强力霉素调控血小板生成素在CHO细胞中的表达

本实验应用Ｔｅｔ－Ｏｎ基因表达系统,通过强力霉素调控血板生成素（ＴＰＯ）基因在ＣＨＯ细胞中的表达。应用ＤＮＡ重组技术,构建质粒ｐＴＲＥ－ＴＰＯ。应用脂质体介导的基本转染技术,ｐＴＲＥ－ＴＰＯ与ｐＴＫ－Ｈｙｇ共转染ＣＨＯ－Ｔｅｔ－Ｏｎ细胞株,得到双稳定细胞株ＣＨＯ－Ｔｅｔ－Ｏｎ－ＴＰＯ,并筛选高表达、低背景克隆。当培养基中不加强力霉素时,ＲＴ－ＰＣＲ和Ｗｅｓｔｅｒｎ印迹未见ＴＰＯ表达,ＥＬＩＳＡ测定     

血小板生成素基因的克隆及其在真核细胞中的稳定表达

目的：为了得到重组人血小板生成素（ｒｈＴｐｏ），以治疗骨髓组织损伤造成的血小板减少与缺乏。方法：从人胚胎肝脏中分离ｍＲＮＡ，经逆转录、多聚酶链反应（ＰＣＲ）等步骤克隆出了Ｔｐｏ全基因。将Ｔｐｏ基因亚克隆至真核细胞稳定表达载体ＲＣ／ＣＭＶ中，构建成ＲＣ／ＣＭＶ／Ｔｐｏ重组质粒。结果：经转染中国仓鼠卵细胞（ＣＨＯ），得到了ｒｈＴｐｏ在真核细胞中的稳定表达。结论：实验得到的真核细胞稳定表达的ｒｈＴｐｏ可以增加体外小鼠巨核细胞克隆的形成。     

血小板生成素及其受体在急性白血病中的改变

目的 探讨血小板生成素（Ｔｐｏ）受体Ｃ－ｍｐｌ在急性白血病中的表达主其意义以及重组人Ｔｐｏ对急性白血病细胞增殖的影响。方法 采用半定量逆转录,聚合酶链反应（ＲＴ－ＰＣＲ）方法检测４３例急性白血病患骨髓单个核细胞Ｃ－ｍｐｌ基因的表达,用ＭＴＴ法研究重组人Ｔｐｏ单独或联合某些造血生长因子对急性白血病细胞增殖的影响。结果 ３５例急性髓系白血病（ＡＭＬ）患中有２２例表达Ｃ－ｍｐｌ,各ＦＡＢ亚型无均有表     

血小板生成素突变体的克隆和扩增及其融合蛋白在大肠杆菌中…

目的：通过获得编码血小板生成素成熟肽Ｎ端１￣１９６个氨基酸的突变体ｃＤＮＡ在大肠杆菌ＪＭ１０９中的表达，为Ｔｐｏ进一步的结构和功能研究提供材料来源。方法：用多聚酶链反应及ＤＮＡ重组技术，将ＰＣＲ产物克隆到ｐＵＣ１９载体并测序，然后克隆到表达载体ｐＭＡｌ－ｃ２上。     

血小板生成素在血小板疾病中的意义

血小板生成素 (ｔｈｒｏｍｂｏｐｏｉｅｔｉｎ ,ＴＰＯ) ,又称巨核细胞生长衍生因子 (ｍｅｇａｋａｒｙｏｃｙｔｅ ｇｒｏｗｔｈａｎｄｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔｆａｃｔｏｒ,ＭＧＤＦ) ,195 8年人们首次提出体液中存在调控血小板造血的因子 ,但鉴定该因子的努力一直没有取得成功。直到 1994年 ,Ｓａｕｖａｇｅ等采用亲和层析法首先纯化了猪的ｃ ｍｐｌ配体 ,克隆了人的ｃ ｍｐｌ配体的ｃＤＮＡ ;接下来的研究结果进一步揭示 ,它就是长期以来人们寻找的调节血小板生成的因子ＴＰＯ。此后国内外对其分离、克隆、结构、生物学活性及在临床疾病中…     

血小板生成素突变体的克隆和扩增及其融合蛋白在大肠杆菌中高效表达的研究

目的：通过获得编码血小板生成素（Ｔｐｏ）成熟肽Ｎ端１～１９６个氨基酸的突变体ｃＤＮＡ在大肠杆菌ＪＭ１０９中的表达，为Ｔｐｏ进一步的结构和功能研究提供材料来源。方法：用多聚酶链反应（ＰＣＲ）及ＤＮＡ重组技术，将ＰＣＲ产物克隆到ｐＵＣ１９载体并测序，然后克隆到表达载体ｐＭＡＬ－ｃ２上。结果：转化重组质粒ｐＭＡＬ－ＭＢＰ／ＴｐｏＭ的大肠杆菌经异丙基－β－Ｄ－硫代半乳糖苷诱导４～５小时，ＳＤＳ－ＰＡＧＥ分析显示融合蛋白（ＭＢＰ／ＴｐｏＭ）的分子量约为６．３万。薄层扫描分析表明该蛋白占菌体总蛋白量的３７％。结论：经ＰＣＲ方法扩增的Ｔｐｏ基因突变体可在大肠杆菌中高效表达，为Ｔｐｏ突变体的进一步结构和功能研究以及Ｔｐｏ抗体的制备打下了基础。     

重组血小板第4因子在甲醇酵母中的高效表达

目的 利用甲醇酵母高效表达重组人血小板第4因子（rhPF4)。方法 用PCR方法扩增出血小板第4因子（PF4）cDNA序列，插入到穿梭质粒pPIC9的MFα信号肽后，在醇氧化脱氢酶1（AOX1）启动子的下游，得到重组质粒pPIC9-PF4，转化到甲醇酵母宿主菌GS115，经筛选得到PF4高表达菌株进行表达，并测定表达产物氨基酸序列和生物学功能。结果 rhPF4氨基酸序列与天然PF4相同，可中和肝素抗凝作用，并呈剂量相关。结论 rhPF4可在甲醇酵母中获得生产规模表达，产物性质和天然的PF4相同。     

人血小板衍生生长因子B在大肠杆菌中的表达及对骨组织修复的影响

目的:为研究人血小板衍生生长因子BB(PDGF-BB)在大肠杆菌中的表达及其在治疗骨折愈合、骨质疏松等疾病中的作用,克隆了PDGF-B的成熟肽基因并进行了序列分析。方法:从脐静脉内皮细胞提取总RNA,经反转录聚合酶链式反应(RT-PCR)扩增出包含全长编码人PDGF-B基因cDNA,再以此为模板,用特异引物进行PCR扩增出PDGF-B成熟肽基因;将目的基因连接到载体pGEM-T上,进行序列测定。之后将此片段克隆到表达载体pQE30,构建成表达质粒pQE30-PDGFB。结果:重组质粒经酶切及PCR鉴定,证实PDGF-B成熟肽基因克隆成功,序列正确。结论:PDGFB基因的成功克隆和原核表达载体的构建,为促进骨修复功能研究及基因工程生产奠定了基础。     

重组人血小板生成素基因的COS—7细胞及在小鼠体内的转移与表达

为了观察重组血小板生成素(thrombopoietin,TPO)基因在COS-7细胞及在小鼠体内的表达,应用DNA重组技术构建了含TPO基因的真核表达质粒pcd2/TPO,用脂质体法将其转染COS-7细胞,用裸质粒DNA直接注射加电脉冲的方法将pcd2/TPO质粒转移到小鼠骨骼肌中.用RT-PCR及ELISA法检测到TPO基因在COS-7细胞的瞬时表达,MTT法显示其有刺激TPO依赖细胞系增殖的活性.RT-PCR及免疫组织化学染色可检测到TPO基因在转基因小鼠骨骼肌的表达,ELISA法定量检测转基因组小鼠血清TPO浓度为(1 185±264)ng/L,明显高于正常小鼠的TPO浓度(250±76)ng/L.本实验实现了TPO基因在小鼠体内和COS-7细胞的转移,为今后TPO基因治疗的研究奠定了实验基础.     

血小板生成素在体内造血调控中的作用

本文综述了ＴＰＯ在体内注射治疗血小板减少症，其ｃＤＮＡ过度表达或基因敲出的后果，对各系细胞的作用以及血清中的ＴＰＯ浓度与血小板和巨核细胞计数的关系等的最新进展。     

血小板生成素研究进展

血小板生成素(TPO),即C-Mpl配体,是巨核细胞增殖、成熟,也是血小板产生的主要调节因子。TPO纯化后,TPO各个领域的研究发展迅速。本文综述TPO在基因、蛋白结构,信号转导、表达调控和临床应用等领域的研究进展。     

血小板生成素研究进展

血小板生成素研究进展潘峰石远凯王奇璐综述３０年前即有人证明，把经处理后患严重血小板减少症的动物血浆给其它动物注射后，能明显增加其血液中血小板的数量。巨核细胞集落（ＣＦＵ－Ｍｅｇ）培养也证明这种血浆具有刺激巨核系祖细胞增殖分化和巨核细胞成熟的活性，因此...     

血小板生成素研究进展

血小板生成素（TPO），即C－Mpl配体，是巨核细胞增殖、成熟，也是血小板产生的主要调节因子。TPO纯化后，TPO各个领域的研究发展迅速。本文综述TPO在基因、蛋白结构，信号转导、表达调控和临床应用等领域的研究进展。     

血小板生成素在体内造血调控中的作用

血小板生成素(TPO)是调控巨核细胞造血和血小板生成的细胞因子,在早期造血调控中也有重要作用,它是酪氨酸激酶c-mpl受体的配体。本文综述了TPO和体内注射治疗血小板减少症、基cDNA过度表达或基因敲出的后果、对各系细胞的作用以及血清中的TPO浓度与血小板和核细胞计数的关系等的最新进展。     

联合检测网织血小板、血小板生成素在血小板减少症中的临床意义

网织血小板 (ｒｅｔｉｃｕｌａｔｅｄｐｌａｔｅｌｅｔｓ,ＲＰ)是新从骨髓中释放的血小板 ,具有较高的止血活性 ,许多学者认为ＲＰ百分率(ＲＰ % )及其绝对值对于分析血小板生成动力学及血小板减少机制有重要意义[1 ,2 ] 。血小板生成素 (Ｔｐｏ)是巨核细胞分化、成熟和血小板生成的特异性调节因子[3] ,被认为是诊断血小板减少的重要指标[4 ] 。我们对 10 7例血小板减少患者的ＲＰ及Ｔｐｏ水平进行了检测并探讨了其临床意义。现报告如下。对象和方法1　研究对象　①健康对照组 :正常健康献血员及健康体检者 6 0名 ,男 2 8名 ,女 32名 ,年龄 …     

人粒系集落刺激因子(hG-CSF)cDNA于P_RP_L启动子作用下在大肠杆菌中的表达

hG—CSF cDNA在天然状态下很难在大肠杆菌中表达。本文以作者克隆的高活性形式hG—CSF cDNA为模板,经PCR扩增出含hG—CSF信号肽中丙氨酸(Ala)及成熟型全部氨基酸编码序列的cDNA片段,于NcoⅠ、BamHⅠ位点克隆于原核表达载体PJLA602中,用高活性hG—CSF特异探针菌落原位杂交筛选出阳性克隆。此克隆hG—CSF cDNA在λ噬菌体 P_RP_L串联启动子和大肠杆菌atpE翻译起始区(TIR)共同作用下,阳性菌株热诱导表达后经小鼠骨髓细胞体外CFU-G测试表明,表达产物具明显的粒细胞集落刺激活性。     

血小板生成素及其受体的研究进展

本文综述了近年来关于血小板生成素及其受体系统(TPO/C-MPL)对造血调控方面的研究进展,涉及TPO/C-MPL的基因和蛋白分子结构,基因表达调控、信号传导的可能途径及其对造血活动的作用.TPO/C-MPL系统对造血过程的影响是广泛而重要的,不仅仅限于巨核细胞分化和血小板生成,而且涉及许多造血细胞体系,对造血活动的很多阶段都有作用.同时,TPO/C-MPL系统自身的表达是自稳的,存在一定的调控机制.TPO/C-MPL系统的作用具有广谱性,与许多血液疾病有关,这一领域的进展将加深人们对血液和血液病的认识并将有助于临床治疗.     

人IL—4基因质粒的构建及其在DOS细胞的表达

用ＰＨＡ活化人外周血单个核细胞提取ｍＲＮＡ，建立了ｃＤＮＡ文库，将其与人工合成的人ＩＬ－４针杂交，解离了一段ＤＮＡ序列，将其插入πＨ３Ｍ质粒，然后转化猴的ＣＯＳ细胞，经流式细胞仪测定证实表达细胞的培养上清中具有较高的人ＩＬ－４的生物学活性。     

重组人血小板生成素治疗脓毒症血小板减少症

目的 评价重组人血小板生成素(recombinant human thromobopoietin,rhTPO)对脓毒症相关血小板减少症的疗效和安全性.方法 前瞻、对照方法观察2009年1月至2009年11月入住天津市第一中心医院ICU的脓毒症并发生血小板减少的患者,外周血血小板计数≤40×109 L-1且主治及以上医师认为有必要升高血小板治疗的脓毒症患者为研究对象,排除恶性肿瘤、6个月内接受过免疫调节剂治疗、年龄＜14岁或＞75岁、心肺复苏后、入院24 h内转出或死亡者及终末期肝或肾功能衰竭者.将入选43例患者根据"不平衡指数最小的分配原则"随机分为特比奥(rhTPO)组(21例)和静脉注射用人免疫球蛋白(Intravenous Immunoglobulin,IVIG)组(22例),rhTPO组在综合治疗的基础上加用特比奥300 U·kg-1·d-1,2～8 d,IVIG组则在综合治疗的基础上加用静脉注射用人免疫球蛋白400 mg·kg-1·d-1,连用5 d.观察比较两组患者治疗后第1,2,3,5,7天外周静脉血血小板计数以及凝血指标、肝肾功能、出血及血制品输注情况、ICU住院时间、治疗费用等指标,随访并比较28 d病死率等预后情况.两组间参数的比较采用独立样本t检验,计数资料进行χ2检验.结果 rhTPO组治疗后血小板恢复最高值明显高于IVIG组(t=2.21,P=0.032);rhTPO组血小板最低值和最高值的差值明显大于IVIG组(t=7.40,P＜0.001).治疗前两组血小板计数差异无统计学意义(t=0.458,P＞0.05),用药第2天、第3天rhTPO组血小板计数升高明显高于IVIG组(t=2.166和t=2.132,P=0.036和P=0.041),两组存活病例用药第3天rhTPO组血小板计数明显高于IVIG组(t=2.28,P=0.032),两组出血发生率差异无统计学意义(χ2=0.720,P＞0.05),但rhTPO组血小板及血浆输注量明显少于IVIG组(t=2.038和t=2.252,P=0.048和P=0.030).两组ICU住院时间及病死率差异无统计学意义(t=0.91和χ2=0.264,P＞0.05),但rhTPO组用药平均消费显著低于IVIG组(t=16.93,P＜0.001).所有病死病例治疗前血小板计数显著低于存活组(t=3.448,P=0.001).rhTPO组无一例发生不良反应.结论 重组人血小板生成素可促进脓毒症相关血小板减少症血小板计数的恢复,减少患者血制品输注量,降低医疗费用且安全可靠.

Abstract：

Objective To evaluate the efficacy and safety of rhTPO (recombinant human thromobopoietin) employed for the treatment of sepsis-associated thrombocytopenia. Method There were 47 patients with sepsis-associaiod thrombocytopcnia eligible for the prospective, randomized (random number) and controlled clinical study from January 2009 to November 2009 in ICU of the Tianjin First center Hospital. According to the principle of minimum distribution imbalance index, these patients were randomly divided into the rhTPO group (n = 21) and the IVIG (intravenous immunoglobulin) control group (n = 22). In the rhTPO group, rhTPO was given subcutaneously to patients in a dose of 300 U/kg/d for 2 ～ 8 d, and in the IVIG control group, IVIG was used instead of rhTPO in a dose of 400 mg/kg/d for 5 days. Laboratory tests included blood routine examination, hepatic function, kidney function, coagulation function. The amount of blood products used, bleeding events, the days of ICU and hospital stay, total therapy cost and 28-day mortality were compared between two groups. Results The maximal platelet count in the rhTPO group was significantly higer than that in the contral group (t = 2.21, P =0.032). The mean value of difference between minimal and maximal platelet counts in the rhTPO group was much higher than that in the control group (t =7.40, P ＜0. 001). The average platelet count was no statistical difference between two groups before treatment (t =0. 458, P ＞ 0.05), but the average platelet counts in the rhTPO group were significantly higer than those in the contral group on the second and third day after treatment(t = 2. 166 and t = 2. 132, P =0. 036 and P =0.041. There were no statistical differences in incidence of bleeding, length of ICU stay and mortality between two groups (χ2 =0.720, t =0.91 and χ2 =0.264, P ＞0.05) , but the amounts of plasma and platelet transfusion were significantly less in the rhTPO group than those in the control group (t = 2.038 and t =2.252, P=0.048 and P=0.030) and the medical cost was cut down significantly in rhTPO group (t = 16.93, P ＜ 0.001). There was no adverse reaction occurred during period of observation. Conclusions The rhTPO can significantly increase platelet count, and decrease the amount of blood transfused and the medical cost. The administration of rhTPO is safe and efficient for the treatment of sepsis-associated thrombocytopenia.