PACAP促PC12细胞突起生长的分子机制

垂体腺苷酸环化酶激活肽 (PACAP)具有广泛的生理功能。近年来的研究发现 ,PACAP具有重要的神经营养作用。 PACAP可通过激活多条细胞内信号转导通路 ,促使 PC12细胞突起生长 ,使其向神经元样细胞分化。本文综述了 PACAP引起 PC12细胞突起生长的信号转导通路 ,有助于深入了解 PACAP神经营养作用的分子机制     

星形神经胶质细胞对PC12细胞生长发育的影响

在神经系统的生长发育过程中 ,星形胶质细胞对神经元生长发育的作用是一项重要的研究课题。本文以体外培养的 SD大鼠大脑皮质星形胶质细胞与 PC12神经元按不同细胞数目比例 ( 5 0∶ 1～ 1∶ 1)共同培养 ,并用其制备的条件培养液培养 PC12细胞 ,用快速灵敏的 MTT比色法测定 PC12神经元的细胞活力 ,用光学相差显微镜观察 PC12细胞形态学变化。结果显示 ,星形胶质细胞条件培养液可增强 PC12细胞活力 ( MTT测定的 OD值由 0 .2 5 5± 0 .0 12提高到 0 .5 10± 0 .0 3 6,P<0 .0 0 1,且细胞折光性较对照组强 ) ,却不能促使 PC12神经元突起的生出。将星形胶质细胞与 PC12细胞按 3 0∶ 1～ 1∶ 1的比例共同培养时 ,既可提高 PC12细胞折光性和光晕又可促使其突起的生长 ;如按 5 0∶ 1～ 40∶ 1的比例共同培养时 ,只观察到提高 PC12细胞折光性和光晕 ,而无促使其突起生长发育的作用。本文结果提示 ,PC12神经元细胞活力的提高与星形胶质细胞分泌到条件培养液中的可溶性因子有关 ,而 PC12神经元突起生长发育可能是和与星形胶质细胞的直接接触以及二者的细胞数目比有关。     

施万细胞样细胞对大鼠背根神经节细胞突起生长的影响

目的:通过建立施万细胞样细胞(SC-L)与幼年大鼠背根神经节(DRG)细胞共培养体系,观察DRG细胞突起的生长情况以及检测脑源性神经营养因子(BDNF)的表达。方法:采用0.1%的I型胶原酶分离培养脂肪源性干细胞(ADSCs)并进行鉴定,然后将其诱导分化为SC-L。分离培养DRG细胞,后将其分为单独培养组(DRG)和共培养组(DRG+SC-L)。DRG组将两份等体积的DRG细胞混合,常规培养; DRG+SC-L组将等体积的DRG细胞与SC-L进行共培养处理。7～10 d后采用苏木素-伊红(HE)染色观察两组DRG细胞的形态,免疫荧光和Western Blot技术检测DRG细胞内BDNF蛋白的表达。结果:与DRG组相比,DRG+SC-L组DRG细胞的数量以及突起的数目和长度明显增加、细胞内BDNF蛋白表达量明显升高(P <0.05)。结论:SC-L可增加DRG细胞的数量以及突起的数目和长度,并可提高细胞内BDNF蛋白的表达。     

大鼠大脑皮质星形胶质细胞的体外培养及其促神经突起生长作用研究

取生后１周以内ＳＤ大鼠大脑皮质，用胰蛋白酶消化结合机械吹打使细胞分散，制成较大量的初细胞悬液。将初细胞悬液先行粘附处理３０ｍｉｎ以排除其中的成纤维细胞，再制成较小量的次细胞悬液。将之接种到预先涂有鼠尾胶原的培养瓶中，令其贴壁３～５ｈ，细胞密度约１×１０５个／ｃｍ２。补加培养液，继续培养。培养液为含２０％小牛血清的ＤＭＥＭ／Ｆ１２混合培养液。俟细胞铺满瓶底后传代。届时细胞悬液亦行３０ｍｉｎ的粘附处理。以０．５×１０５个／ｃｍ２的细胞密度种植于培养瓶中。传代后先培养４８ｈ；换成无血清培养液再培养４８ｈ并收集条件培养液。对部分传代细胞进行胶质原纤维酸性蛋白免疫细胞化学杂色鉴定，证明传代后的细胞中星形胶质细胞比例达９４．７１％。取条件培养液及单纯ＤＭＥＭ／Ｆ１２培养液各１份，分别与２份有血清培养液混合，制成实验组与对照组两种培养液，以悬滴法培养鸡胚背根节。４８ｈ后，比较两组背根节神经突起的平均长度。经统计学分析揭示，实验组背根节神经突起平均长度显著大于对照组者，说明星形胶质细胞具有明显的促神经突起生长作用。     

CEPO对6-OHDA诱导PC12细胞损伤的保护作用

目的探讨氨甲酰化促红细胞生成素(CEPO)对6-羟基多巴胺(6-hydroxydopamine,6-OHDA)诱导PC12细胞损伤及凋亡的保护作用及其可能机制。方法借助CCK8、流式细胞(Flow cytometry,FCM)、Western-blotting和逆转录PCR(RT-PCR)技术检测PC12模型细胞相关指标的变化,实验数据以SPSS15软件统计分析。结果 CCK8结果显示6-O-HDA处理能够显著降低PC12模型细胞的存活率,而CEPO处理对其变化显示抑制作用;FCM技术探察结果显示,6-OHDA处理能够明显诱导PC12模型细胞的损伤与凋亡,而CEPO预处理能够减轻PC12模型细胞的损伤与凋亡(P<0.05);借助Western-blotting技术探察显示6-OHDA+CEPO处理组的PC12细胞的Cleaved caspase-3蛋白表达量显著低于6-OHDA处理组(P<0.05);RT-PCR结果显示,6-OHDA处理明显降低PC12模型细胞的Bcl-2 mRNA的表达(P<0.05)以及上调PC12模型细胞的Bax mRNA的表达(P<0.01),而CEPO处理明显上调Bcl-2 mRNA的表达水平(P<0.05)以及抑制Bax mRNA的表达(P<0.05)。结论CEPO处理能够显著抑制6-OHDA所诱导的PC12细胞的损伤及凋亡,其作用机制可能与其上调Bcl-2,并下调Bax和Caspase-3的表达有关。     

脑创伤组织提取液的神经营养活性及其活性因子来源的探讨

切除成年大鼠大脑双侧顶叶部分皮质,在术后不同时间取损伤周围脑组织,制成脑创伤组织提取液(BWTE);并建立新生大鼠大脑皮质神经元体外培养模型,检测BWTE中的神经元营养因子(NTFs)和促神经突起生长因子(NPFs)。为探讨这些因子的来源,是否与脑创伤区早期出现大量的巨噬细胞有关,我们培养巨噬细胞,收集巨噬细胞条件性培养基(MφCM),检测MφCM对大脑皮质神经元的神经营养活性。此外,亦观察BWTE和MφCM对PC 12细胞的作用,以进一步探讨NPFs的作用机制。实验结果表明,BWTE和MφCM中含有对大脑皮质神经元的NTFs和NPFs。这些因子于脑损伤后第4天开始出现,第5天达高峰(NPFs在第9天还出现一个高峰),第13天仍有活性。MφCM的NTF活性不及BWTE,但NPF活性则比BWTE强。BWTE和MφCM对PC 12细胞也具有NPF活性。通过实验分析认为,BWTE中的神经营养因子,早期主要来源于巨噬细胞,后期可能与星形胶质细胞有关。这些因子成分复杂,可能含多种有效成分,有待今后进一步探讨。     

肌肽对PC12细胞氧化应激损伤的保护作用

本研究采用过氧化氢和谷氨酸纳作用于PC12细胞,成功的制作了氧化应激损伤的细胞模型。将培养的细胞进行分组：正常对照组;损伤组;分别给予过氧化氢和谷氨酸钠;肌肽保护组,同损伤组的制备,但予先加入肌肽。用MTT法检测了各组细胞的生长状态并测定了LDH活性,观察了细胞形态和蛋白电泳等。结果表明：在保护组,MTT的测定结果高于损伤组,LDH低于损伤组,其细胞生长状态和蛋白质电泳结果也与损伤组有显著差异,证明了肌肽对PC12细胞的氧化应激损伤有明显保护作用。     

嗅成鞘细胞条件培养基对PC12细胞促分化作用及对分化后细胞损伤的保护作用

目的研究嗅成鞘细胞条件培养基(OECCM)对PC12细胞促分化作用及其对-OH自由基损伤分化后细胞的保护作用。方法采用原代分离培养的方法培养和纯化嗅成鞘细胞,收集其培养上清作为OECCM,然后用其培养PC12细胞,培养3 d后,进行细胞形态学观察及-βtubulin免疫细胞化学染色,同时在同一批细胞中加入100μmol/L FeSO4和50μmol/L H2O2作用20 min,再用OECCM继续培养48 h,然后进行MTT对细胞活性进行检测和存活细胞计数。结果用OECCM培养的PC12细胞长有突起,形态酷似神经元,并且-βtubulin免疫细胞化学染色呈阳性,而对照组细胞在同样培养时间里,没有明显的形态变化,-βtubulin染色呈阴性。用FeSO4和H2O2产生的-OH自由基对分化后的PC12细胞进行损伤,发现继续用OECCM培养后,反映细胞活性的A值为0.346 5±0.032,对照组0.201 8±0.034(P<0.01);同时两组细胞存活数目的百分比分别为:实验组为(56.7±5.9)%,对照组为(23.8±7.4)%(P<0.01)。结论嗅成鞘细胞可以分泌有促PC12细胞分化作用的分子和对分化后的细胞在损伤时有保护作用的分子。     

神经生长因子对体外培养的大鼠颈上节神经突起生长及RNA和DNA合成的作用的放射自显影研究

神经生长因子(NGF)可促进靶神经节神经突起生长晕的生长。本文应用3~H-尿嘧啶核苷和3~H-胸腺嘧啶核苷放射自显影术,进一步研究该作用与神经元合成RNA和DNA的关系。用新生大鼠颈上节,按Maximow双盖片法进行培养。培养物分NGF组(培养液内添加NGF粗制剂)和对照组(不用NGF)。NGF组培养物被3~H-尿嘧啶核苷标记的神经元百分率及标记颗粒水平,均高于对照组,而且每当培养物神经突起生长晕生长速度即将出现高峰时,神经元3~H-尿嘧啶核苷标记颗粒水平都明显地增高,说明NGF可促进颈上节神经元的RNA合成,后者与神经突起的迅速生长有一定相互关系。在3~H-胸腺嘧啶核苷标记培养物神经元的实验中,观察到NGF可促进培养第3天的颈上节少量的神经元合成DNA。     

CPT-环磷酸腺苷对视网膜节细胞再生的影响

目的　探讨玻璃体内插入外周神经和玻璃体内注射CPT 环磷酸腺苷对轴突损伤的视网膜节细胞再生的影响。　方法　 2 0只成年金黄地鼠随机分 4组 ,每组 5只。切断视神经 (ON)并缝接坐骨神经为再生对照组(attachedgraft,AG) ;ON切断并缝接坐骨神经后再于玻璃体内注射CPT cAMP和 或插入一小段自体坐骨神经 (SN)为实验组。采用逆行示踪标记术 ,观察视网膜平铺片节细胞数。　结果　 1 对照组 (AG) ,视网膜再生的节细胞数为 :142 8± 2 84个 ;2 外周神经组 (AG +SN) :每个视网膜再生的节细胞平均数为 2 2 2 0± 415个 ;3 CPT cAMP组 (AG+cAMP) :每个视网膜再生的节细胞平均数为 2 175± 36 4个 ;4 外周神经和CPT cAMP联合组 (AG +cAMP +SN) :每个视网膜再生的节细胞平均数为 42 5 5± 82 0个 ;其中 ,AG +SN、AG +CPT组同AG组相比存在差异显著性 (P <0 0 1) ;AG +CPT +SN组同AG、AG +CPT和AG +SN组相比均有差异显著性 (P <0 0 1)。　结论　研究结果提示玻璃体内注射CPT +cAMP或联合应用外周神经和CPT cAMP可大幅提高受损视网膜节细胞的再生。     

奥氮平对鱼藤酮诱导PC12细胞凋亡的保护作用

探讨非典型抗精神病药物奥氮平对鱼藤酮诱导神经元凋亡的可能保护作用及其机制。以NGF诱导后的PC12细胞作为细胞模型,采用鱼藤酮诱导细胞凋亡。用不同浓度奥氮平、氟哌啶醇预处理后,观察鱼藤酮对PC12细胞的作用,分别用噻唑蓝(MTT)法检测细胞活性、流式细胞仪检测细胞凋亡率、Hoechst33342染色观察细胞形态学改变,并对二者的结果进行比较。鱼藤酮以剂量依赖的方式杀死PC12细胞。鱼藤酮(6μmol/L)作用后,奥氮平(50μmol/L)组预处理48h的细胞活力显著高于对照组(无药物预处理)(P<0.05);鱼藤酮(4、6、8μmol/L)作用后,氟哌啶醇组(20、40、60μmol/L)的细胞活力均低于对照组。流式细胞仪检测结果显示,对照组、氟哌啶醇(20μmol/L)组、奥氮平(50μmol/L)组、空白对照组(无药物预处理以及鱼藤酮处理)的细胞凋亡率依次为(32.2±1.3)%、(42.1±1.0)%、(14.0±1.0)%和(1.3±0.3)%。Hoechst33342染色结果显示,对照组每个视野多见凋亡细胞,细胞核裂解为碎块,氟哌啶醇组更明显;奥氮平组凋亡细胞数量较氟哌啶醇组及对照组为少。结果提示奥氮平对鱼藤酮诱导PC12细胞的凋亡具有保护作用,这可能是奥氮平和氟哌啶醇在精神分裂症病人应用中有不同的治疗效果和副作用的部分机制。     

RNA干扰抑制Nogo-A基因表达对PC12细胞多巴胺释放的影响

目的 研究Nogo-A基因沉默对PC12细胞多巴胺释放的影响.方法 构建靶向Nogo-A的短发夹样RNA(shRNA)真核表达载体,并经脂质体转染PC12细胞,以逆转录聚合酶链反应(RT-PCR)和免疫印迹法检测对Nogo-A mRNA及蛋白的抑制效应.采用高效液相色谱仪(HPLC)检测转染前后多巴胺释放的变化.结果 将重组质粒转染到PC12细胞48h后,Nogo-A基因表达明显受抑、多巴胺释放量减少.结论 Nogo-A可能参与PC12细胞多巴胺的释放.     

霍乱毒素对金黄地鼠视网膜节细胞再生的作用

目的：探讨霍成毒素（CTx)对金黄地鼠视网膜节细胞（RGCs)再生的促进作用,方法：成年金黄地鼠近端切断视神经（ON）并接一段自体坐骨神经（AG）,玻璃体内注射CTx及／或插入小段坐骨神经分支（SN）。动物随机分为AG组和溶剂组;AG＋CTx组;AG＋SN组;AG＋CTx SN组;量效关系组。前4组动物存活2－6周,用粒蓝逆行标记再生的RGCs,在荧光镜下观察视网膜平铺片再生RGCs的数量变化。结果：AG＋CTx组各时间点视风膜再生RGCs平均数比AG组和溶剂组增加,具有统计学意义（P＜0．05）;AG＋SN组也得出相似结果。AG＋CTx＋SN组各时间点的视网膜再生RGCs平均数分别比AG组和AG＋SN组明显增加（P＜0．01）。结论提示霍乱霉素或／与坐骨神经具有显著促进视神经切断后视网膜节细胞再生的作用。     

大鼠深部松果体的神经支配和去双侧颈上节后深部松果体的变化

应用电镜观察18只正常大白鼠和8只切除双侧颈上节8周后大白鼠的深部松果体。在非手术大鼠的深部松果体中可见交感神经无髓纤维终末,它含有小颗粒泡,多位于血管周隙,也见于松果体细胞间。具有大颗粒泡的无髓神经纤维终末见于深部松果体,且与含清亮泡的神经末梢有突触性联系。深部松果体中存在大量来自缰核和后连合的有髓和无髓神经纤维。切除双侧颈上节后,大鼠深部松果体发生变化,松果体细胞核明显增大,胞浆中有不同形态空泡形成。细胞膜出现大量皱褶,细胞体积变小。交感神经终末呈清亮型溃变象。     

H-89和wortmannin对forskolin和IBMX促进受损视网膜节细胞再生作用的影响

目的：探讨foirskolin和IBMX促进受损视网膜节细胞（RGCs）再生的作用机制。 方法：采用荧光逆行示踪标记术和自体坐骨神经移植术，研究蛋白激酶A（PKA0和抑制剂H－89或／和PI3－K特异抑制剂wortmannin玻璃体内注射对forskolin和IBMX促进成年金黄地鼠受损RGCs再生的影响。结果：H－89和wortmannin均可部分抑制forskolin和IBMX对受损RGCs的促再生作用，wortmannin的抑制作用更大；两药联合应用，可完全抑制forskolin和IBMX对受损RGCs的促再生作用。结论：forskolin和IBMX可能是通过PKA－CREB和P13－Akt通路实现对受损RGCs的促再生作用。     

神经再生素对PC12细胞凋亡的影响

目的 研究神经再生素(NRF)对PC12细胞凋亡的影响并初步探讨其机制。方法 通过观察细胞形态的变化、MTT微量比色法、流式细胞仪AnnexinV和caspase-3活力检测等方法，了解NRF对低浓度血清培养下PC12细胞凋亡的影响。NGF、和RPMI1640作对照。结果 培养细胞的突起生长数量和长度、M1TT微量比色的A值、AnnexinV—PE／7AAD显示的凋亡细胞比例、caspase-3活力的检测等指标，在NRF组和NGF组问无明显差异；而与窄白对照组间差异有显著性意义。结论 神经再生素对低血清培养下PCI2细朐的凋亡有抑制作用。