低剂量中波紫外线照射Nrf2基因缺陷小鼠后诱导晒伤反应的实验研究

[目的]观察Nrf2-Keap1通路在保护皮肤免受中波紫外线(UVB)影响中的作用.[方法]8周龄雌性野生型(即Nrf2+/+组)和Nrf2-/-小鼠,每组8只,分别用200 mJ/cm2 UVB(FL120SE灯)照射小鼠耳朵背侧,用刻度计分别测量UVB照射前和照射后1、2、4、7、9、11、14 d小鼠耳朵厚度,记录照射前后两组鼠耳皮肤镜下形态,36 h取各组鼠耳标本进行HE染色及TUNEL实验,记录结果并进行统计学分析.[结果]Nrf2-/-组小鼠耳平均厚度为(0.49±0.22) cm,Nrf2+/+组为(0.25±0.03) cm,经秩和检验,差异有统计学意义(P＜0.01).UVB照射小鼠后36 h组织学检查,Nrf2-/-组真皮水肿和表皮坏死,淋巴细胞浸润和真皮血管扩张更显著;表皮晒伤细胞数[(17.0±3.9)/视野]也较Nrf2+/+组[(5.0±1.7)/视野]明显,两组差异有统计学意义(P＜ 0.01);Nrf2-/-组TUNEL阳性细胞数约是Nrf2+/+组的5倍.单一UVB照射Nrf2-/-小鼠较Nrf2+/+小鼠发生更强烈而持久的晒伤反应.[结论]Nrf2-Keap1通路可保护皮肤免受UVB的影响,包括由于UVB照射引起的细胞凋亡和氧化损伤.     

茶多酚对人皮肤成纤维细胞Nrf2/Bach1mRNA及核蛋白的影响

目的 探讨茶多酚对人皮肤成纤维细胞(HSF) Nrf2/Bach1 mRNA及Nrf2/Bach1核蛋白表达分布的影响.方法 不同浓度茶多酚(0、2.5、5、10、20、40 mg/L)孵育HSF 24 h,MTT法检测细胞增殖活性,筛选出适宜浓度茶多酚,并用该浓度药物孵育HSF 24 h,RT-qPCR法检测Nrf2和Bach1mRNA表达,Western印迹法检测Nrf2、Bach1核蛋白表达,免疫荧光法检测Nrf2、Bach1蛋白核分布情况.结果 MTT法检测显示,当茶多酚浓度为5 mg/L时,对HSF增殖无明显影响,故后续实验采用5 mg/L茶多酚,对照组浓度为0.HSF加入茶多酚孵育后,Bach1 mRNA相对表达量(0.629±0.077)低于对照组(0.940±0.033,t=6.397,P＜0.05),Nrf2 mRNA(1.467±0.076)高于对照组(0.977±0.091,t=7.133,P＜0.05);Nrf2核蛋白表达(6.929±0.121)高于对照组(3.537±0.126,t=33.636,P＜0.05),而Bach1核蛋白(1.424±0.171)低于对照组(16.966±1.702,t=15.730,P＜0.05).免疫荧光结果显示,Nrf2蛋白在细胞核内的聚集增多,Bach1蛋白在细胞核内聚集减少.结论 茶多酚可促进Nrf2mRNA、Nrf2核蛋白的表达及核分布,抑制Bach1 mRNA、Bach1核蛋白的表达和核分布,从而发挥抗氧化作用.     

低剂量中波紫外线照射Nrf2基因缺陷小鼠后诱导晒伤反应的实验研究北大核心CSCD

目的观察Nrf2-Keapl通路在保护皮肤免受中波紫外线（UVB）影响中的作用。方法8周龄雌性野生型（即Nrf2＋/＋组）和Nrf2-/-小鼠,每组8只,分别用200mJ／cm2UVB（FL120SE灯）照射小鼠耳朵背侧,用刻度计分别测量UVB照射前和照射后1、2．4、7、9、11、14d小鼠耳朵厚度,记录照射前后两组鼠耳皮肤镜下形态,36h取各组鼠耳标本进行HE染色及TUNEL实验,记录结果并进行统计学分析。结果Nrf2-／-组小鼠耳平均厚度为（0．49±0．22）cm,Nrf2恤为（0．25±0．03）cm,经秩和检验,差异有统计学意义（P〈0．01）。UVB照射小鼠后36h组织学检查,Nrf2-/-组真皮水肿和表皮坏死,淋巴细胞浸润和真皮血管扩张更显著;表皮晒伤细胞数[（17．0±3．9）,视野]也较Nrf2＋/＋组[（5．0±1．7）,视野]明显,两组差异有统计学意义（P〈0．01）;Nrf2-/-组TUNEL阳性细胞数约是Nrf2嘲的5倍。单一UVB照射Nr￡2斗小鼠较Nrf2m小鼠发生更强烈而持久的晒伤反应。结论Nrf2-Keapl通路可保护皮肤免受UVB的影响,包括由于UVB照射引起的细胞凋亡和氧化损伤。     

人参皂苷CK对H2O2诱导人黑素细胞凋亡的保护作用

目的探讨人参皂苷化合物K(CK)对H₂O₂诱导来自新生儿中度色素沉着性包皮的正常人表皮黑素细胞(HEMn-MP)细胞凋亡的保护作用及可能机制。方法采用磷酸激酶抗体阵列检测HEMn-MP细胞各阵列蛋白磷酸化水平;比色法测定各组HEMn-MP细胞半胱天冬酶(Caspase-3)活性。结果CK减弱H₂O₂诱导的HEMn-MP细胞P53蛋白磷酸化;CK降低H₂O₂诱导的Caspase-3活化。结论人参皂苷CK可能通过抑制细胞凋亡对H₂O₂诱导的黑素细胞损伤有保护作用,因而可作为治疗白癜风的潜在药物。     

Nrf2蛋白在中波紫外线照射HaCaT细胞中的光保护作用

目的探讨Nrf2对中波紫外线(UVB)致HaCaT细胞光损伤的保护作用及其作用机制。方法将培养的HaCaT细胞分为对照组、UVB组、Nrf2组、Nrf2 + UVB组, Nrf2组、Nrf2 + UVB细胞感染Nrf2基因过表达慢病毒, UVB组、Nrf2 + UVB组细胞以30 mJ/cm2的UVB照射30 s, 继续培养24 h, 观察UVB照射后HaCaT细胞形态的变化, Western印迹检测各组Nrf2蛋白水平, CCK8法检测各组细胞生存率, 流式细胞仪检测各组细胞活性氧(ROS)水平, 生化法检测超氧化物歧化酶(SOD)水平。多组间均数比较采用单因素方差分析, 组间两两比较采用LSD-t检验。结果对照组HaCaT细胞形态为多角形、呈簇集状生长, UVB照射后细胞出现皱缩、变圆, 漂浮细胞数增多, 贴壁数量明显减少。对照组、UVB组、Nrf2组、Nrf2 + UVB组Nrf2蛋白相对表达水平分别为1.84 ± 0.047、0.63 ± 0.082、2.19 ± 0.168、1.43 ± 0.069, 差异有统计学意义(F = 64.81, P < 0.05), Nrf...     

转录因子TFAP2B在健康人及白癜风患者表皮黑色素细胞中的表达模式

目的探究转录因子TFAP2B在健康人及白癜风患者表皮黑色素细胞中的表达模式。方法收集空军军医大学西京皮肤医院2020年1月至2022年12月明确诊断的5例进展期白癜风患者皮损组织, 同时收集性别、年龄匹配的5例来源于整形外科手术剩余皮肤组织作为健康对照。培养永生化的健康人表皮黑色素细胞系PIG1、白癜风表皮黑色素细胞系PIG3V及人表皮原代黑色素细胞, 其中原代黑色素细胞分离自西京医院泌尿外科手术切除的3例健康男性包皮组织。采用组织免疫荧光检测TFAP2B、多巴色素互变异构酶(DCT)在健康对照皮肤和白癜风皮损中的表达及定位, 细胞免疫荧光和Western印迹法检测TFAP2B在人表皮黑色素细胞中的表达。两组间比较采用t检验, 相关性分析采用Pearson相关分析法。结果组织免疫荧光结果显示, TFAP2B仅在人表皮黑色素细胞中表达, 且定位于细胞核。Western印迹结果显示, TFAP2B在人表皮黑色素细胞系PIG1及原代黑色素细胞中强表达(相对表达量分别为0.45 ± 0.05和0.36 ± 0.04)。组织免疫荧光结果显示, 在10例人表皮组织(包括5例健康对照和5例白癜风)中...     

核因子E2p45相关因子2核转位对黑素细胞生物学活性的影响

【摘要】 目的 探讨核因子E2p45相关因子2（Nrf2）核转位对永生化黑素细胞株B10BR细胞生物学活性的影响。方法 构建电转染野生型和nls缺失型nrf2质粒载体至B10BR细胞,结合叔丁基氢醌（TBHQ）和（或）H2O2处理,Western印迹检测Nrf2,his标签蛋白表达,MTT法测定细胞活性,多巴氧化法检测酪氨酸酶活性,Transwell法测定转染细胞的迁移。结果 TBHQ处理的转染组细胞核中Nrf2表达均显著高于TBHQ未处理组（P < 0.01）。转染质粒组间及其与未处理组间细胞酪氨酸酶活性差异均无统计学意义（P > 0.05）,H2O2处理使2个质粒转染组酪氨酸酶活性较单独质粒转染组显著下降（pcDNA-nrf2,P < 0.05;pcDNA-nrf2?驻nls,P < 0.05）。相对于TBHQ未添加H2O2处理的nrf2组,TBHQ显著增强H2O2处理的野生型nrf2质粒转染细胞酪氨酸酶活性（P < 0.05）;相对于TBHQ未添加H2O2处理的nls组,nls缺失型nrf2质粒转染组细胞酪氨酸酶活性差异无统计学意义（P > 0.05）。相对于nrf2未转染组,H2O2对野生型nrf2质粒转染组细胞活性的影响无统计学意义（P > 0.05）;相对于两组的未处理组,H2O2引起未转染组及nls缺失型质粒转染组细胞活性显著下降（未处理组,P < 0.05;pcDNA-nrf2?驻nls,P < 0.01）。TBHQ可以保护野生型nrf2质粒转染细胞免受H2O2引起的氧化损伤,对nls缺失型质粒转染组细胞无明显保护作用。各处理组黑素细胞迁移差异无统计学意义（P > 0.05）。结论 Nrf2核转位异常影响黑素细胞的抗氧化能力、黑素细胞活性及酪氨酸酶活性。TBHQ可以激活野生型Nrf2在细胞核中表达水平,增强酪氨酸酶和黑素细胞活性,进而提高细胞的抗氧化水平。 【关键词】 黑素细胞; 核因子E2p45相关因子2; 核转位; 一元酚单氧酶     

马尾松针提取物通过核因子E2相关因子2-抗氧化反应元件通路对人毛乳头细胞氧化应激损伤保护作用的研究

【摘要】 目的 探讨马尾松针提取物（PMNE）对人毛乳头细胞（HDPC）抗氧化应激的保护作用及机制。方法 以HDPC为研究对象,分别采用0（对照组）、0.1、0.2、0.4、0.8、1.0 mmol/L H2O2处理HDPC,建立体外HDPC氧化应激的最佳条件;在HDPC中转染核因子E2相关因子2（Nrf2）干扰片段siRNA1、siRNA2、siRNA3或过表达质粒pCMV6-XL5-Nrf2,实时荧光定量PCR和Western印迹法分别检测Nrf2 mRNA及蛋白的表达;H2O2条件下检测转染后各组细胞活性及凋亡率。常规培养HDPC并分组处理,对照组：正常培养,不予其他处理;双氢睾酮组：加入0.03 μg/ml双氢睾酮;原花青素组：加入0.03 μg/ml双氢睾酮和6.00 μg/ml原花青素B2处理;不同浓度PMNE组：加入0.03 μg/ml双氢睾酮培养液,同时分别给予1、5、25、100 μg/ml PMNE处理;分别检测各组细胞活性及凋亡率、细胞内活性氧（ROS）相对荧光强度和丙二醛（MDA）含量,Nrf2、醌氧化还原酶1（NQO1）、血红素加氧酶1（HO-1）、Kelch样ECH相关蛋白1（Keap1）、转化生长因子（TGF）-β1、Sma和Mad相关蛋白2/3（Smad2/3）、p-Smad2/3的表达水平。多组间比较采用单因素方差分析,组间两两比较采用LSD-t检验。结果 HDPC细胞活力为75% ~ 85%时,选择0.4 mmol/L H2O2作为体外HDPC氧化应激最适处理浓度。Nrf2-siRNA1、Nrf2-siRNA2、Nrf2-siRNA3组Nrf2 mRNA和蛋白表达均显著低于空白组和对照组（均P < 0.05）,细胞凋亡率（12.50% ± 0.05%、26.07% ± 0.05%、58.44% ± 1.03%）均显著高于空白组（10.38% ± 0.64%）和对照组（13.05% ± 0.12%）,均P < 0.05。Nrf2-siRNA2组的Nrf2蛋白表达量最低,选择Nrf2-siRNA2为最佳干扰片段进行后续实验。Nrf2过表达组Nrf2 mRNA和蛋白表达均显著高于空白组和对照组（均P < 0.05）,其细胞凋亡率明显低于空白组和对照组（均P < 0.05）。0.4 mmol/L H2O2处理条件下,Nrf2过表达组细胞凋亡率显著低于过表达空载组（t = 3.66,P < 0.001）,细胞活性高于过表达空载组（t = 40.40,P < 0.001）;Nrf2-siRNA2组细胞凋亡率显著高于对照组（t = 13.13,P < 0.001）,而细胞活性显著低于对照组（t = 67.37,P < 0.001）。PMNE处理实验中,原花青素组和不同浓度PMNE组细胞活性均显著高于双氢睾酮组（均P < 0.01）,而细胞凋亡率显著低于双氢睾酮组（均P < 0.01）;原花青素和不同浓度PMNE均能显著抑制双氢睾酮诱导的HDPC细胞内ROS和MDA的过度表达（均P < 0.01）;原花青素组和5、25、100 μg/ml PMNE组Nrf2、NQO1、HO-1蛋白表达显著高于双氢睾酮组（均P < 0.05）,原花青素组和25、100 μg/ml PMNE组Keap1、TGF-β1蛋白表达及Smad2/3磷酸化水平显著低于双氢睾酮组（均P < 0.05）。结论 Nrf2在抵抗HDPC的氧化应激损伤中起重要作用,PMNE可能通过激活Nrf2抗氧化反应元件通路而对HDPC产生明显的保护作用。     

靛蓝对脂多糖诱导的THP-1细胞的抗炎作用

目的 研究靛蓝(indigo, IDG)对脂多糖(lipopolysaccharide, LPS)致人巨噬细胞(THP-1来源)炎症损伤的影响。方法 建立LPS诱导THP-1细胞炎症损伤模型,分别用0.4、4、40μmol/L的靛蓝作用于THP-1细胞炎症损伤模型1 h,实时荧光定量PCR(qRT-PCR)法检测白介素(IL)-1β、IL-6、IL-8、IL-23p19和肿瘤坏死因子(tumor necrosis factor, TNF)-α的mRNA表达的变化;ELISA实验检测细胞培养上清中IL-1β、IL-6、IL-8、IL-23p19和TNF-α的含量差异。Western blot实验检测核因子E2相关因子2(nuclear factor E2-related factor 2, Nrf2)和血红素氧合酶1(heme oxygenase-1, HO-1)蛋白水平的影响。结果 与模型组比较,靛蓝能够显著抑制LPS诱导的细胞IL-1β、IL-6、IL-8、IL-23p19和TNF-α的转录水平(P<0.05)以及细胞培养上清中IL-1β、IL-6、IL-8、IL-23p19和...     

异鼠李素对H2O2诱导的HaCaT细胞线粒体结构及功能损伤的保护作用研究

目的探究异鼠李素对氧化应激状态下HaCaT细胞线粒体结构及功能的保护作用。方法以HaCaT细胞为研究对象, 实验分为4组:对照组(常规培养HaCaT细胞)、异鼠李素组(仅加入60 μmol/L异鼠李素处理)、H2O2组(仅加入600 μmol/L H2O2处理)、异鼠李素+ H2O2组(加入60 μmol/L异鼠李素预处理12 h后换液加入600 μmol/L H2O2处理12 h)。采用流式细胞仪检测细胞活性氧(ROS)水平, 电镜观察线粒体超微结构, 共聚焦荧光显微镜观察线粒体膜电位, ATP检测试剂盒检测线粒体ATP含量, 实时荧光定量PCR(qRT-PCR)测定线粒体DNA拷贝数。多组间比较采用单因素方差分析, 组间两两比较采用LSD-t检验。结果 HaCaT细胞经H2O2处理后呈氧化应激状态, H2O2组细胞内ROS水平(10 725.0 ± 845.8)显著高于对照组(1 708.0 ± 69.4, t = 18.40, P<0.001), 线粒体膜电位荧光强度、ATP含量、线粒体DNA特征性基因ND-1表达量均显著低于对照组(t值分别为4.58、4.48、6.11,...     

紫外线对人皮肤成纤维细胞中Hrd1及Nrf2表达的影响

目的探讨紫外线(UV)照射对人皮肤成纤维细胞中羟甲基戊二酰辅酶A还原酶降解蛋白(Hrd)1及核因子E2相关因子(Nrf)2表达的影响及可能机制。方法共收集12份人皮肤组织标本,曝光及非曝光部位标本各6份,免疫组化检测2组Hrd1及Nrf2的表达。将体外培养人皮肤成纤维细胞分为对照组、UVA组、UVB组,照光后用Western blot法检测各组成纤维细胞中Hrd1及Nrf2的表达。应用Hrd1-siRNA转染体外培养人皮肤成纤维细胞,下调细胞中Hrd1的表达后,Western blot检测成纤维细胞Nrf2的表达。应用免疫荧光分析检测细胞中Hrd1与Nrf2在细胞中的共定位情况,应用免疫共沉淀检测体外培养人成纤维细胞中Hrd1与Nrf2是否存在内源性结合。结果临床标本实验中,曝光部位皮肤组织中Hrd1表达(0.4756±0.0785)明显高于避光部位(0.1270±0.0253,t=7.317,P<0.05),曝光部位皮肤组织中Nrf2表达(0.1190±0.0217)明显低于避光部位(0.2629±0.0263,t=7.306,P<0.05)。体外培养成纤维细胞实验中,经紫外线照射后,UVA组与对照组相比,Hrd1蛋白表达水平明显增高(t=7.227,P<0.05),Nrf2蛋白表达水平明显下降(t=6.456,P<0.05);同样,UVB组与对照组相比,Hrd1蛋白表达水平明显增高(t=2.980,P<0.05),Nrf2蛋白表达水平明显下降(t=13.52,P<0.05)。应用Hrd1-SiRNA下调体外培养人纤维细胞中Hrd1的表达后,无论是经UVA照射还是UVB照射,被下调Hrd1组细胞内Nrf2的表达较未下调组明显升高。免疫荧光分析结果显示Hrd1与Nrf2在体外培养人皮肤成纤维细胞中的均有表达,并且在细胞中存在Hrd1与Nrf2共定位。免疫共沉淀验证了Hrd1与Nrf2在体外培养人皮肤成纤维细胞中存在内源性结合。结论Hrd1与Nrf2在人皮肤成纤维细胞中存在结合,紫外线照射可通过增加细胞中Hrd1的表达从而抑制Nrf2的表达。     

miRNA-193b-5p抑制转录调节因子CITED2表达对黑素合成的影响

目的初步探讨miRNA(miR)-193b-5p对黑素合成的影响及可能机制。方法从健康男性包皮环切术后废弃的正常包皮组织中分离培养人原代黑素细胞。分别转染miR-NC模拟物(miR-NC mimics组)和miR-193b-5p模拟物(miR-193b-5p mimics组)至人原代黑素细胞及人黑素瘤MNT1细胞, 转染48 h时实时定量PCR(RT-qPCR)检测miR-193b-5p的过表达效率, 转染72 h时Western印迹检测黑素合成相关蛋白酪氨酸酶和小眼畸形相关转录因子的表达, 转染1周时采用氢氧化钠法测定细胞中黑素含量。通过TargetScan网站预测miR-193b-5p的靶基因并采用双荧光素酶报告实验验证, RT-qPCR及Western印迹检测miR-193b-5p过表达后该靶基因mRNA和蛋白表达水平的变化。两组间比较采用两独立样本t检验。结果人原代黑素细胞及人黑素瘤MNT1细胞中, miR-193b-5p mimics组miR-193b-5p的表达水平均显著高于miR-NC mimics组, t值分别为65.57、22.49, 均P < 0.001, 且...     

Brahma相关基因1与激活转录因子2相互作用对皮肤鳞状细胞癌细胞增殖、迁移和侵袭能力的影响

目的探讨Brahma相关基因1(BRG1)在皮肤鳞状细胞癌(cSCC)组织及细胞中的表达,及其与激活转录因子2(ATF2)相互作用调控cSCC细胞增殖、迁移、侵袭的分子机制。方法收集2015—2021年南通大学第二附属医院皮肤科经病理确诊为日光性角化病(AK)、cSCC(含原位鳞癌)患者的石蜡组织标本分别66例和80例,同时收集皮肤美容手术修整下的正常皮肤组织石蜡标本35例作为正常对照组。采用免疫组化染色法检测BRG1在cSCC、AK及正常皮肤组织中的表达,分析BRG1表达与cSCC患者临床病理参数之间的相关性。收集cSCC患者和健康对照新鲜组织标本各12例,常规培养cSCC细胞株A431和Scl-1及人永生化角质形成细胞株HaCaT,实时荧光定量PCR(qRT-PCR)检测组织及细胞中BRG1 mRNA的表达,通过免疫共沉淀和细胞免疫荧光染色分析BRG1与ATF2的相互作用。通过RNA干扰法敲低A431、Scl-1细胞中BRG1(BRG1 siRNA1~5组)和ATF2表达(ATF2-shRNA组),并分别转染阴性对照siRNA或shNC作为对照(control siRNA组、shNC组),采用细胞计数(CCK8)实验、克隆形成实验、细胞划痕实验和Transwell实验分别检测敲低BRG1、ATF2对cSCC细胞增殖、迁移及侵袭的影响。多组间计量资料的比较采用单因素方差分析,两两多重比较采用Dunnett-t检验。结果免疫组化染色显示,BRG1蛋白在cSCC、AK组织中的表达强度显著低于正常皮肤组织(χ^(2)=44.40,P<0.001)。qRT-PCR显示,cSCC组织中BRG1 mRNA表达水平(1.345±0.956)显著低于正常皮肤组织(2.499±1.501,t=2.25,P=0.035),A431、Scl-1细胞中BRG1 mRNA表达水平(0.041±0.002、0.026±0.003)亦显著低于HaCaT细胞(0.135±0.033,t=4.95、5.73,P=0.008、0.005)。BRG1的低表达与cSCC患者癌组织位于曝光部位(P=0.041)、肿瘤低分化程度(P=0.001)、Broder高分级(P<0.001)有关。BRG1 siRNA1组和BRG1 siRNA2组A431、Scl-1细胞克隆形成数、迁移细胞数、侵袭细胞数及细胞迁移率均显著高于control siRNA组(均P<0.05)。免疫共沉淀实验表明,在A431、Scl-1细胞中BRG1蛋白与ATF2蛋白能相互结合,免疫荧光法显示二者存在共定位;与control siRNA组相比,A431(BRG1 siRNA1、2组)和Scl-1细胞(BRG1 siRNA1组)中敲低BRG1表达可促进ATF2磷酸化激活(均P<0.05);与shNC组相比,shATF2组A431、Scl-1细胞克隆形成数(均P=0.001)、24~96 h细胞增殖活性(均P<0.001)、迁移细胞数及侵袭细胞数均显著降低(均P≤0.001)。结论BRG1在cSCC及AK组织中低表达,且BRG1可抑制cSCC细胞增殖、迁移及侵袭;ATF2促进cSCC细胞增殖、迁移及侵袭;BRG1可能通过与ATF2蛋白相互作用并抑制ATF2磷酸化激活,从而发挥抑癌作用。