty C蛋白表达下调、胞质中Cty C蛋白表达上调以及caspase-9 酶活性升高（P<0.05 或P<0.01）,同时p53 和Bax 蛋白表达增加而Bcl-2 蛋白表达降低（均P<0.05）,但Fas 蛋白表达及caspase-8 酶活性无显著变化（均P>0.05）。结论: PRRX1 过表达可诱导肝癌SMMC7721 细胞凋亡,其机制可能与p53介导的线粒体凋亡途径被激活有关。     

人TNFα基因转染的人肝癌细胞稳定高表达细胞克隆SMMC7721-TNF的建立及其部分生物学特性的初步观察

用重组逆转录病毒载体L-tnfSN的包装病毒颗粒感染人肝癌细胞SMMC7721，G418筛选后，随机挑选10个细胞克隆，扩大培养，检测细胞培养液上清中TNFα的水平，将其中表达TNF最高细胞克隆命名为SMMC7721-TNF。观察SMMC7721-TNF的分子生物学特性。Southern Blot证明TNFα基因完整地整合在细胞基因组中，     

NF—кB信号传导途径对TNF—α诱导的SMMC—7721细胞凋亡的影响

背景与目的：已证明核因子кB（nuclear factor-кB,NF-кB)在免疫细胞激活,抗病毒,多种应激反应和细胞凋亡的调控等许多方面起着重要作用。本实验研究NF-кB信号传导途径对TNF-α诱导的肝癌细胞株SMMC-7721细胞凋亡的影响。方法：采用ELISA和免疫组化检测TNF-α对NF-к信号传导通路的激活作用,继而用TPCK（n-tosyl-Phe-chloromethylketone)阻断NF-кB的活化,流式细胞仪检测细胞凋亡。结果：（1）TNF-α能激活NF-кB信号传导通路;（2）TPCK能抑制TNF-α诱导的NF-кB活化;（3）TPCK抑制NF-кB活化后,能加强TNF-α诱导的细胞凋亡,结论：SMMC-7721细胞中NF-кB细胞传导途径参与了细胞的抗凋亡过程,在SMMC-7721细胞对TNF-α的细胞毒性作用耐受中起重要作用,抑制NF-кB信号传导途径可能在肿瘤治疗中有潜在的应用价值。     

基因HC56对人肝癌细胞（SMMC7721）基因表达水平的影响

目的：观测新发现的HC56基因对培养的人肝癌细胞SMMC－7721基因表达的影响。方法：用含HC56cDNA的重组表达载体转染SMMC－7721细胞后,由细胞总RNA反转录为cDNA,与Atlas人类cDNA表达方阵膜片杂交,通过molecular image system分析软件对暴光强度进行密度扫描定量（以看家基因β-actin对照校正）。结果：HC56转染的肝癌7721细胞有3个基因（C-myc,CAMP dependent protein kinasetypel bata regulatory subunit ,β,thymosin β-10)表达上调,3个基因（Glutathione perotidase,fos-related antigen-2,zinc finger protein 1)表达下调。结论;HC56基因转染对体外培养的肝癌细胞的基因表达有着不同的影响。本文为进一步研究HC56基因的功能提供了线索。     

可溶性肿瘤坏死因子相关凋亡诱导配体诱导肝癌细胞凋亡的研究

方法 采用原位杂交方法检测肝癌组织、肝癌细胞株以及正常肝组织中TRAILR的表达。采用不同浓度TRAIL蛋白处理肝癌细胞株Hep2和SMMC7721,应用流式细胞仪和原位末端标记,观察经药物处理前后该细胞株的凋亡发生率。结果 60例肝癌组织及20例正常肝组织均表达死亡受体DR5和DR4,但肝癌组织DR表达量显著强于正常肝组织。54例(90．0％)肝癌组织不表达诱捕受体DcR1,25例(41．7％)肝癌组织不表达DcR2,而20例正常肝组织均表达DcR。肝癌组织中DR的高表达及DcR的低表达,不同于正常肝组织中DR的低表达及DcR的高表达,两者间差异有显著性。两种肝癌细胞株中均可检测到DR5、DR4、DcR2的表达,但DcR1表达缺失。肝癌组织中DR的表达与肿瘤的分化、肿瘤分期有关,低分化的肿瘤DR表达减少(P＜0．01),Ⅲ、Ⅳ期肿瘤DR表达显著低于I、Ⅱ期(P＜0．05)。DR表达与患者的性别、年龄、HBsAg阳性与否、AFP水平、肿瘤大小以及是否转移无关。经TRAIL(100ng/ml)处理24h,肝癌细胞凋亡发生率约10％,而Jurkat细胞凋亡率达70％以上,胆管癌细胞QBC939凋亡发生率约50％。结论 肝细胞肝癌普遍存在TRAILR的表达,并存在受体类型的表达差异。但单一的TRAIL治疗只能有限的诱导肝癌细胞HepG2、SMMC7721发生凋亡,HCC对TRAIL诱导的凋亡存在耐药现象。     

黄芩素诱导人肝癌细胞株SMMC-7721凋亡作用的研究

目的:研究12-脂氧合酶(12-lipoxygenase,12-LOX)在人肝癌细胞株SMMC-7721中的表达,以及选择性12-LOX抑制剂黄芩素对人肝癌细胞SMMC-7721生长、凋亡的影响.方法:采用免疫细胞化学染色及RT-PCR检测12-LOX的蛋白质和mRNA在SMMC-7721中的表达.应用MTT、流式细胞术及TUNEL检测细胞生长及凋亡.蛋白印迹法检测分析Caspase-3,Bcl-2,Bax,phospho-ERK1/2,ERK1/2和β-actin蛋白质的表达.结果:免疫细胞化学技术显示12-LOX蛋白表达于SMMC-7721细胞质.RT-PCR检测到黄芩素呈浓度-时间依赖性地抑制12-LOX mRNA表达.采用黄芩素小同浓度或不同时间段干预细胞SMMC-7721,MTT法检测细胞增殖呈剂量、时问依赖性的下降.原位末端转移酶标记技术及流式细胞仪分析证实12-LOX抑制剂诱导细胞凋亡.蛋白印迹法检测显示,黄芩素干预后,Bcl-2蛋白表达明显下降和Bax蛋白轻微上升,细胞凋亡蛋白酶-3活性水平与黄芩素浓度正相关,黄芩素对细胞凋亡相关蛋白的影响被12 (S)-HETE逆转,12(5)-HETE可能激活ERK1/2磷酸化.结论:人肝癌细胞株SMMC-7721存在12-LOX的表达,12-LOX抑制剂黄芩素可抑制细胞生长和诱导细胞凋亡.     

奥沙利铂对人肝癌细胞的放射增敏作用

目的：研究奥沙利铂（Ｌ-ＯＨＰ）对人肝癌ＳＭＭＣ-７７２１细胞的放射增敏作用。方法：实验分为单纯用药组及放疗＋药物组，采用ＭＴＴ法观察Ｌ-ＯＨＰ不同药物浓度与不同外放射剂量２４、４８、７２ｈ对人肝癌细胞ＳＭＭＣ-７７２１的抑制作用。计算细胞抑制率和增敏比，应用统计软件ＳＰＳＳ１１.５处理数据，运用方差分析和多元相关方法分析各因素对人肝癌细胞ＳＭＭＣ-７７２１的抑制作用以及各因素之间的交互作用。结果：生长抑制率与放疗剂量、Ｌ-ＯＨＰ浓度呈正相关，而时间因素与生长抑制率无相关性（Ｐ＞０.０５）。结论：在采用Ｌ-ＯＨＰ对肝癌进行放射增敏时，时间因素可忽略不计。当Ｌ ＯＨＰ浓度大于０.６２５ｍｇ／Ｌ，将可获得放疗增敏的效果。     

Survivin与Caspase-3在光动力诱导肝癌细胞SMMC-7721凋亡中的作用

目的：探讨Survivin与Caspase-3在血卟啉化衍生物（hematoporphyrin derivative,HPD）光动力作用（photodynamic therapy,PDT）诱导人肝癌细胞SMMC-7721凋亡中作用。方法：应用流式细胞术检测光动力作用后细胞凋亡率。用免疫组化法检测细胞内Survivin及Caspase-3蛋白表达情况,并用RT—PCR检测其基因水平。结果：血卟啉衍生物光动力组人肝癌细胞SMMC-7721凋亡率达（33．42±5．52）％,与对照组相比,差异有显著意义（P〈0．05）;光动力作用后Survivin的蛋白表达及基因水平显著低于对照组（P〈0．05）,而Caspase-3却显著高于对照组（P〈0．05）。结论：血卟啉衍生物光动力作用具有诱导人肝癌细胞SMMC7721凋亡的生物学效应,其作用机制可能与光动力作用抑制凋亡调控蛋白Survivin表达,并且直接或间接促进Caspase-3的表达,从而促进细胞凋亡。     

Curcumin induces apoptosis involving bax/bcl-2 in human hepatoma SMMC-7721 cells

Curcumin is a major active component of Curcuma aromatica salisb, which has been shown to inhibit proliferation of a wide variety of tumor cells. In this study, the molecular mechanisms of curcumin inducing apoptosis in human hepatoma SMMC-7721 cells were examined. We find that curcumin inhibits the growth of SMMC-7721 cells significantly in a concentration-depenent manner, with typical apoptotic morphological changes of cellular nuclei. Annexin-V/PI double staining detected by flow cytometry and expression of the relative apoptotic proteins (Bax, Bcl-2 and caspase-3) revealed a strong apoptosis-inducing competent of curcumin in SMMC-7721 cells. Curcumin increased the expression of bax protein while decreasing that of bc1-2 protein significantly. The results suggest that curcumin induction of apoptosis involves modulation of bax/bcl-2 in SMMC-7721 cells and provide a molecular basis for the development of naturally compounds as novel anticancer agents for human hepatomas.     

联合应用新城疫病毒及其 HN基因对小鼠黑色素瘤抑制效应的研究

背景与目的:尽管新城疫病毒( Newcastle disease virus, NDV)对多种肿瘤具有抑制作用 ,但其抑瘤机制尚不完全清楚.以前的研究结果表明,该病毒的血凝素神经氨酸酶( hemagglutinin-neuraminidase,HN)基因在该病毒的抗肿瘤作用上发挥重要作用且 HN蛋白表达后能够定位于肿瘤细胞膜上,以 HN蛋白作为肿瘤细胞的外源抗原来研究其抑瘤作用尚未见报道.本研究拟探讨 HN蛋白作为外源抗原在新城疫病毒抗肿瘤的作用以及二者联合应用对小鼠黑色素瘤的抑制效应.方法:在 C57BL/6小鼠右后肢皮下接种 B16黑色素瘤细胞 2× 105个.荷瘤第 2天,左后肢肌肉注射含新城疫病毒 HN基因的重组质粒,荷瘤第 7天,瘤内注射新城疫病毒 2× 109pfu;同时设单独 HN基因或 NDV治疗组及注射 PBS的对照组.通过抑瘤率观察动物体内的抑瘤效果;通过特异性细胞毒 T淋巴细胞( cytotoxic T lymphocyte,CTL)实验, ICAM Ⅰ、 CD48及新城疫病毒 HN蛋白在肿瘤细胞表面表达检测,探讨 HN蛋白所介导的抑瘤作用.结果:联合应用新城疫病毒及该病毒 HN基因对肿瘤的抑制效果明显好于单独 HN基因及新城疫病毒,抑瘤率达 82.8%,特异性 CTL反应增强,对靶细胞的杀伤率为 18.4%;单独 HN基因及新城疫病毒治疗组的抑瘤率分别为 56.6%、 41.0%,特异性 CTL活性分别为 4.4%、 10.1%;瘤内注射 NDV的肿瘤细胞表面检测到 HN分子的表达, ICAM Ⅰ、 CD48分子表达上调.结论:定位于肿瘤细胞表面的 HN蛋白介导机体对肿瘤细胞的特异性杀伤,联合应用新城疫病毒及该病毒 HN基因显著增强了机体对肿瘤细胞的杀伤效应.     

过表达CHD5基因对肝癌细胞SMMC-7721生物学行为的影响

目的:探讨过表达CHD5基因对人肝癌细胞SMMC-7721生物学行为的影响。方法:采用脂质体法将CHD5过表达质粒及对照质粒分别转染SMMC-7721细胞,Western blotting检测SMMC-7721细胞中CHD5蛋白的表达情况,CCK-8法检测SMMC-7721细胞生长增殖能力的变化,流式细胞仪检测细胞凋亡,Transwell实验检测细胞迁移和侵袭能力的变化。结果:转染CHD5过表达质粒后,SMMC-7721细胞CHD5蛋白表达水平显著增高（P<0.01）,抑制了细胞增殖、迁移和侵袭（P<0.05）,促进了细胞凋亡（P<0.05）。结论:过表达CHD5基因可抑制SMMC-7721细胞的增殖、迁移和侵袭并诱导其凋亡。     

沙利度胺对人肝癌细胞株SMMC-7721体外生长的抑制作用

目的 研究沙利度胺对人肝癌细胞株SMMC-7721体外生长的抑制作用及其可能的机制.方法 将不同浓度的沙利度胺作用于人肝癌细胞株SMMC-7721,采用四甲摹偶氮唑蓝(MTT)法检测沙利度胺对SMMC-7721细胞的增殖抑制作用.将SMMC-7721细胞培养至对数生长期,采用DNA琼脂糖凝胶电泳、荧光显微镜观察、流式细胞仪检测等方法 观察沙利度胺处理后SMMC-7721细胞的凋亡梯度、形态学变化和凋亡率,并对凋亡调控蛋白caspase-3的表达进行测定.采用酶联免疫吸附(ELISA)法测定不同浓度的沙利度胺处理后SMMC-7721细胞表达血管内皮生长因子(VEGF)的变化.结果 沙利度胺的浓度从3.125μg/ml增至200μg/ml时,其对SMMC-7721细胞的增殖抑制率从11.7%增至34.2%;当沙利度胺的浓度>25 μg/ml时,其对SMMC-7721细胞的增殖抑制作用明显强于空白对照组(P<0.05).200 μg/ml的沙利度胺处理SMMC-7721细胞24 h后,行琼脂糖凝胶电泳,可见到DNA梯形条带;48 h后梯形条带更明显,并且在荧光显微镜下可见SMMC-7721细胞出现核固缩和核裂解现象.200μg/ml的沙利度胺处理SMMC-7721细胞12、24、48和72 h时,碘化丙啶(PI)法检测SMMC-7721细胞的凋亡率分别为3.1%±0.5%、8.4%±1.3%、19.4%±3.5%和25.8%±2.1%,24 h起的凋亡率均明显高于空白对照组SMMC-7721细胞48 h的自然凋亡率(1.6%±0.6%,均P<0.05).50、100和200μg/ml的沙利度胺处理SMMC-7721细胞48 h时,Annexin V-FITC/PI双标法检测SMMC-7721细胞的凋亡率分别为8.7%±1.2%、16.8%±2.5%和25.4%±4.5%,均明显高于空白对照组SMMC-7721细胞48 h的自然凋亡率(2.1%±0.5%,均P<0.05).随着沙利度胺浓度的增加,表达caspase-3蛋白的SMMC-7721细胞数量不断增加,而SMMC-7721细胞中VEGF的含量却逐渐下降.结论 沙利度胺可能通过诱导肝癌细胞的凋亡、抑制肿瘤血管的生成而发挥双重抗肿瘤生长的作用.