抗人B细胞淋巴瘤DNA疫苗的构建

目的 :探讨人B细胞淋巴瘤活检组织中肿瘤细胞膜表面免疫球蛋白VH(smIgVH)基因片段能否在动物体内激发特异性抗独特型抗体。方法 :以RT PCR法获得IgVH 基因片段 ,以小鼠单核细胞趋化因子 (MCP 3)基因作为佐剂分子 ,进行重组PCR获得MCP 3和VH 基因片段的融合基因 ,克隆在真核表达载体 pcDNA3.1中 ,构建DNA疫苗质粒 pcDNA/MCP BVH。通过脂质体转染验证该质粒在真核细胞COS 7中的表达。结果 :通过上述方法获得了以活检组织肿瘤细胞mIgVH区基因片段 ;成功地构建了DNA疫苗质粒 pcDNA/MCP BVH。体外瞬时转染实验证明 ,该质粒能够在真核细胞COS 7中正确表达。结论 :成功地构建重组表达质粒 pcDNA/MCPBVH,在体外能够正确表达 ,为进一步研制抗B细胞淋巴瘤基因疫苗奠定了基础     

人TRAM基因真核表达载体的构建

目的 构建TRAM基因真核表达载体,为研究TRAM的功能提供研究工具。方法 首先采用PCR方法扩增人TRAM蛋白相应的编码序列,将扩增的特定片段克隆至pCMV-N-Flag真核表达载体。然后,对重组载体进行DNA测序,确认序列正确后将重组载体转染至HEK-293T细胞,并用Western blot方法检测TRAM蛋白的表达以评价载体是否构建成功。结果 菌落PCR电泳可检测到800 bp附近出现目的条带,质粒DNA测序显示载体插入705 bp的核苷酸序列,其序列与TRAM完全一致。Western blot检测到HEK-293T细胞高表达带Flag标签的TRAM蛋白。结论 基于PCR扩增、双酶切、酶连接扩增片段和载体成功构建带Flag标签的TRAM真核表达载体。构建的质粒可为进一步研究干扰素的调控和抗病毒免疫治疗提供一种研究工具。     

人CD81的克隆及在COS-7细胞中的表达

目的 从人外周血淋巴细胞中克隆出CD81基因，构建真核表达质粒，并在COS－7细胞中进行表达。方法 分离外周血淋巴细胞，提取细胞总RNA，采用RT－PCR扩增CD81基因。将CD81基因克隆至载体pcDNA3.1( )中，进行酶切及测序鉴定。以质粒pcDNA3.1-CD81转染COS－7细胞进行瞬时表达，并用免疫细胞化学染色法和流式细胞术检测蛋白的表达。结果 RT－PCR产物已插入载体pcDNA3.1( )构建成真核表达质粒pcDNA3.1-CD81。经双酶切和测序鉴定表明，克隆出的人CD81全长编码序列同GenBank收录的序列一致，并且真核表达质粒的构建正确。以脂质体转染COS－7细胞后，用免疫细胞化学染色法和流式细胞术检测表明，细胞可表达人CD81。结论 成功地构建真核表达载体pcDNA3.1-CD81，为进一步研究HCV和CD81的相互作用，以及建立可能的HCV细胞感染模型打下了基础。     

人类基因XAPC7真核表达载体的构建及其在SMMC-7721细胞中的表达

目的:构建pcDNA3.1(-)/XAPC7真核表达载体并检测其在人肝癌细胞系SMMC-7721中的表达.方法:采用PCR法从pET28b/XAPC7重组质粒中克隆得到XAPC7 cDNA全长序列,将之与pMD18-T载体连接、测序后将该片段亚克隆到真核表达载体pcDNA3.1(-)中.构建好的pcDNA3.1(-)/XAPC7真核表达质粒经酶切鉴定后,采用脂质体法将该重组质粒转染人肝癌细胞系SMMC-7721,经G418筛选,得到阳性克隆细胞株,再应用半定量RT-PCR技术检测转染前后该细胞株XAPC7基因的mRNA表达水平.结果:pcDNA3.1(-)/XAPC7经酶切鉴定及DNA测序证实,目的基因XAPC7的序列完全正确,真核表达载体构建成功;经RT-PCR检测,重组质粒转染株的XAPC7基因mRNA表达水平高于对照组,证实XAPC7基因已经稳定转染到SMMC-7721细胞中并得到表达.结论:成功地建立了人基因XAPC7的稳定转染细胞株,为进一步研究XAPC7的功能奠定了实验基础.     

口蹄疫病毒VP1基因真核表达载体的构建及其在树突状细胞的表达

目的:构建口蹄疫病毒VP1基因的真核表达载体, 转染并筛选稳定表达VP1的树突状细胞(dendritic cell, DC).方法:将pMD-18-VP1克隆于pcDNA3.1(+)中, 构建重组质粒, 酶切鉴定, DNA测序证实序列正确后, 利用脂质体将重组质粒转染DC, 经含G418培养基筛选获得抗G418细胞克隆, 用Western blot鉴定FMDV VP1基因在DC中的表达.结果:构建的pcDNA3.1-VP1真核表达载体经限制性内切酶酶切鉴定及序列分析证实了其序列的正确性, SDS-PAGE和Western blot结果显示G418筛选获得DC稳定表达VP1.结论:成功地构建了重组质粒pcDNA3.1- VP1真核表达载体, 并在DC中得到稳定表达.     

赖型钩端螺旋体外膜脂蛋白LipL41基因真核表达质粒的构建及表达

目的：构建赖型钩端螺旋体LipL41基因的真核重组表达质粒、并对其表达进行检测。方法： 以赖型钩端螺旋体017株基因组DNA为模板PCR扩增目的基因，克隆至原核表达质粒pGEX-4T-1上。测序分析后酶切，并连接至真核表达质粒pcDNA3上，构建真核重组表达质粒LipL41-pCDNA3。利用脂质体介导转染COS7细胞，提取细胞总RNA，RT-PCR检测其表达。结果： PCR扩增出1 011 bp大小的目的片段，序列分析显示它与Leptospira kirschneri的LipL41基因成熟肽序列同源性高达98%。酶切鉴定证实真核重组表达质粒LipL41-pCDNA3构建成功，RT-PCR检测显示，LipL41-pCDNA3转染组在大约1kb处出现特异的扩增带，而空质粒组无此条带。结论：LipL41的真核重组表达质粒构建成功，并可在哺乳动物细胞中表达。     

肠道病毒71型多表位-mGITRL真核表达质粒的构建、表达及其免疫原性研究

目的:构建肠道病毒71型(EV71)多表位-mGITRL真核表达质粒并对其免疫原性进行研究。方法:串联已证实的VP1表位并合成(VP1’);PCR扩增获得mGITRL,克隆至真核共表达载体pIRES中。对重组质粒进行测序鉴定后,以脂质体介导法转染至COS7细胞,通过Western blot方法检测其在COS7细胞中的表达。将构建好的重组质粒免疫小鼠,应用ELISA法检测小鼠血清中抗VP1的抗体滴度。结果:PCR扩增出目的基因,测序证实真核共表达载体pIRES-VP1’-mGITRL构建成功,Western blot结果显示目的基因在COS7细胞和肌细胞中过表达。小鼠血清中检测出高滴度的抗VP1抗体。结论:成功扩增出目的基因并构建VP1表位的重组真核共表达载体pIRES-VP1’-mGITRL,在COS7细胞和肌细胞中过表达,并获得高滴度的抗VP1抗体。     

小鼠催产素受体基因编码区全长的克隆和真核表达

目的 :为了获得小鼠催产素受体 (mouseoxytocinreceptor,mOTR)基因的全长编码区和构建mOTR的真核表达载体 ,以及在哺乳动物细胞中真核表达mOTR。方法 :采用RT PCR方法 ,获得有相互重叠序列的mOTR的羧基端和氨基端的cDNA片段并分别将其亚克隆入PMD 18 T载体。通过对这 2个片段加入酶切位点、双酶切和相互连接 ,获得全长的编码序列。然后将mOTR的全长的编码序列克隆入真核表达载体pEGFP N3,再用脂质体转染法将pEGFP N3 mOTR质粒转染到COS 7细胞中并进行了瞬时真核表达。结果 :将mOTR的羧基端和氨基端的cDNA片段亚克隆入了PMD 18 T载体。连接并最终获得了mOTR编码区的全长序列 ,构建了pEGFP N3 mOTR真核表达载体。将pEGFP N3 mOTR载体转染入COS 7细胞 ,并成功地进行了瞬时真核表达。结论 :成功构建了包含mOTR全长编码区序列的pEGFP N3 mOTR真核表达载体 ,并在COS 7细胞中进行了瞬时表达 ,为今后研究mOTR的功能打下了基础。     

牙龈卟啉菌外膜蛋白ragB-GITRL真核共表达载体的构建及免疫原性研究

目的:构建牙龈卟啉菌外膜蛋白ragB和小鼠糖皮质激素诱导的肿瘤坏死因子受体的配体(mGITRL)真核共表达载体,在体内研究其免疫原性。方法:应用PCR扩增技术,从pMD18-T-ragB中获得ragB基因编码序列片段,克隆至真核共表达载体pIRES及pIRES-mGITRL。对重组质粒进行双酶切与测序鉴定后,以脂质体介导法转染至COS7细胞,通过Western blot检测其在COS7细胞中的表达。将成功构建的重组质粒免疫小鼠,应用ELISA法检测免疫后小鼠血清中抗RagB的水平。结果:PCR扩增目的基因,酶切和测序证实重组质粒pIRES-ragB及pIRES-ragB-mGITRL成功构建,Westernblot结果显示目的基因在COS7细胞及骨骼肌细胞中均过表达。小鼠血清中检测出高滴度的抗RagB的抗体。结论:pIRES-ragB-mGITRL表达载体的构建,为牙龈卟啉菌疫苗研究、预防和牙周炎治疗提供了实验依据。     

抗人HBsAg单链抗体基因的构建及其在COS-7细胞中的表达

目的：构建抗人HBsAg单链抗体基因，并分析其在COS—7细胞中的表达。方法：以从噬菌体抗体库中筛选的抗HBsAg的Fab抗体基因为模板，分别扩增其轻、重链可变区(VL、VH)基因，通过重组PCR方法将轻、重链可变区基因用连接肽(C1y4Ser)3的编码序列连接，并引入前导肽编码序列，构建具有L—VH—Linker—Vl结构的单链抗体基因。将所构建的单链抗体基因克隆入绿色荧光蛋白(GFP)融合表达载体pEGFP—N3，并转染COS—7细胞进行表达。结果：经测序表明，前导肽、连接肽、VL及Vh的序列正确。酶切鉴定证实，成功地构建了GFP基因融合表达载体。瞬时转染COS—7细胞后，通过荧光显微镜观察证实有ScFv融合蛋白的表达。转染细胞的培养上清浓缩后，进行SDS—PAGE及westem blot分析，可检出ScFv融合蛋白的分泌性表达。培养上清的间接ELISA检测证实，所表达的单链抗体具有与HBsAg结合的特异性。结论：成功地构建了抗人HBsAg单链抗体基因，并可在COS—7细胞中分泌性表达。     

hdll1~(ext)-Fc融合蛋白真核表达载体的构建及表达

目的 :构建人dll1ext(humandelta like1extracellularregion) Fc融合蛋白的真核表达载体pEF BOSneo hdll1ext Fc,并在COS 7细胞中进行表达。方法 :从人脑cDNA文库中PCR扩增人delta like1胞外段 ,通过DNA重组构建真核表达载体 pEF BOSneo hdll1ext Fc。瞬时转染COS 7细胞 ,应用RT PCR、细胞免疫荧光技术和双抗体夹心ELISA ,检测融合蛋白的表达。结果 :成功地构建了真核表达载体 pEF BOSneo hdll1ext Fc。以重组载体转染COS 7细胞后 ,RT PCR结果显示delta like1胞外段与IgG1Fc在mRNA水平正确拼接 ;细胞免疫荧光染色呈阳性反应 ;夹心ELISA法检测到细胞培养上清中有融合蛋白的表达。结论 :成功地扩增了人delta like1胞外段 ,构建了 pEF BOSneo hdll1ext Fc真核表达载体 ,并在COS 7细胞中获得表达 ,为下一步研究奠定了基础     

hdll1ext-Fc融合蛋白真核表达载体的构建及表达

目的：构建人dlll^ext(human delta-likel extraeellular region)-Fe融合蛋白的真核表达载体pEF-BOSneo-hdlll^ext-Fc，并在COS-7细胞中进行表达。方法：从人脑cDNA文库中PCR扩增人delta-likel胞外段，通过DNA重组构建真核表达载体pEF-BOSneo-hdlll^ext-Fe。瞬时转染COS-7细胞，应用RT-PCR、细胞免疫荧光技术和双抗体夹心ELISA，检测融合蛋白的表达。结果：成功地构建了真核表达载体pEF-BOSneo-hdlll^ext-Fc。以重组载体转染COS-7细胞后，RT-PCR结果显示delta-likel胞外段与IgG1 Fe在mRNA水平正确拼接；细胞免疫荧光染色呈阳性反应；夹心ELISA法检测到细胞培养上清中有融合蛋白的表达。结论：成功地扩增了人delta-likel胞外段，构建了pEF-BOSneo-hdlll^ext-Fc真核表达载体，并在COS-7细胞中获得表达，为下一步研究奠定了基础。     

IL-13及其变异体真核表达载体的构建表达与亚细胞定位

目的：体外构建野生型人白细胞介素-13（whIL-13）及变异型人白细胞介素-13（mhIL-13）与增强型绿色荧光蛋白（EGFP）融和蛋白真核表达载体，分析其在COS-7细胞中的表达和亚细胞定位。方法：以RT-PCR方法扩增whIL-13、mhIL-13全长编码基因，构建EGFP-whIL-13、EGFP-mhIL-13融和蛋白真核表达载体，转染COS-7细胞，以激光扫描共聚焦显微镜观察融合蛋白的表达及其在细胞内的分布情况。结果：两种融和蛋白表达载体均构建正确，将其转染COS-7细胞后，在阳性克隆胞浆内均可见明亮的绿色荧光，胞核空虚。结论：成功构建EGFP-whIL-13、EGFP-mhIL-13融和蛋白表达载体，并在COS-7细胞中得到表达，表达的两种融和蛋白细胞内分布特征没有区别，均位于胞浆内。     

人呼吸道合胞病毒F基因的克隆、真核表达与鉴定

目的 克隆人呼吸道合胞病毒（human respiratory syncytial virus，HRSV）F基因，构建F基因的真核表达载体pcDNA3．1（＋）/F，并进行表达和鉴定。方法根据编码F蛋白的基因序列设计引物，通过RT-PCR从感染HRSV的HEp-2细胞中扩增获得F蛋白的基因，然后克隆到pGEM-3zf载体中，序列测定正确后，将其亚克隆到真核表达载体pcDNA3．1（＋），行酶切鉴定，脂质体法转染COS-7细胞，应用Western blotting方法分析F基因表达情况。结果测序证实得到HRSVF基因序列，序列分析显示没有发生无义突变。转染COS-7细胞后，利用Western blotting方法检测到了F蛋白的特异性条带。结论成功克隆HRSVF基因，并在真核细胞中获得表达。     

Nanog基因的原核表达及抗体制备

目的:在大肠杆菌中表达Nanog融合蛋白,制备兔抗小鼠Nanog融合蛋白抗体。方法:从含小鼠Nanog基因的pNA992质粒中扩增出小鼠Nanog基因并插入pET-32a中构建pET-32a-Nanog重组表达载体,并转化大肠杆菌BL21,经IPTG诱导表达,得到了Nanog融合蛋白,并经Histrap亲和层析柱纯化后,将其作为抗原免疫家兔制备多克隆抗体,用间接ELISA法检测抗体效价,Western blot和免疫细胞化学染色检测抗体特异性。结果:成功地构建了重组表达载体pET-32a-Nanog,经诱导获得了大量Nanog融合蛋白,其主要以包涵体形式表达,纯化后蛋白纯度达到97%,经免疫的兔抗血清效价可达1∶32 000,并表现出较好的特异性。结论:成功地制备出高滴度、高特异性的兔抗Nanog融合蛋白抗体。     

人IL-18结合蛋白AcDNA的克隆及在COS-7细胞中的表达

目的：克隆人IL－18结合蛋白（hIL-18BPa)的cDNA，观察其在COS－7的表达。方法：采用RT－PCR自人白血病细胞株jukat中获得hIL-18 BPa的cDNA，将其克隆至T－vector中，经测序确证后，将该基因定向插入真核表达载体pcDNA3.1( )中，脂质体介导法将其转染COS－7细胞，72h后收集上清纯化，用BCA法测定hIL-18 BPa的含量，用ELISA法测定其活性。结论：获得的IL－18BPa的cDNA序列gene bank登录的cDNA序列一致。上清液中hIL-18BPa含量为1．4mg/L，并具有良好的生物学活性。结论：成功克隆hIL-18 BPa基因，并实现了COS－7细胞中的瞬时表达，为研究其活性奠定了基础。     

人连接蛋白Connexin26基因的克隆、表达及初步鉴定

目的研究含人连接蛋白Connexin26（Cx26）基因的真核表达载体构建及其在非洲猴肾细胞（COS-7）中获得稳定、高效表达的方法。方法提取人外周血淋巴细胞RNA，经逆转录制备成cDNA，设计特异性引物，用PCR方法从cDNA中扩增Cx26基因，将其定向插入真核表达载体pCI-neo中获得pCI-Cx26重组子-采用酶切法和测序法鉴定。用脂质体将pCI-Cx26转染COS-7细胞，经G418筛选，获得阳性克隆。用RT-PCR和SDS-PAGE检测对表达产物进行检测。结果从人外周血RNA制备而成的cDNA中可扩增出预期大小的Cx26基因片段，pCI-Cx26经双酶切测序证实构建成功。RT-PCR和SDS-PAGE检测到pCI-Cx26在COS-7细胞中获得稳定、高效表达。结论本研究成功构建了人连接蛋白Cx26基因重组真核表达载体pCI-Cx26：pCI-Cx26脂质体转染COS-7细胞，可见Cx26基因在COS-7细胞中获得稳定、高效的表达。该结果为今后进行pCI-Cx26基因治疗Cx26基因突变引起的遗传性耳聋的研究奠定了实验基础。