miR-27a-3p靶向SnoN抑制高糖诱导的人近端肾小管上皮细胞EMT的作用

目的研究miR-27a-3p对高糖诱导的人近端肾小管上皮细胞EMT的影响并探讨其机制。方法运用qRT-PCR检测HK2细胞中miR-27a-3p的表达;将HG+anti-miR-NC组(转染anti-miR-NC)、HG+anti-miR-27a-3p组(转染anti-miR-27a-3p)、HG+pcDNA组(转染pcDNA)、HG+pcDNA-SnoN组(转染pcDNA-SnoN),均用脂质体转染至HK2细胞,并用D-葡萄糖(30mmol/L)处理48 h;Western blot检测各组细胞中E-cadherin、N-cadherin、SnoN、TGF-β1、p-Smad2的蛋白表达;双荧光素酶报告基因检测实验检测细胞的荧光活性。结果与低糖对照组相比,HG组细胞中miR-27a-3p显著升高,SnoN显著降低,Ecadherin、p-Smad2显著降低,N-cadherin、TGF-β1表达显著升高,(P<0.05);抑制miR-27a-3p、过表达SnoN均可上调Ecadherin,下调N-cadherin,抑制HK2细胞EMT;SnoN是miR-27a-3p的靶点。过表...     

慢病毒载体CV072介导的Mfn2过表达抑制肝星状细胞活化

目的:构建携带线粒体融合蛋白2(Mfn2)基因的慢病毒载体,并探讨Mfn2过表达对大鼠肝星状细胞活化的抑制作用及其减少肝纤维化相关因子生成的机制。方法:构建含Mfn2的慢病毒过表达载体CV072-pCMV-Mfn2-EGFP,转染肝星状细胞;荧光显微镜下观察细胞中绿色荧光蛋白的表达及转染效率;RT-qPCR和Western blot法检测转染后细胞中Mfn2的mRNA和蛋白表达水平;Western blot检测Bax、Bcl-2、cleaved caspase-3、α-SMA、TGF-β1、Smad2和Smad3的水平;ELISA检测Ⅰ、Ⅲ和Ⅳ型胶原蛋白水平。结果:与各对照组相比,慢病毒过表达载体CV072-pCMV-Mfn2-EGFP转染后,细胞促凋亡蛋白表达增多,TGF-β1/Smad通路蛋白TGF-β1、p-Smad和p-Smad3的蛋白水平均降低,纤维化相关蛋白α-SMA、I型胶原蛋白、Ⅲ型胶原蛋白和IV型胶原蛋白的水平降低(P0.01)。结论:转染慢病毒过表达载体CV072-pCMV-Mfn2-EGFP在体外可有效抑制肝星状细胞活化,并可能通过抑制TGF-β1/Smad通路减少肝纤维化相关因子的生成。     

miR-203a-3p抑制人肝癌细胞系增殖

目的 探索miR-203a-3p对人肝癌细胞系增殖和凋亡的分子调节机制。方法 RT-qPCR检测临床肝癌(HCC)组织及肝癌细胞系中miR-203a-3p的表达;建立miR-203a-3p过表达的HepG2细胞模型;MTT法检测细胞增殖;流式细胞测量术检测细胞凋亡;平板集落形成实验检测集落形成;细胞划痕实验检测细胞迁移;表达谱芯片检测mRNA水平;ELISA检测转化生长因子-β1(TGF-β1)的分泌;Western blot检测TGF-β1表达。结果 miR-203a-3p在HCC组织中低表达(P<0.05),与肿瘤分期呈负相关(P<0.05);HepG2细胞中过表达miR-203a-3p可显著降低细胞增殖速率(P<0.05)、迁移能力(P<0.05)、克隆形成能力(P<0.05),促进细胞凋亡(P<0.05);TGF-β1表达降低(P<0.05),而TGFβR1表达升高(P<0.05);细胞培养上清中TGF-β1含量降低(P<0.05);细胞内TGF-β1的蛋白降低(P<0.05);加入TGF-β1重组蛋白可减轻miR-2...     

丹参素对肝星状细胞TGF-β信号转导的影响

目的： 观察丹参素对转化生长因子β1（TGF-β1）诱导活化的大鼠肝星状细胞(HSCs)Smad信号转导通路的影响。方法：体外分离、培养大鼠肝HSCs,用不同浓度丹参素作用于HSCs,检测丹参素对HSCs增殖和TGF-β1刺激后HSCs增殖的影响;观察丹参素对TGF-β1刺激HSCs表达α-SMA的影响;观察HSCs转化生长因子受体(TβRⅠ、Ⅱ)的表达;观察丹参素和TGF-β1作用HSCs后,其Smad2、Smad3、Smad7 mRNA表达的变化。结果：(1)丹参素在0.0625 mmol/L-1 mmol/L时,对HSCs的生长增殖具有抑制作用 (P<0.05);丹参素对TGF-β1诱导的HSCs增殖也具有明显的抑制作用 (P<0.05)。(2)丹参素0.25 mmol/ L作用HSCs能下调α-SMA的表达(P<0.05),也能下调TGF-β1诱导的HSCs的α-SMA表达(P<0.05)。（3）HSCs中TβRⅠ、Ⅱ的表达定位于细胞膜上,丹参素能下调活化HSCs中TβRⅠ、Ⅱ的表达（P<0.05或P<0.01）。 (4) TGF-β1促进HSCs中Smad2、Smad3、Smad7 mRNA的表达（P<0.01）;丹参素能下调TGF-β1诱导的HSCs内Smad2、Smad3 mRNA的表达(P<0.05),并能上调Smad7 mRNA表达(P<0.05)。 结论：体外细胞实验表明,丹参素能通过下调活化HSCs细胞膜上TβRⅠ、Ⅱ蛋白的表达来抑制HSCs的活化增殖。丹参素能上调HSCs内Smad7 mRNA表达,并下调Smad2、Smad3 mRNA表达,抑制HSCs活化,并抑制TGF-β1诱导的HSCs活化。     

Apelin抑制TGF-β诱导的人肾小管上皮-间充质细胞转换

目的探讨多肽Apelin对转化生长因子β(TGF-β)诱导的人肾小管上皮-间充质细胞转换(EMT)的抑制作用及其机制。方法体外培养人近端肾小管上皮细胞,分别给予含TGF-β1(2μg/L)和/或不同浓度Apelin-13的培养基孵育细胞48 h,设立6个实验组(每组n=5):对照组、TGF-β组、TGF-β+Apelin(10-8,10-7和10-6mol/L)组和Apelin(10-6mol/L)组。刺激结束后,用免疫荧光染色观察细胞的上皮标志物E-钙黏素(E-cadherin)、间充质标志物α-平滑肌肌动蛋白(α-SMA)的分布和表达。Western blot检测细胞中E-cadherin、α-SMA及Smads信号通路的主要信号分子p-Smad2/3、Smad2/3和Smad-7的蛋白表达。RT-PCR法检测细胞外基质纤维连接蛋白(FN)、Ⅰ型胶原(Col-Ⅰ)及细胞自身Apelin和APJ受体的mRNA表达量。结果与对照组相比TGF-β组细胞为长梭形,E-cadherin的表达减少,α-SMA的表达增多,细胞外基质FN和Col-Ⅰ的mRNA表达量也显著升高;TGF-β+Apelin组上述效应被显著抑制,且呈浓度依赖性。与TGF-β组相比,TGF-β+Apelin组细胞活化型Smads的水平降低(P0.05),Smad7的表达增加(P0.05)。TGF-β组细胞自身APJ受体的表达量显著升高(P0.05),TGF-β+Apelin组上述效应受到抑制,且呈浓度依赖性。结论 Apelin干扰TGF-β/Smads信号通路从而抑制肾小管上皮细胞EMT;肾小管上皮细胞自身Apelin/APJ系统可能起到一定的代偿作用。     

MG132抑制TGF-β1诱导的人肺成纤维细胞活化

目的探讨泛素-蛋白酶体抑制剂MG132对转化生长因子β1(TGF-β1)诱导人肺成纤维细胞活化的影响及机制。方法体外培养人胚肺成纤维细胞(MRC-5),随机分为对照组、TGF-β1组(10μg/L)和MG132(0.5μmol/L)处理组。Western blot法检测细胞α-平滑肌肌动蛋白(α-SMA)和Ⅰ型胶原α1(COL1A1)的表达;RT-PCR和Western blot法分别检测细胞Smad7、核转录共抑制因子SnoN、TGF-βI型受体(TβRI)、Smad2和Smad3 mRNA及蛋白的表达。结果与对照组比较,TGF-β1促进了α-SMA和COL1A1蛋白表达(P0.05),MG132抑制了TGF-β1的上述作用(P0.05)。TGF-β1组Smad7和SnoN mRNA表达较对照组增加(P0.05)。TGF-β1组Smad7和SnoN蛋白表达较对照组减少(P0.05),而MG132组Smad7和SnoN蛋白水平较TGF-β1组增加(P0.05)。结论 MG132可能通过阻止Smad7和SnoN蛋白泛素化降解,抑制TGF-β1诱导人肺成纤维细胞活化。     

视黄醇X受体激动剂通过调控Smad2通路抑制TGF-β1诱导的心肌成纤维细胞胶原合成

目的:探讨视黄醇X受体(RXR)激动剂9-顺式视黄酸(9-cis-RA)干预对缺氧条件下转化生长因子β1(TGF-β1)诱导的大鼠心肌成纤维细胞(CFs)胶原合成的影响和分子机制。方法:心肌组织块干涸法培养大鼠CFs,持续通氮气法建立细胞缺氧环境,评价9-cis-RA和TGF-β1对CFs胶原合成的影响;ELISA法测CFs上清液Ⅰ、Ⅲ型胶原水平,Western blot法检测胞浆、胞核和细胞的Smad2及p-Smad2水平,细胞免疫化学法观察p-Smad2的亚细胞定位。结果:TGF-β1(0.01~10μg/L)在缺氧条件下呈浓度依赖性地诱导CFs合成Ⅰ型和Ⅲ胶原,当浓度达到5μg/L时,Ⅰ、Ⅲ型胶原的合成水平显著增高(P0.01)。9-cis-RA(10-9~10-6mol/L)则呈浓度依赖性抑制TGF-β1在缺氧条件下诱导的CFs胶原合成,当浓度为10-7mol/L时,Ⅰ型和Ⅲ型胶原的合成水平显著降低(P0.01)。Smad2抑制剂(20 nmol/L)亦可显著抑制TGF-β1在缺氧条件下诱导的CFs Ⅰ型和Ⅲ型胶原的合成。免疫杂交和细胞免疫化学结果显示,与TGF-β1干预相比,TGF-β1和9-cis-RA联合干预组的CFs其胞浆内p-Smad2的水平显著增加,但胞核内p-Smad2的水平明显降低(P0.05)。结论:RXR激动剂9-cis-RA显著下调TGF-β1在缺氧条件下诱导的CFs Ⅰ型和Ⅲ型胶原的合成,其机制与其抑制TGF-β1诱导的p-Smad2细胞核转位有关。     

新型过氧化物酶peroxiredoxin-1对大鼠肺成纤维细胞JNK介导的Ⅰ和Ⅲ型前胶原合成的影响

目的:探讨活性氧(ROS)在转化生长因子(TGF-β1)激活c-Jun N末端激酶(JNK)促进肺成纤维细胞合成Ⅰ和Ⅲ型前胶原过程中的作用,并观察新型过氧化物酶peroxiredoxin-1 (Prx-1)是否通过抑制活性氧来抑制TGF-β1促纤维化作用.方法:采用脂质体转染法转染真核质粒;免疫荧光检测质粒转染和8-OHdG(DNA氧化产物)的水平;免疫印迹检测Ⅰ/Ⅲ型前胶原、磷酸化JNK和Prx-1的表达.结果:与对照组比较,TGF-β1组的Ⅰ/Ⅲ型前胶原、8-OHdG及磷酸化p-JNK的表达水平均明显增加.与TGF-p1组比较,空载体组中的上述观察指标无明显变化,但Prx-1转染组的指标均明显下降.结论:TGF-β1能够诱导肺成纤维细胞生成活性氧,并由此促进JNK的激活和Ⅰ/Ⅲ型前胶原合成增加,而Prx-1则通过抑制活性氧来抑制TGF-β1的促纤维化作用.     

高糖对肾小管上皮细胞系细胞因子表达的影响

目的观察高糖诱导肾小管上皮细胞中转化生长因子β1(TGF-β1)、平滑肌肌动蛋白(α-SMA)、E-钙黏素(E-Cadherin)的改变及酪氨酸激酶(JAK)抑制剂AG490对其的影响。方法体外培养人肾近曲小管上皮细胞系(HKC),分别给予高糖和AG490干预,采用免疫沉淀和Western blot检测JAK2磷酸化的表达;Western blot检测α-SMA、E-cadherin及信号蛋白STAT1、STAT3等的水平;ELISA法测定细胞上清液中TGF-β1和Ⅰ型胶原的分泌;RT-PCR检测TGF-β1mRNA表达。结果与低糖组比较,高糖培养HKC中α-SMA、p-JAK2、p-STAT1和p-STAT3表达明显上调,E-Cadherin表达明显下调,TGF-β1mRNA表达增加;细胞上清液中TGF-β1、Ⅰ型胶原分泌增加。AG490明显抑制高糖刺激HKC中α-SMA表达的升高,减轻E-Cadherin表达下降程度,降低TGF-β1mRNA表达及TGF-β1、Ⅰ型胶原的分泌。结论JAK/STAT信号途径可能参与高糖诱导的HKC中TGF-β1和细胞外基质的分泌。     

5-氟尿嘧啶抑制TGF-β1诱导人肝内胆管上皮细胞间质化

目的探讨5-氟尿嘧啶对TGF-β1诱导人肝内胆管上皮细胞间质化的抑制作用,并探讨其作用机制。方法原代培养人肝内胆管上皮细胞,角蛋白19荧光染色鉴定;细胞分为:对照(normal)组,TGF-β1(TGF-β1)组,5-氟尿嘧啶(TGF-β1+5-FU)组;免疫荧光染色观察CK-19、E-cadherin、vimentin和α-SMA标记蛋白;Western blot检测细胞标记蛋白及TGF-β1表达量;Real-time PCR检测细胞Ⅰ、Ⅲ型胶原及TGF-β1 mRNA含量。结果原代培养的人肝内胆管上皮细胞呈多边形或者锥形,CK-19荧光染色为胞质着色;TGF-β1诱导72 h后,胆管上皮出现间质化表现,与正常组比较,vimentin、α-SMA和TGF-β1表达明显增强(P0.05),CK-19和E-cadherin表达显著减弱(P0.05),Ⅰ、Ⅲ型胶原及TGF-β1 mRNA含量显著升高(P0.05);5-FU抑制胆管上皮间质化,与TGF-β1组比较,CK-19和E-cadherin表达增强(P0.05),vimentin、α-SMA和TGF-β1表达明显减弱(P0.05),TGF-β1 mRNA和Ⅲ型胶原mRNA含量明显降低(P0.05)。结论 5-FU通过下调TGF-β1的表达抑制胆管上皮细胞间质化。     

c-SKI对冠脉内皮细胞增殖及内皮-间充质转化的影响

目的:探讨核蛋白c-SKI对冠状动脉内皮细胞增殖能力及内皮-间充质转化的影响。方法:使用不同浓度的转化生长因子β1(TGF-β1)作用人冠脉内皮细胞不同时点,Western blot法检测各组细胞中c-SKI、间充质细胞标志物波形蛋白和α-平滑肌肌动蛋白(α-SMA)及内皮细胞标志物E-钙黏蛋白的表达。使用携带c-ski基因的慢病毒转染冠脉内皮细胞后采用RT-qPCR验证转染效率。将细胞分为4组:对照组、TGF-β1(5μg/L)组、c-ski基因感染+TGF-β1组及对照病毒感染+TGF-β1组。过表达c-SKI后,MTT实验和集落形成实验检测冠脉内皮细胞的增殖能力,Western blot检测波形蛋白、α-SMA、E-钙黏蛋白、Smad2、Smad3、p-Smad2和p-Smad3蛋白的水平。结果:TGF-β1处理冠脉内皮细胞后,c-SKI在冠脉内皮细胞中的表达呈剂量和时间依赖性下降(P0.01)。MTT及集落形成实验结果显示,过表达c-SKI可显著抑制冠脉内皮细胞增殖(P0.01)。Western blot检测结果显示,与病毒对照组相比,过表达c-SKI可显著下调冠脉内皮细胞中α-SMA和波形蛋白的表达量(P0.01),上调E-钙黏蛋白的表达量(P0.01),同时抑制Smad2和Smad3蛋白的磷酸化(P0.01),逆转TGF-β1诱导的内皮-间充质转化。结论:内皮-间充质转化过程中c-SKI表达下调,而过表达c-SKI能够抑制冠脉内皮细胞增殖及内皮-间充质转化,其机制可能与调控TGF-β1/Smad信号通路活性有关。     

碱性成纤维细胞生长因子和转化生长因子-β1对表皮干细胞增殖和分化的作用

目的观察碱性成纤维细胞生长因子(b FGF)和转化生长因子-β1(TGF-β1)对体外培养的表皮干细胞(ESC)增殖和分化的作用。方法从10只1~3 d龄SD大鼠提取ESC,实验选用第2代细胞。按随机数字表法将细胞分为bFGF组、TGF-β1组、bFGF+SU5402组和TGF-β1+SB505124组和对照组,各干预组角质形成细胞无血清培养基中分别加入10 ng/mLbFGF、10 ng/mLTGF-β1、10 ng/mLbFGF+10μM-SU5402(bFGF受体抑制剂)、10 ng/mLTGF-β1+1 uM-SB505124(TGF-β1受体抑制剂),对照组不做处理,于处理后即刻、1、3、7、10 d 5个时间点显微镜下观察各组细胞形态,以MTS法检测各组ESC增殖情况,取各组处理后10 d细胞以Transwell法检测迁移能力,并采用实时荧光定量RT-PCR法及免疫印迹法检测各组基质金属蛋白酶-1(MMP-1)、α-平滑肌肌动蛋白(α-SMA)及Ⅰ、Ⅲ型胶原的相对表达量。结果 bFGF组ESC较对照组增殖能力(t=6.65,P0.01)及迁移能力(t=7.50,P0.01)显著增强,MMP-1表达(t=12.90,P0.01)明显增高,而α-SMA(t=-30.31,P0.01)、Ⅰ型胶原(t=-10.61,P0.01)和Ⅲ型胶原的表达量明显偏低(t=-7.91,P0.01);TGF-β1组ESC与对照组相比增殖能力(t=-3.36,P0.05)及迁移能力(t=-3.96,P=0.01)显著减弱,MMP-1表达(t=-8.81,P0.01)明显减少,而α-SMA(t=15.92,P0.01)、Ⅰ型胶原(t=-16.47,P0.01)和Ⅲ型胶原(t=22.80,P0.01)的表达量较对照组明显偏高;bFGF+SU5402组ESC增殖迁移能力及分化程度较对照组均无明显差别(P0.05),而TGF-β1+SB505124组ESC迁移能力较对照组显著增强(t=9.81,P0.01)。结论 bFGF可以显著促进ESC增殖和迁移,进而减少Ⅰ、Ⅲ型胶原的形成;而TGF-β1在抑制ESC增殖及迁移,进而促进Ⅰ、Ⅲ型胶原的形成。     

Smad7而非Smad6基因可抑制TGF-β诱导肾小管上皮-间充质转分化

目的:观察Smad6和Smad7基因能否抑制TGF-β诱导肾小管上皮-间充质转分化.方法:构建产生表达Smad6和Smad7基因的无辅毒腺相关病毒载体, 再将病毒颗粒分别转染入人肾小管上皮细胞(HKC), 细胞随机分为正常对照、 TGF-β1组、 Smad7 组、 LacZ组、 TGF-β1 Smad7或Smad6组、 TGF-β1 LacZ组.10 μg/L TGF-β1添加入培养液孵育15、 30、 60、 120 min和3 d.Western blot测定TGF-β1和Smad6或Smad7基因转染对细胞p-Smad2、 E-cadherin、α-smooth muscle actin(α-SMA)表达的影响, ELISA法测定培养上清羟脯氨酸的含量的变化, 倒置显微镜观察细胞形态变化.结果:与未加TGF-β1细胞相比, 添加TGF-β1后15、 30、 60、 120 min胞内Smad2磷酸化水平明显增加, 30 min时表现最大.10 μg/L TGF-β1与HKC孵育72 h后, 细胞α-SMA和羟脯氨酸量合成增加, E-cadherin表达减少;细胞形态变长, 呈纺锤状细胞, 失去鹅卵石样的形状.Smad7基因转染可抑制TGF-β1诱导Smad2磷酸化, 抑制细胞α-SMA和羟脯氨酸合成, 增加E-cadherin表达, 维持培养细胞的上皮样形态, 相反, Smad6没有这样的作用.结论:Smad7而不是Smad6基因转染能抑制TGF-β1诱导肾小管上皮-间充质转分化, 这些作用可能与Smad7阻断Smad2磷酸化有关.     

沙利度胺抑制TGF-β1诱导的人胚肺成纤维细胞系转分化为肌成纤维细胞

目的 研究沙利度胺(THD)对转化生长因子β1(TGF-β1)诱导的人胚肺成纤维细胞(HFL-F)向肌成纤维细胞(MF)转分化和对已分化MF的作用。方法 体外培养HFL-F,以TGF-β1(5μg/L)诱导HFL-F向MF转分化,通过碱水解法测定羟脯氨酸含量(Hyp),免疫印迹法测定α-平滑肌肌动蛋白(α-SMA)表达,半定量RT-PCR测定α-SMA mRNA和Ⅲ型胶原(COL Ⅲ)mRNA,观察THD(50μg/L)对HFL-F向MF转分化的过程及已分化MF的影响。结果 TGF-β1诱导HFL-F 96h,诱导分化同时加入THD可抑制Hyp含量增高和COL Ⅲ mRNA表达上调(p均<0.05),可抑制α-SMA蛋白表达增加,但对于α-SMA mRNA表达没有影响。TGF-β1诱导HFL-F 96h后再加入THD可抑制COL Ⅲ mRNA的表达(p<0.05),但对Hyp含量、α-SMA蛋白表达量和α-SMA mRNA表达无明显影响。结论 TGF-β1可诱导HFL-F向MF转分化,THD可抑制这一过程中α-SMA蛋白与胶原合成。对TGF-β1诱导下已分化的MF,THD可抑制其COL Ⅲ mRNA的表达。     

miR-146a介导PI3K/Akt信号通路抑制肝星状细胞诱导的肝纤维化

目的探讨微小RNA(miR)-146a在转化生长因子-β1 (TGF-β1)诱导的肝星状细胞活化中的作用,并通过磷脂酰肌醇3激酶(PI3K)/丝氨酸-苏氨酸蛋白激酶(Akt)通路观察其对肝纤维化的影响。方法采用四氯化碳(CC1_4)建立肝纤维化大鼠模型,检测大鼠血清透明质酸(HA)、层粘连蛋白(LN)、Ⅲ型前胶原(PCⅢ)和Ⅰ型胶原(Ⅰ-C)水平,Masson染色观察肝组织病变,实时定量聚合酶链反应(Real-time PCR)检测肝组织miR-146a表达,蛋白免疫印迹实验(Westem blot)检测肝组织α-平滑肌肌动蛋白(α-SMA)、PI3K和磷酸化(P)-Akt蛋白表达。HSC (肝星状细胞)-T6细胞分为Normal组、TGF-β1组、TGF-β1+miR-NC组和TGF-β1+miR-M组。TGF-β1+miR-NC组和TGF-β1+miR-M组分别转染miR-146a mimics阴性对照物和miR-146a mimics,然后除Normal组外,其余各组采用TGF-β1诱导HSC-T6细胞。四甲基偶氮唑盐(MTT)法观察细胞增殖情况,Real-time PCR法检测miR-146a表达,Western blot法检测α-SMA、Ⅲ-C、Ⅰ-C、PI3K和p-Akt蛋白表达。结果与正常组比较,模型组大鼠肝组织胶原沉积明显增加,纤维增生显著;血清HA、LN、PCⅢ和Ⅳ-C水平显著升高;肝组织miR-146a表达明显降低;而PI3K和P-Akt蛋白表达明显增加。TGF-β1组和TGF-β1+miR-NC组HSC-T6细胞各指标差异均无统计学意义。与TGF-β1+miR-NC组比较,TGF-β1+miR-M组miR-14表达明显增加,细胞活性、α-SMA表达、Ⅲ-C和Ⅰ-C均明显降低,PI3K和P-Akt蛋白表达明显下调。结论 miR-146a能够抑制TGF-β1诱导的肝星状细胞活化,其抗肝纤维化机制可能与抑制PI3K/Akt信号通路有关。     

罗格列酮抑制体外大鼠肝星状细胞活化

目的探讨罗格列酮（PPARγ配体）对肝星状细胞（HSCs）作用的机制。方法将原代HSCs随机分为3组：对照组;TGF-β1（5μg/L）组;TGF-β1加10μmol/L罗格列酮组。加药后48h用RT-PCR法检测细胞Ⅰ型前胶原的表达。用Western blot方法检测细胞SMAD3、SMAD4、SMAD7、α-平滑肌肌动蛋白（α-SMA）和Ⅰ型胶原的表达。免疫荧光化学标记,共聚焦显微镜下观察α-SMA的表达。用四甲基偶氮唑盐（MTT）法检测细胞的增殖。结果TGF-β1明显促进HSCs的增殖,促进HSCs表达Ⅰ型胶原和α-SMA（P〈0.01）;罗格列酮显著降低TGF-β1的作用（P〈0.01）。各组细胞SMAD3、SMAD4、SMAD7的表达无明显差异。结论PPARγ配体可以抑制TGF-β1对HSCs的活化作用。     

上调miR-200a的表达减弱TGF-β1刺激的大鼠胰腺星状细胞活化和胶原合成

目的探讨miR-200a对转化生长因子β1(TGF-β1)刺激的大鼠胰腺星状细胞(PSCs)活化和胶原蛋白合成的影响。方法用组织块法培养分离PSCs,免疫荧光染色检测结蛋白(desmin)、神经胶质原纤维酸性蛋白(GFAP)和α-平滑肌肌动蛋白(α-SMA)的表达鉴定PSCs;取新鲜培养的第2代PSCs,设空白对照组、TGF-β1组、TGF-β1+miR-NC组、TGF-β1+miR-200a mimic组,Western blot法和细胞免疫荧光染色法检测α-SMA和Ⅰ型胶原蛋白(collagenⅠ)的表达,荧光定量PCR检测α-SMA、collagenⅠmRNA及miR-200a的表达。结果 TGF-β1可刺激大鼠PSCs活化及促进胶原蛋白的合成(P0.05),且呈时间依赖性;转染miR-200a mimic后,在相同浓度的TGF-β1刺激下,α-SMA和collagenⅠ的蛋白和mRNA表达明显降低(P0.01)。结论上调miR-200a的表达,可减弱TGF-β1对大鼠PSCs活化和胶原蛋白合成的刺激作用,其可能的机制是抑制TGF-β1的生物学作用。     

硫化氢通过抑制TGF-β1/Smad信号通路抗大鼠肺纤维化

目的观察硫化氢(H2S)对博莱霉素所致大鼠肺纤维化的影响,并探讨其是否通过转化生长因子-β1(TGF-β1)/Smad信号通路发挥作用。方法 SD大鼠50只随机分为正常对照组、假手术组、模型组、硫氢化钠(Na HS)组和地塞米松组,每组10只,假手术组大鼠以生理盐水气管内注入,而后3组大鼠以博莱霉素A5气管内注入制备肺纤维化模型。自第2天起,Na HS组、地塞米松组大鼠分别以Na HS、地塞米松腹腔注射,其余3组腹腔注射等量生理盐水。全部大鼠第28天处死,留取肺组织,行HE和Masson染色,通过试剂盒测定肺组织羟脯氨酸(HYP)含量,采用实时荧光定量PCR和Western blot分别检测肺组织中TGF-β1、Smad2、Smad3、Smad7、α平滑肌肌动蛋白(α-SMA)、Ⅰ型胶原(ColⅠ)、Ⅲ型胶原(ColⅢ)m RNA和蛋白表达。结果与模型组比较,Na HS组和地塞米松组肺泡炎症与肺纤维化程度明显减轻(P0.01)。与正常对照组或假手术组比较,模型组肺组织HYP含量以及TGF-β1、Smad 2、Smad 3、α-SMA、ColⅠ、ColⅢm RNA和蛋白表达水平升高,但Smad 7 m RNA和蛋白表达水平降低,差异均有统计学意义(P0.01)。通过Na HS或地塞米松处理后,肺组织HYP含量以及TGF-β1、Smad 2、Smad 3、α-SMA、ColⅠ、ColⅢm RNA和蛋白表达水平减少,而Smad 7 m RNA和蛋白表达水平增加,与模型组比较,差异均有统计学意义(P0.01)。然而,Na HS组与地塞米松组以及假手术组与正常对照组上述指标相比无显著性差异(P0.05)。结论 H2S可能通过抑制TGF-β1/Smad信号转导通路下调α-SMA表达,从而减少ColⅠ、ColⅢ合成发挥抗大鼠肺纤维化作用。     

法舒地尔对TGF-β诱导尿道成纤维细胞增殖、迁移以及胞外基质合成的影响

目的探究法舒地尔对TGF-β诱导尿道成纤维细胞增殖、迁移以及胞外基质合成的影响。方法无菌条件下获得家兔尿道瘢痕组织,采用酶解法提取原代尿道成纤维细胞,用10 ng/m L TGF-β或者联合不同浓度(0,25,50μM)法舒地尔处理后,通过Western blot检测α-SMA、胶原蛋白Ⅰ、胶原蛋白Ⅲ和自噬以及迁移相关蛋白的表达。采用Transwell实验和MTT实验分别检测成纤维细胞迁移以及增殖能力。结果 Western blot结果显示,TGF-β明显上调了α-SMA蛋白、胶原蛋白Ⅰ、胶原蛋白Ⅲ,法舒地尔下调了胞外基质蛋白表达(P 0.05),并且呈浓度依赖性。Transwell实验和MTT实验显示,TGF-β增加了细胞迁移数量和细胞活性(P 0.05),而法舒地尔抑制了细胞迁移数量(P 0.05),下调了细胞活性(P 0.05)。Western blot结果还显示,TGF-β显著下调了p AKT、pm TOR和p62等蛋白表达(P 0.05),上调了ATG7、ATG5、LC3等自噬相关蛋白表达(P 0.05);而法舒地尔上调了p AKT、pm TOR和p62等蛋白表达(P 0.05),抑制了ATG7、ATG5、LC3等自噬相关蛋白表达(P 0.05)。结论法舒地尔可以通过激活细胞自噬从而抑制TGF-β诱导的成纤维细胞增殖、迁移以及胞外基质合成,其作用与促进AKT/m TOR信号通路相关。     

特发性肺间质纤维化中miRNA-29b的抗纤维化作用

目的对特发性肺间质纤维化(IPF)中机体miRNA-29b的抗纤维化作用进行研究,为临床针对性治疗干预提供重要依据。方法以我院体外实验室培养的人胚肺成纤维细胞(IMR-90)为研究对象,随机分成空白组、转化生长因子-β1(TGF-β1)诱导组及miRNA-29b转染组,观察3组细胞形态,并测定各组细胞内的minRNA-29b、信号传导蛋白Smad3、p-Smad3、E-钙黏蛋白(E-cad)、平滑肌肌动蛋白(α-SMA)及靶基因I型胶原蛋白(COL1A1)的表达情况。结果通过测定,相比空白组,TGF-β1诱导组的E-cad、miRNA-29b表达水平明显降低(P0.05),而α-SMA、p-Smad3及COL1A1的表达水平显著增高(P0.05);和TGF-β1诱导组相比,miRNA-29b转染组的miRNA-29b、E-cad表达水平显著增高(P0.01),p-Smad3、α-SMA及COL1A1表达水平降低(P0.05)。结论miRNA-29b表达提高能抑制TGF-β信号通路介导达到抗肺间质纤维化。